專利名稱:一種鐵皮石斛種苗高效快繁方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域：
，具體是一種鐵皮石斛種苗高效快繁方法，該方法通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行鐵皮石斛種苗高效快繁。
背景技術(shù)：
鐵皮石斛，民間俗稱“藥中黃金”，是一種附生、多年生的草本植物，開花多，平均自然結(jié)實(shí)率僅為0.31%，且種子萌發(fā)率很低，因而種子資源有限。自秦漢的《神農(nóng)本草經(jīng)》將鐵皮石斛入列為上品，后續(xù)的《本草綱目》、《道藏》等陸續(xù)有相關(guān)記載，并將其列為中華九大仙草之首。2010年版《中華人民共和國藥典》將鐵皮石斛單列出來，據(jù)記載，其主要成分為多糖、石斛堿、氨基酸和微量元素等，具有增強(qiáng)免疫功能、抗腫瘤、抗衰老和抑制血栓形成等多種功效?，F(xiàn)已制成多種中成藥，著名的有心血管藥“脈絡(luò)寧”，眼科藥“石斛夜光丸”以及咽喉疾病用的“慢咽寧”等。目前，鐵皮石斛的鮮條年產(chǎn)量還未達(dá)200噸，需求量卻達(dá)3萬噸/年，使得野生資源進(jìn)一步枯竭，成為瀕危、珍稀、高附加值的資源性藥材，其種植生產(chǎn)有很大的利潤空間。
目前，鐵皮石斛種苗主 要通過種子人工栽培、扦插繁殖、器官再生、經(jīng)愈傷組織的間接體胚再生及直接體胚再生等方式獲取。專利文獻(xiàn)CN102440130A所公開的發(fā)明創(chuàng)造，選取成熟自然開裂果實(shí)為外植體，以木屑、碎樹皮、珍珠巖為基質(zhì)，噴霧供給種胚萌發(fā)所需營養(yǎng)元素，通過種子自然繁殖來生產(chǎn)石斛種苗，石斛種子的萌發(fā)率可達(dá)75%左右。CN102499085A、CN102422811A、CN101803515A，以及 CN101461328B、CN101933456B、CN1324946C的專利文獻(xiàn)所公開的發(fā)明創(chuàng)造均以鐵皮石斛蒴果為外植體，通過蒴果一原球莖一小苗一成苗的路線獲取鐵皮石斛種苗，此路線獲得株高5cm以上的種苗，育苗周期最少需要5個(gè)月，最長達(dá)14個(gè)月，且此法增殖系數(shù)最高為10。CN101336589A及金銀兵(中國農(nóng)學(xué)通報(bào).2009，25 (12):50-52)以扦插的方式進(jìn)行鐵皮石斛種苗繁殖，分別通過1%。高錳酸鉀及6-BA溶液處理，相應(yīng)誘導(dǎo)生根及長芽，前者生根率達(dá)92 %，后者側(cè)芽誘導(dǎo)率最高78 %，前者一個(gè)分支誘導(dǎo)成一株苗，后者增殖系數(shù)最大為2.58，兩者育苗周期為3 4個(gè)月。朱恩燦(公開號 CN102369881A)、劉星華(公告號 CN101548644B)，YIH-JUH SHIAU 等(InVitro Cell.Dev.Biol._Plant2005,41:666-670)、Zhao等(Plant Cell Tiss Organ Cult,2007,90:131-139)以及劉健等(寧波農(nóng)業(yè)科技，2012，1: 14-16)以腋芽為外植體，通過器官再生的方式進(jìn)行鐵皮石斛種苗的繁殖，育苗周期4 8個(gè)月，幼苗再生率最高達(dá)78%，增殖系數(shù)最高達(dá)24.5。蔣武軒(公開號CN101653096A)、田芳(申請?zhí)朇N102499092A)、滕正平(公開號 CNlO23I856IA)以及 Zhao 等(In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant, 2008,44:178-185)以鐵皮石斛種子、植株等為外植體，經(jīng)由愈傷組織的間接體胚再生的方式進(jìn)行鐵皮石斛種苗繁殖，育苗周期6 11個(gè)月，愈傷組織的誘導(dǎo)率最高可達(dá)82%，增殖系數(shù)最高達(dá)50?？紫楝?公告號CN101258835B)、蘇有勇(公開號CN101180949A)以及王小霞(公開號CN101273709A)分別選取未展葉芽、莖芽、莖尖為外植體，經(jīng)表面消毒后誘導(dǎo)擬原球莖，以直接體胚再生的方式繁殖鐵皮石斛種苗，育苗周期6 7個(gè)月。張世定(公開號CN102282998A)、李躍宇(公告號CN102138415B)、趙興兵(公告號CN102124936B)、李明焱(CN101352140B)以及滕士元(公告號CN101347101B)從煉苗大棚的設(shè)計(jì)、出瓶前管理、出瓶后處理、移栽基質(zhì)選擇等方面對鐵皮石斛煉苗移栽進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。分別采用松樹皮、苔蘚+木屑混合物、砂礫巖+木炭+碎紅磚+樹皮/葉混合物、松木鋸木+松木屑+泥炭+松木樹皮混合物作為煉苗栽培基質(zhì)，并輔以調(diào)整光照來使幼苗逐漸適應(yīng)外部環(huán)境，移栽成活率達(dá)到95%以上。以上文獻(xiàn)及專利的研究，為鐵皮石斛規(guī)?；N植，緩解資源供應(yīng)壓力奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，但在鐵皮石斛大規(guī)模種植時(shí)，仍存在不足:以種子為外植體，其種質(zhì)來源受限、種苗周期與繁殖系數(shù)未能同時(shí)達(dá)到較好的效果；以腋芽為外植體的器官再生方式，其育苗周期較短，但增殖系數(shù)不高，且需要大量的外植體材料；現(xiàn)有的以莖芽及頂芽為外植體的體胚再生方式，雖然縮短了育苗周期，但最短也需要160天；另外，上述報(bào)道中根的誘導(dǎo)效率不高，只有2 5條/株，不利于移栽。目前市場存在巨大的供需缺口，因而亟需一種短時(shí)間內(nèi)高效快繁出大批量鐵皮石斛種苗的新方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種鐵皮石斛種苗高效快繁方法，可以在相對短時(shí)間內(nèi)高效擴(kuò)繁出大批量石斛種苗。
本發(fā)明提供的一種鐵皮石斛種苗快繁方法，主要包括以下步驟:
(I)擬原球莖誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)
選取鐵皮石斛的莖尖或無菌幼苗接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:(1/4 1)MS培養(yǎng)基+蔗糖20g/L 30g/L+瓊脂8g/L 12g/L+TDZ (苯基噻二唑脲)0.5mg/L 4mg/L+NAA (萘乙酸)0.5mg/L 4mg/L+2,4-D (2,4- 二氯苯氧乙酸)0.5mg/L 2mg/L,進(jìn)行擬原球莖的誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)，得到擬原球莖；
(2)擬原球莖分化培養(yǎng)
將上步培養(yǎng)所得擬原球莖轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基為:MS培養(yǎng)基+蔗糖20g/L 30g/L+ 瓊脂 8g/L 12g/L+NAA0.25mg/L 2mg/L+6_BA (6-節(jié)基腺嘿呤)2mg/L 10mg/L，進(jìn)行分化成苗培養(yǎng)，得到叢生幼苗；
(3)叢生幼苗的生根壯苗
將上步中分化培養(yǎng)的叢生幼苗分株接種于生根壯苗培養(yǎng)基，生根壯苗培養(yǎng)基為:(1/4 3/4)MS 培養(yǎng)基 + 鹿糖 20g/L 30g/L+ 瓊脂 8g/L 12g/L+6_BA0.5mg/L 3mg/L+NAA0.25mg/L 4mg/L+IBA(卩引噪丁酸)3mg/L 6mg/L+ 土 提取物 100g/L 400g/L+活性碳2g/L 5g/L，進(jìn)行生根壯苗；
⑷煉苗移栽
自然光下煉苗，洗凈培養(yǎng)基，移栽于水苔、松樹皮、蛭石混合的基質(zhì)上，維持基質(zhì)含水量為50% 70%及空氣濕度為40% 70%，室內(nèi)溫度控制在25°C ±3°C，保持通風(fēng)透氣。
作為上述技術(shù)方案的改進(jìn)，所述擬原球莖誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)、擬原球莖分化培養(yǎng)、叢生幼苗的生根壯苗的培養(yǎng)條件均為:培養(yǎng)溫度25°C ±3°C，光照培養(yǎng)時(shí)間8小時(shí)/天 16小時(shí)/天，光照強(qiáng)度:15001x 30001x，空氣濕度60% 80%，pH值為5.5 6.0。
作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的莖尖或無菌幼苗高為0.5cm 1.5cm ;所述的擬原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)周期為10天 15天；所述的擬原球莖增殖培養(yǎng)周期為25 35天；所述的擬原球莖分化培養(yǎng)的培養(yǎng)周期為25天 30天；所述生根壯苗的培養(yǎng)周期為40天 50天。
作為上述技術(shù)方案的更進(jìn)一步改進(jìn)，步驟(4)中，所述煉苗移栽，煉苗7天 10天，以噴霧處理維持空氣濕度及含水量，所述栽培基質(zhì)中松樹皮長寬在0.5cm 4cm，蛭石粒徑為小于等于4mm,基質(zhì)分三層,底層為Icm 3cm厚的水苔，中間為松樹皮與蛭石按體積比2:1 4:1的比例混合,頂層為3cm 5cm厚的水苔。
本發(fā)明是一種利用擬原球莖再生途徑高效快繁繁殖鐵皮石斛種苗的方法的快繁方法。該方法是以鐵皮石斛莖尖或無菌幼苗為外植體，組培過程中，通過采用高效激素組合、添加有機(jī)提取物、優(yōu)化培養(yǎng)條件等措施，達(dá)到縮短種苗周期、提高繁殖系數(shù)、種質(zhì)來源不受局限、快速生產(chǎn)大批量的種苗 的目標(biāo)。本發(fā)明所提供的方法具有外植體來源廣泛，增殖系數(shù)可以高達(dá)50株/0.1g擬原球莖，獲取種苗周期短，種苗整齊，生根率可以達(dá)到100%，且根長5cm以上且根數(shù)多達(dá)10條以上，移栽成活率最高可以達(dá)到99%以上等優(yōu)點(diǎn)，可快速生產(chǎn)大批量的種苗，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步說明。在此需要說明的是，對于這些實(shí)施方式的說明用于幫助理解本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。此外，下面所描述的本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。
實(shí)施例1:
選取0.5cm 1.5cm高的鐵皮石斛芽尖，接種于擬原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基:1/2MS+蔗糖 30g/L+瓊脂 10g/L+TDZ0.5mg/L+NAAlmg/L+2,4-D0.5mg/L,培養(yǎng) 12 天可見擬原球莖形成，發(fā)生率達(dá)92%，將原球莖接種于原誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，繼代周期30天。
將增殖培養(yǎng)后的擬原球莖接種于擬原球莖分化培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基+蔗糖20g/L+瓊脂10g/L+NAA2mg/L+6-BA10mg/L,經(jīng)28天可以分化成Icm 2cm的叢芽簇，平均45個(gè)芽/0.1g擬原球莖。
將分化所得叢芽簇分成I 2個(gè)芽/株，接種至生根壯苗培養(yǎng)基；1/2MS培養(yǎng)基+蔗糖 20g/L+ 瓊脂 10g/L+6-BAlmg/L+NAAlmg/L+IBA6mg/L+ 土豆提取物 200g/L+2g/L 活性碳，培養(yǎng)50天，生根率100%，植株平均株高7.8cm，平均根數(shù)13.8條，平均根長5.6cm。
總計(jì)約123天可獲得株高5cm以上的優(yōu)質(zhì)種苗。
將壯苗培養(yǎng)所得瓶苗室內(nèi)開蓋煉苗7天，后取出洗凈根部培養(yǎng)基，移入預(yù)先浸濕的栽培基質(zhì):水苔薄層(底層2cm) +松樹皮蛭石混合物(體積比2: I) +水苔薄層(頂層3cm),松樹皮長寬在0.5cm 4cm,蛭石粒徑為小于等于4mm,維持基質(zhì)含水量50% 70%,噴霧維持空氣濕度為40 % 70 %，保持室內(nèi)通風(fēng)，移栽成活率可達(dá)98 %以上。
上述無菌培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基pH值5.8，培養(yǎng)溫度25°C ±3°C，光照30001x，空氣濕度設(shè)定65% (實(shí)際65% ±5%)，光照10小時(shí)/天，土豆提取物通過土豆條清水煮沸30min過濾制得。
上述移栽時(shí)期，栽培室內(nèi)溫度維持在25°C ±3°C，栽培室選取向陰面位置，噴霧I 2次/天。[0027]實(shí)施例2:
選取0.5cm 1.0cm高的鐵皮石斛苗莖尖或無菌幼苗，接種于擬原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 12g/L+TDZlmg/L+NAA4mg/L+2，4-D0.5mg/L,培養(yǎng) 10 天可見擬原球莖形成，發(fā)生率達(dá)98%，將原球莖接種于原誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，繼代周期30天。
將增殖培養(yǎng)后的擬原球莖接種于擬原球莖分化培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L+NAA0.5mg/L+6-BA4mg/L,經(jīng)30天可以分化成Icm 2cm的叢芽簇，約50個(gè)芽//0.1g擬原球莖。
將分化所得叢芽簇分成I 2個(gè)芽/株，接種至生根壯苗培養(yǎng)基；3/4MS培養(yǎng)基+蔗糖 25g/L+ 瓊脂 12g/L+6-BA0.5mg/L+NAAlmg/L+IBA3mg/L+ 土豆提取物 100g/L+3g/L 活性碳，培養(yǎng)40天，生根率100%，植株平均株高5.5cm，平均根數(shù)10.2條，平均根長5.3cm。
總計(jì)115天可獲得株高5cm以上的優(yōu)質(zhì)種苗。
將壯苗培養(yǎng)所得瓶苗室內(nèi)開蓋煉苗8天，后取出洗凈根部培養(yǎng)基，移入預(yù)先浸濕的栽培基質(zhì):水苔薄層(底層3cm) +松樹皮蛭石混合物(體積比3: I) +水苔薄層(頂層4cm),松樹皮長寬在0.5cm 4cm,蛭石粒徑為小于等于4mm,維持基質(zhì)含水量50% 70%,噴霧維持空氣濕度為40 % 70 %，保持室內(nèi)通風(fēng)，移栽成活率可達(dá)99 %以上。
上述無菌培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基pH值6.0,培養(yǎng)溫度25°C ±3°C，光照30001x，空氣濕度設(shè)定65% (實(shí)際65% ±5% )，光照8小時(shí)/天，土豆提取物通過土豆條清水煮沸30min過濾制得。
上述移栽時(shí)期，栽培室內(nèi)溫度維持在25°C ±3°C，栽培室選取向陰面位置，噴霧I 2次/天。
實(shí)施例3:
選取0.5cm 1.5cm高的鐵皮石斛莖尖或無菌幼苗，接種于擬原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基:1/4MS+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 8g/L+TDZlmg/L+NAAlmg/L+2，4-Dlmg/L，培養(yǎng) 12 天可見擬原球莖形成，發(fā)生率達(dá)96%，將原球莖接種于原誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，繼代周期30天。
將增殖培養(yǎng)后的擬原球莖接種于擬原球莖分化培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基+蔗糖30g/L+瓊脂12g/L+NAAlmg/L+6-BA5mg/L,經(jīng)25天可以分化成Icm 2cm的叢芽簇，約40個(gè)芽//0.1g擬原球莖。
將分化所得叢芽簇分成I 2個(gè)芽/株，接種至生根壯苗培養(yǎng)基；1/4MS培養(yǎng)基+鹿糖 20g/L+ 瓊脂 8g/L+6-BA3mg/L+NAA2mg/L+IBA3mg/L+ 土豆提取物 100g/L+4g/L 活性碳，培養(yǎng)45天，生根率100 %，植株平均株高6cm，平均根數(shù)8.4條，平均根長4.3cm。
總計(jì)112天可以犾得株聞6cm左右的優(yōu)質(zhì)種苗。
將壯苗培養(yǎng)所得瓶苗室內(nèi)開蓋煉苗7天，后取出洗凈根部培養(yǎng)基，移入預(yù)先浸濕的栽培基質(zhì):水苔薄層(底層2cm) +松樹皮蛭石混合物(體積比3: I) +水苔薄層(頂層5cm),松樹皮長寬在0.5cm 4cm,蛭石粒徑為小于等于4mm,維持基質(zhì)含水量50% 70%,噴霧維持空氣濕度為40 % 70 %，保持室內(nèi)通風(fēng)，移栽成活率可達(dá)95 %以上。
上述無菌培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基pH值5.5，培養(yǎng)溫度25°C ±3°C，光照15001x，空氣濕度設(shè)定70% (實(shí)際70% ±5%)，光照12小時(shí)/天，土豆提取物通過土豆條清水煮沸30min過濾制得。
上述移栽時(shí)期，栽培室內(nèi)溫度維持在25°C ±3°C，栽培室選取向陰面位置，噴霧I 2次/天。
實(shí)施例4:
選取0.5cm 1.0cm高的鐵皮石斛莖尖或無菌幼苗，接種于擬原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基:1/4MS+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 10g/L+TDZ2mg/L+NAA0.5mg/L+2,4-Dlmg/L,培養(yǎng) 10 天可見擬原球莖形成，發(fā)生率達(dá)96%，將原球莖接種于原誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，繼代周期30天。
將增殖培養(yǎng)后的擬原球莖接種于擬原球莖分化培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基+鹿糖25g/L+瓊脂8g/L+NAA0.25mg/L+6-BA2mg/L,經(jīng)30天可以分化成Icm 2cm的叢芽簇，約45個(gè)芽//0.1g擬原球莖。
將分化所得叢芽簇分成I 2個(gè)芽/株，接種至生根壯苗培養(yǎng)基；1/2MS培養(yǎng)基+蔗糖 20g/L+ 瓊脂 10g/L+6-BA0.5mg/L+NAA4mg/L+IBA3mg/L+ 土豆提取物 100g/L+3g/L 活性碳，培養(yǎng)45天，生根率100%，植株平均株高5.7cm，平均根數(shù)11.8條，平均根長5.4cm。
總計(jì)115天，可獲得株高5cm以上的優(yōu)質(zhì)種苗。
將壯苗培養(yǎng)所得瓶苗室內(nèi)開蓋煉苗10天，后取出洗凈根部培養(yǎng)基，移入預(yù)先浸濕的栽培基質(zhì):水苔薄層(底層Icm) +松樹皮蛭石混合物(體積比2: I) +水苔薄層(頂層5cm),松樹皮長寬在0.5cm 4cm,蛭石粒徑為小于等于4mm,維持基質(zhì)含水量50% 70%,噴霧維持空氣濕度為40% 70%，保持室內(nèi)通風(fēng)，移栽成活率可達(dá)95%以上。
上述無菌培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基pH值5.5，培養(yǎng)溫度25°C ±3°C，光照15001x，空氣濕度設(shè)定75% (實(shí)際75% ±5%)，光照16小時(shí)/天，土豆提取物通過土豆條清水煮沸30min過濾制得。
上述移栽 時(shí)期，栽培室內(nèi)溫度維持在25°C ±3°C，栽培室選取向陰面位置，噴霧I 2次/天。
實(shí)施例5:
選取0.5cm 1.0cm高的鐵皮石斛莖尖或無菌幼苗，接種于擬原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基:1/4MS+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 8g/L+TDZ2mg/L+NAA2mg/L+2，4-D2mg/L，培養(yǎng) 15 天可見擬原球莖形成，發(fā)生率達(dá)80%，將原球莖接種于原誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，繼代周期35天。
將增殖培養(yǎng)后的擬原球莖接種于擬原球莖分化培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基+蔗糖30g/L+瓊脂12g/L+NAA0.5mg/L+6-BA3mg/L,經(jīng)30天可以分化成Icm 2cm的叢芽簇，約48個(gè)芽//0.1g擬原球莖。
將分化所得叢芽簇分成I 2個(gè)芽/株，接種至生根壯苗培養(yǎng)基；3/4MS培養(yǎng)基+蔗糖 30g/L+ 瓊脂 12g/L+6-BA2mg/L+NAA0.25mg/L+IBA6mg/L+ 土豆提取物 200g/L+5g/L 活性碳，培養(yǎng)50天，生根率100%，植株平均株高7.3cm，平均根數(shù)9.8條，平均根長6.4cm。
總計(jì)120天可獲得株高5cm以上的優(yōu)質(zhì)種苗。
將壯苗培養(yǎng)所得瓶苗室內(nèi)開蓋煉苗8天，后取出洗凈根部培養(yǎng)基，移入預(yù)先浸濕的栽培基質(zhì):水苔薄層(底層2cm) +松樹皮蛭石混合物(體積比4: I) +水苔薄層(頂層4cm),松樹皮長寬在0.5cm 4cm,蛭石粒徑為小于等于4mm,維持基質(zhì)含水量50% 70%,噴霧維持空氣濕度為40 % 70 %，保持室內(nèi)通風(fēng)，移栽成活率可達(dá)95 %以上。
上述無菌培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基pH值5.8，培養(yǎng)溫度25°C ±3°C，光照30001x，空氣濕度設(shè)定70% (實(shí)際70% ±5%)，光照10小時(shí)/天，土豆提取物通過土豆條清水煮沸30min過濾制得。[0058]上述移栽時(shí)期，栽培室內(nèi)溫度維持在25°C ±3°C，栽培室選取向陰面位置，噴霧I 2次/天。
實(shí)施例6:
選取0.5cm 1.5cm高的鐵皮石斛莖尖或無菌幼苗，接種于擬原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS+ 蔗糖 25g/L+ 瓊脂 10g/L+TDZ2mg/L+NAA2mg/L+2，4-Dl.0mg/L,培養(yǎng) 12 天可見擬原球莖形成，發(fā)生率達(dá)90%，將原球莖接種于原誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，繼代周期30天。
將增殖培養(yǎng)后的擬原球莖接種于擬原球莖分化培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基+鹿糖30g/L+瓊脂10g/L+NAAlmg/L+6-BA3mg/L,經(jīng)28天可以分化成Icm 2cm的叢芽簇，約45個(gè)芽//0.1g擬原球莖。
將分化所得叢芽簇分成I 2個(gè)芽/株，接種至生根壯苗培養(yǎng)基；1/4MS培養(yǎng)基+蔗糖 20g/L+ 瓊脂 10g/L+6-BA2mg/L+NAA0.25mg/L+IBA5mg/L+ 土豆提取物 200g/L+5g/L 活性碳，培養(yǎng)50天，生根率100%，植株平均株高7.5cm，平均根數(shù)11.3條，平均根長5.6cm。
總計(jì)118天可獲得株高5cm以上的優(yōu)質(zhì)種苗。
將壯苗培養(yǎng)所得瓶苗室內(nèi)開蓋煉苗9天，后取出洗凈根部培養(yǎng)基，移入預(yù)先浸濕的栽培基質(zhì):水苔薄層(底層3cm) +松樹皮蛭石混合物(體積比4: I) +水苔薄層(頂層3cm),松樹皮長寬在0.5cm 4cm,蛭石粒徑為小于等于4mm,維持基質(zhì)含水量50% 70%,噴霧維持空氣濕度為40 % 70 %，保持室內(nèi)通風(fēng)，移栽成活率可達(dá)95 %以上。
上述無菌培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基pH值5.8，培養(yǎng)溫度25°C ±3°C，光照30001x，空氣濕度設(shè)定70% (實(shí)際70% ±5%)，光照10小時(shí)/天，土豆提取物通過土豆條清水煮沸30min過濾制得。`
上述移栽時(shí)期，栽培室內(nèi)溫度維持在25°C ±3°C，栽培室選取向陰面位置，噴霧I 2次/天。
實(shí)施例7:
選取0.5cm 1.0cm高的鐵皮石斛莖尖或無菌幼苗，接種于擬原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 12g/L+TDZ4mg/L+NAAlmg/L+2，4-Dl.5mg/L,培養(yǎng) 15 天可見擬原球莖形成，發(fā)生率達(dá)85%，將原球莖接種于原誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，繼代周期30天。
經(jīng)增殖培養(yǎng)數(shù)代后，將擬原球莖接種于擬原球莖分化培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基+蔗糖25g/L+瓊脂10g/L+NAA0.5mg/L+6-BA5mg/L,經(jīng)30天可以分化成Icm 2cm的叢芽簇，約50個(gè)芽//0.1g擬原球莖。
將分化所得叢芽簇分成I 2個(gè)芽/株，接種至生根壯苗培養(yǎng)基；1/2MS培養(yǎng)基+鹿糖 25g/L+ 瓊脂 8g/L+6-BA2mg/L+NAAlmg/L+IBA6mg/L+ 土豆提取物 400g/L+5g/L 活性碳，培養(yǎng)50天，生根率100%，植株平均株高6.7cm，平均根數(shù)9.3條，平均根長5.2cm。
總計(jì)120天可獲得株高5cm以上的優(yōu)質(zhì)種苗。
將壯苗培養(yǎng)所得瓶苗室內(nèi)開蓋煉苗8天，后取出洗凈根部培養(yǎng)基，移入預(yù)先浸濕的栽培基質(zhì):水苔薄層(底層Icm) +松樹皮蛭石混合物(體積比3: I) +水苔薄層(頂層4cm),松樹皮長寬在0.5em 4cm,蛭石粒徑為小于等于4mm,維持基質(zhì)含水量50% 70%,噴霧維持空氣濕度為40 % 70 %，保持室內(nèi)通風(fēng)，移栽成活率可達(dá)95 %以上。
上述無菌培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基pH值5.5，培養(yǎng)溫度25°C ±3°C，光照15001x，空氣濕度設(shè)定75% (實(shí)際75% ±5%)，光照12小時(shí)/天，土豆提取物通過土豆條清水煮沸30min過濾制得。
上述移栽時(shí)期，栽培室內(nèi)溫度維持在25°C ±3°C，栽培室選取向陰面位置，噴霧1 2次/天。
本發(fā)明從外植體到供移栽幼苗只需4個(gè)月，縮短了育苗周期，擬原球莖成苗的增殖系數(shù)高達(dá)50株/0.1g擬原球莖，種苗生長整齊、健壯，葉色濃綠，根系發(fā)達(dá)，煉苗移栽方法簡單易行、適合大批量生產(chǎn)。
以上所述為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，但本發(fā)明不應(yīng)該局限于該實(shí)施例所公開的內(nèi)容。所以凡是不脫離本發(fā)·明所公開的精神下完成的等效或修改，都落入本發(fā)明保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種鐵皮石斛種苗快繁方法，其特征在于，它包括如下步驟: (1)擬原球莖誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng) 選取鐵皮石斛的莖尖或無菌幼苗接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:(1/4 1)MS培養(yǎng)基+鹿糖20g/L 30g/L+瓊脂8g/L 12g/L+TDZ(苯基噻二唑脲)0.5mg/L 4mg/L+NAA (萘乙酸)0.5mg/L 4mg/L+2,4-D (2,4- 二氯苯氧乙酸)0.5mg/L 2mg/L,進(jìn)行擬原球莖的誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)，得到擬原球莖； (2)擬原球莖分化培養(yǎng) 將上步培養(yǎng)所得擬原球莖轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基為:MS培養(yǎng)基+蔗糖20g/L 30g/L+瓊脂 8g/L 12g/L+NAA0.25mg/L 2mg/L+6_BA (6-節(jié)基腺嘿呤)2mg/L IOmg/L，進(jìn)行分化成苗培養(yǎng)，得到叢生幼苗； (3)叢生幼苗的生根壯苗 將上步中分化培養(yǎng)的叢生幼苗分株接種于生根壯苗培養(yǎng)基，生根壯苗培養(yǎng)基為:(1/4 3/4)MS 培養(yǎng)基 + 鹿糖 20g/L 30g/L+ 瓊脂 8g/L 12g/L+6_BA0.5mg/L 3mg/L+NAA0.25mg/L 4mg/L+IBA(卩引噪丁酸)3mg/L 6mg/L+ 土 提取物 100g/L 400g/L+活性碳2g/L 5g/L，進(jìn)行生根壯苗； (4)煉苗移栽 自然光下煉苗，洗凈培養(yǎng)基，移栽于水苔、松樹皮、蛭石混合的基質(zhì)上，維持基質(zhì)含水量為50% 70%及空氣濕度為40% 70%，室內(nèi)溫度控制在25°C ±3°C，保持通風(fēng)透氣。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述鐵皮石斛種苗快繁方法，其特征在于，所述擬原球莖誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)、擬原球莖分化培養(yǎng)、叢生幼苗的生根壯苗的培養(yǎng)條件均為:培養(yǎng)溫度25°C ±3°C，光照培養(yǎng)時(shí)間8小時(shí)/天 16小時(shí)/天，光照強(qiáng)度:15001x 30001x，空氣濕度60% 80%，pH 值為 5.5 6.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述鐵皮石斛種苗快繁方法，其特征在于，步驟(I)中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)周期為10天 15天。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述鐵皮石斛種苗快繁方法，其特征在于，步驟(I)中，所述增殖培養(yǎng)周期為25 35天。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述鐵皮石斛種苗快繁方法，其特征在于，步驟(2)中，所述分化培養(yǎng)的培養(yǎng)周期為25天 30天。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1至5所述鐵皮石斛種苗快繁方法，其特征在于，步驟(3)中，所述生根壯苗的培養(yǎng)周期為40天 50天。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1至5中任一所述鐵皮石斛種苗快繁方法，其特征在于，步驟(I)中，所述莖尖或無菌幼苗高為0.5cm 1.5cm。
8.根據(jù)權(quán)利要求
6中任一所述鐵皮石斛種苗快繁方法，其特征在于，步驟(I)中，所述莖尖或無菌幼苗高為0.5cm 1.5cm。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1至5中任一所述鐵皮石斛種苗快繁方法，其特征在于，步驟(4)中，所述煉苗移栽，煉苗7天 10天，以噴霧處理維持空氣濕度及含水量，所述栽培基質(zhì)中松樹皮長寬在0.5cm 4cm,蛭石粒徑為小于等于4mm,基質(zhì)分三層,底層為Icm 3cm厚的水苔，中間為松樹皮與蛭石按體積比2:1 4:1的比例混合,頂層為3cm 5cm厚的水苔。
10.根據(jù)權(quán)利要求
8中任一所述鐵皮石斛種苗快繁方法，其特征在于，步驟(4)中，所述煉苗移栽，煉苗7天 10天，以噴霧處理維持空氣濕度及含水量，所述栽培基質(zhì)中松樹皮長寬在0.5cm 4cm,蛭石粒徑為小于等于4mm,基質(zhì)分三層,底層為Icm 3cm厚的水苔，中間為松樹皮與蛭石 按體積比2:1 4:1的比例混合,頂層為3cm 5cm厚的水苔。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種鐵皮石斛種苗高效繁殖的方法。步驟包括a.選用鐵皮石斛莖尖或無菌幼苗為外植體，進(jìn)行擬原球莖的誘導(dǎo)及增殖培養(yǎng)；b.擬原球莖的分化成苗；c.叢生幼苗的生根壯苗培養(yǎng)；d.無菌苗的煉苗及移栽。本發(fā)明利用莖尖和無菌幼苗為外植體，避免了僅以莖芽及頂芽為外植體誘導(dǎo)擬原球莖，外植體來源受限的問題，可大量、快速、持續(xù)獲得成熟的擬原球莖，擬原球莖發(fā)生率最高達(dá)99％，幼苗分化系數(shù)高達(dá)50株/0.1g擬原球莖，獲取種苗周期僅需4個(gè)月，種苗整齊，生根率100％，根長5cm左右且根數(shù)多達(dá)10條/叢，移栽成活率可高達(dá)95％以上等優(yōu)點(diǎn)，達(dá)到縮短種苗周期、提高繁殖系數(shù)、種質(zhì)來源不受局限的目標(biāo)?？煽焖偕a(chǎn)大批量的種苗，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號A01H4/00GKCN103155871SQ201310071862
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月7日
發(fā)明者付春華, 王麗瓊, 余龍江, 董艷山 申請人:華中科技大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan