專利名稱：大量生產(chǎn)無(wú)類病毒和病毒馬鈴薯繁殖材料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)植物組織培養(yǎng)，大量繁殖無(wú)類病毒、無(wú)病毒馬鈴薯的方法。
馬鈴薯(solanumtuberosum)是一種基本食物。為了提高其繁殖力、抗病力以及對(duì)于環(huán)境的適應(yīng)力，曾做過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)和實(shí)際工作。盡管如此，但至今還沒(méi)有獲得抗各種重要病害，同時(shí)具有其它優(yōu)良特性的栽培品種。
盡管也能產(chǎn)生雙倍體和單倍體馬鈴薯品系(Houglas，R.W.，Ploquin，S.J.，GabertA.C.Effectofseedparentandpollinatoronfrequencyofhaploidsinsolanumtuberosum.Crop.Sci.4.593-595.(1964))，但是大多數(shù)的馬鈴薯栽培品種都可分為四倍體馬鈴薯亞種(Howard，H.W.Geneticsofthepotato(Solanumtuberosum)，LogosPress，London(1970)126.P.)。
一般認(rèn)為，為了得到最大繁殖力和生長(zhǎng)率，馬鈴薯一定是雜合體。然而，利用同系配合減少等位基因間的雜合體特性，馬鈴薯苗的生長(zhǎng)率卻明顯降低。
由于一些國(guó)家的生態(tài)條件，不能長(zhǎng)期保存無(wú)病害的不同馬鈴薯栽培品種。因此，改良的目標(biāo)就是利用野生的抗性品種作雜交材料，培殖出抗逆境，抗病原體的栽培品種。
但是，抗性的提高有限，因?yàn)閷?duì)于馬鈴薯來(lái)說(shuō)，所謂的“一步”傳統(tǒng)法不行(使用這種方法獲得新的所希望的特性也可通過(guò)保存其它有利特性產(chǎn)生)。
已經(jīng)研究出幾種方法，體外營(yíng)養(yǎng)繁殖馬鈴薯，如Roca，W.M.Esponoza，N.O.，Roca，M.R.、和Bryan，J.E.等的“迅速繁殖馬鈴薯的組織培養(yǎng)方法”(AmPotatoJ.55.691-701(1978));Goodwin，P.B.，Kim，Y.C.、Adisarwanto.T等的“利用莖尖培養(yǎng)繁殖馬鈴薯”(PotatoRes.23，9-23(1980));Roest.S.和Bokelmann的“用于馬鈴薯(Slanumtuberosum)的營(yíng)養(yǎng)繁殖和誘變育種的體外不定芽技術(shù)Ⅰ，通過(guò)形成不定枝在體外進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖”(Potato.Res.23.167-181(1980);Hussey.G和Stacey.N.J.的“馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)的體外繁殖”(Ann.Bot.48.787-796(1981);Henszky.L.E.、Enyingi.K和SzaboⅠ等的“馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)種質(zhì)的長(zhǎng)期保藏和繁殖的組織培養(yǎng)技術(shù)”(PlantCellCultureinCrop.ImprovementS.K.Sen，K.L.Gilesad.，PlenumPress，NewYork，London，(1983)9～18)。
這些方法基本上被推薦用來(lái)繁殖無(wú)病毒馬鈴薯品系。除了篩選外，還有另一種可供選擇的可能性，即分離病毒感染的植株的分生組織細(xì)胞，并進(jìn)行體外培養(yǎng)，生產(chǎn)無(wú)病毒品系(Morel，G.，MullerJ.F.Lacultureinvitroduméristémeapicaledelapommedeterre;Compt.REnd.258.5250-5252(1964);Mellor，R.C.Stace-Smith，RVirus-freepotatoesbytissueculture，“AppliedandFundamentalAspectsofPlantCell，TissueandOrganCulture”，edit.ReinertJ.andBajajY.P.S.，Springer-Verlag，Berlin-NewYork，(1977)615-637;Faccioli，G.;Rubies-Autonell，CPVXandPVYdistributioninPotatomeristem-tipsandtheireradicationbytheuseofthermotherapyandmeristem-tipculture，Phytopeth.Z.103，66-76(1982))。其原因是，由于某些生化過(guò)程的結(jié)果至今可以部分解釋植物的分生組織細(xì)胞無(wú)病毒感染。
通過(guò)分生組織培養(yǎng)除去病毒和在體外進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖是廣泛使用的保藏馬鈴薯種的普遍方法。體外生產(chǎn)小的馬鈴薯，即所謂馬鈴薯微塊莖，也是一種已知方法(AmericanPotatoJournal59.33-37.(1982))。
在體外產(chǎn)生的馬鈴薯小植株的進(jìn)一步栽培，可在暖房進(jìn)行。用繁殖無(wú)病毒的母株進(jìn)行單芽扦插也被廣泛使用(Sunarjono，H.，Krisnawati，Y.PotatoseedmultiplicationbystemcuttingI.Theinfluenceofthemotherplantageonthegrowthandyieldofthecutting.Bull.Penel，Hort.8(2)39-47(1980);Goodwin，P.B.，Brown，G.Fieldperformanceofpotatoshoot-tipsproliferatedinculture.PotatoRes.23，449-452(1980);Goodwin，P.B.Rapidpropagationofpotatobysinglenodecuttings，F(xiàn)ieldcrops，Res.4，165-173(1981))。
為了通過(guò)組織培養(yǎng)產(chǎn)生馬鈴薯無(wú)性繁殖材料盡管做了各種努力，但仍沒(méi)有解決大量而又經(jīng)濟(jì)效益地的生產(chǎn)馬鈴薯的問(wèn)題。雖然有些部分結(jié)果有價(jià)值，但至今還沒(méi)有得到一種綜合系統(tǒng)，能夠成功地用于大規(guī)模生產(chǎn)一種適宜的馬鈴薯繁殖材料，能夠提供一種解決辦法，生產(chǎn)不同的繁殖材料(即生根插條、微塊莖，或小塊莖)的需要。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，也是本發(fā)明的目的，通過(guò)下列組織培養(yǎng)的方法可以大量地生產(chǎn)無(wú)類病毒(和病毒)的馬鈴薯繁殖材料(即生根插條，微塊莖和/或小塊莖)分離發(fā)芽的馬鈴薯分生組織細(xì)胞(苗端組織)，將這種分離出來(lái)的無(wú)類病毒和病毒的部分分開(kāi)，培養(yǎng)在營(yíng)養(yǎng)劑上，直至長(zhǎng)出6～8個(gè)芽，不久它就會(huì)在營(yíng)養(yǎng)劑中生根，或在芽上誘導(dǎo)發(fā)出微莖塊;將體外生根的植株轉(zhuǎn)移到花房，在此，作為割離的分生組織株系，將成為母本植物，或者，再次在體外生根的植株上誘發(fā)出微塊莖，再?gòu)倪@些微塊莖，從這些母株苗，或小塊莖獲得母本植株作為繁殖材料?；蛘哂梦K莖作繁殖材料，用影響母本植株的塊莖素(patatin)合成導(dǎo)至幼苗或塊莖的形成。
本發(fā)明所列舉的方法可以應(yīng)用，大量生產(chǎn)有經(jīng)濟(jì)效益的馬鈴薯繁殖材料，并且適于常年穩(wěn)定供應(yīng)繁殖材料。
分離分生組織細(xì)胞、培養(yǎng)和繁殖幼苗、生根以及微塊莖的形成都是在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行的。從生根植物培養(yǎng)母本植株在花房中進(jìn)行。從母本植株培養(yǎng)籽苗或小塊莖在無(wú)媒介環(huán)境條件下在花房或試驗(yàn)田中進(jìn)行。
按照本發(fā)明的第一步就是選擇無(wú)病毒和類病毒的馬鈴薯品系。
在同樣的栽培品種的馬鈴薯塊莖上，可用例如赤霉素來(lái)誘導(dǎo)芽形成，然后將它放置在一個(gè)無(wú)光照的氣侯箱中，該塊莖將會(huì)發(fā)芽。大約三周以后，從5～10厘米長(zhǎng)的芽上消毒條件下分離0.2～0.3毫米的芽尖。將所分離的芽尖一個(gè)一個(gè)繁殖在無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)劑中。這樣每一個(gè)分生細(xì)胞將被作為一個(gè)單獨(dú)的品系被處理和繁殖。除去病毒和類病毒的每一繁殖品系可用病毒學(xué)試驗(yàn)方法，即酶免疫測(cè)定(EIA)檢驗(yàn)(J.gen.Virol.33.165-167(1976);RevueSuisseAgric.11.253-265(1979);J.gen.Virol.34.475-483(1977);Noevényvédelem15(8)，354-358(1979);Phytopath.Z.90.364-368(1977);Phytopath.67.145-150(1977)。
為了長(zhǎng)期繁殖，只有那些無(wú)各種馬鈴薯病毒和類病毒的分生組織品系可被使用。在開(kāi)始體外繁殖后，可以用此方法達(dá)到幾次檢驗(yàn)無(wú)病毒的株系。
將經(jīng)過(guò)滿意檢定和選擇的分生組織培養(yǎng)在有營(yíng)養(yǎng)物的Wassermann試管中，直到長(zhǎng)有6～8個(gè)芽。營(yíng)養(yǎng)劑的組成如下MS大成分二分之一濃度MS小成分Inozit100毫克/升鹽酸硫胺素0.5毫克/升鹽酸吡哆醇0.5毫克/升煙酸5毫克/升甘氨酸2毫克/升葉酸0.5毫克/升生物素0.05毫克/升水解酪蛋白500毫克/升Ca-泛酸2毫克/升萘乙酸(Naphtylaceticacid)0.001毫克/升蔗糖1.5%瓊脂0.8%至于大成分和小成分，見(jiàn)Hurashige和Skoog的文章Physiol.Plant15.473-497(1962)。
將所長(zhǎng)出的帶有6～8個(gè)芽的分生組織植株水平放置在固體營(yíng)養(yǎng)劑中，與上述情況相似(大成分為原來(lái)的濃度，3%蔗糖)，輕輕地?cái)D放到培養(yǎng)基中。用這一方法，所有將有可能開(kāi)始起動(dòng)。在這一時(shí)期，植物就可在體外繁殖。
對(duì)于生根來(lái)說(shuō)，同樣的營(yíng)養(yǎng)劑可用于繁殖，只是沒(méi)有瓊脂。對(duì)于微塊莖的形成，Hungarican的專利說(shuō)明書(shū)183，978和187，396中所給的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基也可以使用。在液體培養(yǎng)中，該苗塊的芽迅速生出芽、生出根組織。10～12天之后，根分枝成束，可以立即取出。該植株上只有極小的葉子，這對(duì)于在花房種植它們非常有利。不管是為了獲得生根苗還是微塊莖，都可用已知方法施加影響(AnnalsofBotany53.565-578(1984))。
在花房中，可將體外生根的植株培養(yǎng)在固體土壤上。
將生根植株成束置于土壤表面。為了保持土壤適當(dāng)濕度，用薄金屬片覆蓋植物，控制光照。每天要對(duì)薄金屬片下的植物通氣。到第二周時(shí)，逐步去掉覆蓋物，使植物適應(yīng)花房環(huán)境條件。植物移栽三周后，就可以無(wú)覆蓋而生長(zhǎng)，這樣就可用它們進(jìn)行扦插。
至于植物的生長(zhǎng)則不均一，只要適于直接用它們繁殖產(chǎn)籽苗就可以了。因此，這些植物可用作母株提供苗。
為了生產(chǎn)均一的籽苗材料，可將頂部插條(具有3至4個(gè)芽)在栽培木箱中生根。
插條帶有1～2厘米長(zhǎng)的葉子的幼菌。因?yàn)檩^老的苗將發(fā)育成塊莖，不適合用它們培養(yǎng)生根籽苗。在覆蓋的條件下籽苗生根，將它們?cè)谠耘嗄鞠渲信囵B(yǎng)兩周，直至長(zhǎng)出5～6片葉子。然后就可以將籽苗移栽到花房中，或在無(wú)傳染媒介環(huán)境的試驗(yàn)田中。
從苗繁殖誘出的微塊莖所得到的植株也可以用作母本植株。
將在花房中培養(yǎng)的籽苗以一種方式移栽到無(wú)傳染媒介的地里，正好使籽苗的上部葉子露出地面。所有這些水平座植的植物地下芽都將發(fā)育成苗，以后發(fā)育成塊莖。為了能控制變種和生育力的真實(shí)性，最好是按分生組織系將植物分別種植在無(wú)傳染媒介環(huán)境中。這樣就可能除去不好的品系，選擇好的特性。
在試驗(yàn)田中的這種繁殖材料的進(jìn)一步繁殖就可采用傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)方法進(jìn)行。
如上所述，從親本植株得到的插條可被移栽，以獲得塊莖。假如我們不希望得到塊莖，而是進(jìn)一步獲得能提供插條的親本植株，那么就必須抑制塊莖的形成，才能增加其插條形成的能力。一旦開(kāi)始形成塊莖之后，插條就不再能有效生根。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯塊莖形成的誘導(dǎo)是與馬鈴薯開(kāi)始合成塊莖形成素(papatin)緊密相聯(lián)的。葉子中開(kāi)始的合成塊莖形成素也就意味著塊莖形成誘導(dǎo)作用的預(yù)兆。合成塊莖形成素以及因此而來(lái)的塊莖形成的誘導(dǎo)或抑制可以用酶偶聯(lián)的塊莖形成素抗血清測(cè)定。
基于控制塊莖形成素合成，可以通過(guò)改變環(huán)境條件或者化學(xué)處理影響塊莖的形成?？梢酝ㄟ^(guò)降溫或者是除去無(wú)機(jī)氮源(氨，硝酸鹽)而代之用有機(jī)氮源尿素來(lái)誘導(dǎo)。
按照本發(fā)明所公開(kāi)的具體方法之一，可以誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)苗的塊莖形成，從而在體外得到具有幾個(gè)毫米直徑的微塊莖。這些微塊莖非常便于作為繁殖材料。與季節(jié)苗的生產(chǎn)相反，該微塊莖可以一年四季穩(wěn)定生產(chǎn)，而且能夠以小體積藏在冰箱。
然而，微塊莖也有不利的一面，它們的密度疏松，極易萎縮和受到損傷。這些缺點(diǎn)可以通過(guò)用一種保護(hù)層，包被體外產(chǎn)生的塊莖而消除，從而防止它們的萎縮，防止機(jī)械損傷。這些包被的塊莖適合用插種機(jī)進(jìn)行播種。
本方法如下從培養(yǎng)瓶中取出微塊莖后，一定要除去莖殘余物，然后將塊莖徹底沖洗后干燥?？梢栽谝挥?～2層的淺盤中，溫度為20℃、濕度為40%的條件下干燥大約兩周。干燥一直要進(jìn)行到塊莖的最初體積減少三分之一為止。然后用已知方式包裹塊莖(0.5～0.6mm)形成顆?；??？梢圆捎冒N子時(shí)所用的常規(guī)方法進(jìn)行顆粒化。被包裹的塊莖經(jīng)干燥后，于2～5℃下保藏。在該方法的實(shí)踐過(guò)程中，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)自發(fā)的遺傳變化。
下面的例子非限定性的說(shuō)明了本發(fā)明。
實(shí)例1無(wú)病毒培育原種的生產(chǎn)及栽培品種的體外保藏用10%次氯酸鈉和0.1%濕潤(rùn)劑的溶液洗滌10個(gè)“Somogygyongye”馬鈴薯塊莖，用于洗擦。將它們浸泡在同樣的溶液中30分鐘。經(jīng)消毒之后，用無(wú)菌蒸餾水將該塊莖洗滌三次，干燥。為了促進(jìn)發(fā)芽，將該塊莖放在10毫克/升的GA-3(赤霉素)溶液中浸泡30分鐘，然后再干燥。讓它在溫度為5℃、相對(duì)濕度為70～80%、無(wú)光照的氣溫箱中發(fā)芽18～22天，直至長(zhǎng)出4～6厘米長(zhǎng)的苗。用塊莖和苗將培養(yǎng)物標(biāo)記和記錄。
將切下的苗在4%次氯酸鈉溶液中滅菌，然后用無(wú)菌蒸餾水洗滌三次。再在顯微鏡下用鋒利的柳葉刀切下苗尖，將它置于上面詳述的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。將一個(gè)苗尖分生組織放在試管中，它在溫度為20～22℃、光強(qiáng)度為500勒的條件下開(kāi)始生長(zhǎng)3～4周。在生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)基上方的光照強(qiáng)度增加到2000勒，在6～8周發(fā)育成有5～7片葉子的小植株。
從試管中取出植株，放在上面提到過(guò)的一種營(yíng)養(yǎng)基上，只是蔗糖的濃度必須增加至3%。含40毫升營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)螺旋蓋瓶(400毫升)非常合乎這一目的(1株/瓶)。在20～22℃以及3000勒光波度的條件下，所有的芽將在6～8周長(zhǎng)出，在瓶中長(zhǎng)成4～8厘米的苗。此時(shí)必須首先控制除去病毒。
被病毒感染的品系通過(guò)進(jìn)一步培養(yǎng)而被消除，將合格的苗切成有1～2個(gè)芽的塊，置于另外的培養(yǎng)瓶，按上述方法培養(yǎng)。在每一次的移植周期中，必須進(jìn)一步控制至少三次，從而使無(wú)病毒的品系繁殖。使用上面詳述的方法，就可以從每一品系大量地生產(chǎn)該植物。
實(shí)例2生產(chǎn)微塊莖將按實(shí)例1生產(chǎn)的植株在上面所提到的不含營(yíng)養(yǎng)劑(液體)中進(jìn)一步培養(yǎng)(22℃，3000勒)，培養(yǎng)植物的瓶按植株編號(hào)。大約三周之后，必須用另一種營(yíng)養(yǎng)劑更換瓶中的營(yíng)養(yǎng)劑，以促進(jìn)塊莖形成素合成。這種營(yíng)養(yǎng)劑不同于其他營(yíng)養(yǎng)劑，它含有10毫克/升的苯基-腺嘌呤，10毫克/升的香豆素和8%的蔗糖，但只有原量10%的無(wú)機(jī)氮源。在17℃，1000勒下培養(yǎng)10～12周。這時(shí)，可發(fā)育出40～60個(gè)直徑為0.3～0.6厘米的微塊莖。打開(kāi)瓶子，干燥植物，取出塊莖，在室溫下放置一周，隨后在黑暗和干燥的地方于+2～4℃保藏。
實(shí)例3親本植株和籽苗的生產(chǎn)將按實(shí)例1所生產(chǎn)的植株以松散成束移栽到花房有泥炭和珍珠巖的混合物的土壤中(500～750個(gè)植物/米)。土壤保持在20℃，室溫在24℃為了保證濕度，用薄金屬片覆蓋地面。培養(yǎng)物可能在2～4周內(nèi)適應(yīng)花房條件植物越來(lái)越健壯，將發(fā)育出7～8片葉子。這就是親本植物，通過(guò)噴灑0.2%Mikramid的人造肥料溶液阻止塊莖素的合成，從而抑制塊莖的形成。從這種親本植株可以再次獲得具有4～5片葉子的頂端苗，生根后就可進(jìn)行培養(yǎng)，或者作為馬鈴薯籽苗投放市場(chǎng)。從每一個(gè)培養(yǎng)瓶中可以得到80～100個(gè)籽苗。
實(shí)例4小塊莖的生產(chǎn)用實(shí)例2的微塊基，或從實(shí)例3的籽苗在暖房或隔離器中，生產(chǎn)小塊莖。播種或栽植在含有0.5千克/米3的尿素人造肥料的泥炭和珍珠巖的混合土中，(400個(gè)植株/米)。
必須在自然溫度和光照條件下給植株澆水，以滿足它們的需要。營(yíng)養(yǎng)物的供給可以通過(guò)葉子進(jìn)行。八周后，必須使用一種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑-氯-膽堿-氯化物阻止葉子的生長(zhǎng)，并停止?jié)菜?。播種后85～90天可得到3～4個(gè)小塊莖(原種)(直徑0.5～2.0厘米)。
權(quán)利要求
1.通過(guò)組織培養(yǎng)大量生產(chǎn)無(wú)病毒和類病毒的馬鈴薯繁殖材料的方法，其特征在于分離馬鈴薯苗尖組織的發(fā)芽細(xì)胞，體外培養(yǎng)在營(yíng)養(yǎng)劑中繁殖，得到的苗在營(yíng)養(yǎng)劑中生根，或在苗上誘導(dǎo)塊莖形成，將體外生根植株移載到花房，培養(yǎng)成親本植株，或者將體外生根的植株誘導(dǎo)塊莖形成，如果需要的話，從微塊莖，培養(yǎng)成親本植株，從親本植株得到籽苗或小塊莖的繁殖材料，或者用得到的微塊莖作為繁殖材料，籽苗和塊莖形成，可通過(guò)影響親本植株塊莖素合成進(jìn)行控制。
2.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)微塊莖作為繁殖材料的方法，其特征在于直接或試管生根的體外繁殖所得的苗，可以誘導(dǎo)塊莖形成。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于得到的微塊莖繁殖材料用保護(hù)層包被。
4.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)用作繁殖材料的馬鈴薯籽苗的方法，其特征在于體外繁殖得到的苗可在營(yíng)養(yǎng)劑中體外生根，然后移栽到花房，因此得到親本植株的繁殖材料，同時(shí)，親本植株塊莖素的合成受到阻止。
5.如權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于可通過(guò)環(huán)境條件，或者使用化學(xué)處理影響塊莖素的合成。
6.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)作為繁殖材料的馬鈴薯小塊莖的方法，其特征在于在從體外生根所培養(yǎng)的親本植株，或微塊莖，可以誘導(dǎo)塊莖形成。
7.如權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于從母本植株得到的苗，可以進(jìn)一步培養(yǎng)母體植株。
8.如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于是在無(wú)病毒和類病毒的環(huán)境條件下生產(chǎn)馬鈴薯繁殖材料。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)組織培養(yǎng)大量生產(chǎn)無(wú)病毒和類病毒的馬鈴薯繁殖材料的方法。用一種方法，即分離馬鈴薯的苗尖組織細(xì)胞，在營(yíng)養(yǎng)劑中體外培養(yǎng)，然后透導(dǎo)生根，或者誘導(dǎo)微塊莖形成。培養(yǎng)生根的植株成母本植物，或者進(jìn)一步誘導(dǎo)微塊莖，由微塊莖進(jìn)一步培養(yǎng)成母本植株。由這些苗或小塊莖得到繁殖材料，或者用微塊莖體為繁殖材料。
文檔編號(hào)A01G7/00GK1031637SQ8710604
公開(kāi)日1989年3月15日 申請(qǐng)日期1987年9月1日 優(yōu)先權(quán)日1987年9月1日
發(fā)明者弗倫克·德?tīng)枴じ８窭? 伊斯特萬(wàn)·德?tīng)枴ぬK姆, 吉尤拉·奧利亞爾, 米克洛斯·馬吉亞爾, 安納馬里亞·麥薩羅斯, 米克洛斯·澤吉迪 申請(qǐng)人:諾沃特拉德公司