專利名稱：用地衣芽孢桿菌生產(chǎn)生物農(nóng)藥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)農(nóng)藥的新方法，特別是關(guān)于利用篩選分離到的一株獨(dú)特的地衣芽孢桿菌進(jìn)行微生物發(fā)酵獲得的菌體發(fā)酵液，命名為"華能201"的生物農(nóng)藥的生產(chǎn)方法。
植物病蟲害對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，所以防治農(nóng)作物的病蟲害是一項(xiàng)十分有意義的課題。而目前國內(nèi)外對農(nóng)業(yè)作物病蟲害的防治辦法多數(shù)都采用化學(xué)合成農(nóng)藥進(jìn)行防治。雖然病蟲害一時(shí)可以得到防治和控制，但是化學(xué)農(nóng)藥毒性大，殘留農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境造成危害，因此，目前世界各國都在關(guān)注高效、無毒、無公害的生物農(nóng)藥，本發(fā)明正是針對目前化學(xué)農(nóng)藥存在的問題，利用特殊分離到的一株地衣芽孢桿菌，采取微生物發(fā)酵的方法，獲取具有生物活性的發(fā)酵液，這種發(fā)酵液能夠有效的防治農(nóng)用作物病害，同時(shí)還證明這種發(fā)液能夠刺激植物生長，促進(jìn)種子萌發(fā)，對蚜蟲，紅蜘蛛和螨蟲也有較強(qiáng)的殺滅作用。通過實(shí)驗(yàn)證明"華能201"生物農(nóng)藥對馬鈴薯瘟病、花生青枯病、黃瓜枯萎病、棉花立枯病、白菜軟腐病、白菜黑腐病、荔枝霜霉病有較好的防治效果。本發(fā)明"華能201"生物農(nóng)藥經(jīng)衛(wèi)生部預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒理研究室實(shí)驗(yàn)證明，也是一種安全可靠的生物農(nóng)藥，對人、畜無毒害作用。"華能201"施藥后，在自然界不會(huì)殘留積累，可以由自然因素降解。而化學(xué)農(nóng)藥對人畜毒性較大，農(nóng)民常有施藥不當(dāng)產(chǎn)生中毒現(xiàn)象發(fā)生?；瘜W(xué)農(nóng)藥對原菌易產(chǎn)生耐藥性，所以使用劑量有愈來愈大的趨勢，為此給環(huán)境帶來的危害日趨嚴(yán)重。本發(fā)明克服了化學(xué)農(nóng)藥缺欠，是目前理想的生物農(nóng)藥。從現(xiàn)有檢索中，至今還末發(fā)現(xiàn)采用地衣芽孢桿菌生產(chǎn)本發(fā)明生物農(nóng)藥的報(bào)導(dǎo)。本發(fā)明生產(chǎn)"華能201"的方法是，將新活化的菌種接入三角瓶中，使菌體擴(kuò)大培養(yǎng)后，接入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。其過程中主要的關(guān)鍵是發(fā)酵溫度可以控制在15-55℃之間，最適生長溫度是28-30℃，發(fā)酵的PH值可以在5至8之間，最適PH范圍在6.5-7.2之間，發(fā)酵可控制在16-30小時(shí)，發(fā)酵最適時(shí)間應(yīng)在20-24小時(shí)。發(fā)酵過程所設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基碳源可以是含淀粉的物質(zhì)含量為0.1-3%，糖蜜1.5-2.5%，葡萄糖0.5-1.5%，蔗糖0.5-1.5%。氮源可以是含蛋白質(zhì)的物質(zhì)，如黃豆粉0.5-1.0%，棉餅粉或無機(jī)氮源如硫酸銨(NH4)2SO4等。發(fā)酵培養(yǎng)基中還需添加磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳和酵母粉。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基配方有以下幾種1、玉米粉 3.0% (NH4)2SO40.5%黃豆粉 1.0% K2HPO40.05%棉餅粉 1.0% MgSO4.7H2O 0.02%胰蛋白胨 0.1% MnSO40.001%酵母粉0.1%PH6.5-7.22、50%糖蜜 2% (NH4)2SO40.2%黃豆粉 0.5% K2HPO40.2%酵母粉0.1%PH6.5-7.23、20%糖蜜 2% (NH4)2SO40.2%玉米粉 0.1% K2HPO40.2%牛肉膏0.1%PH6.5-7.2
4、葡萄糖 1% (NH4)2SO40.5%K2HPO40.5%蛋白胨 0.5% MnSO4.H2O 0.5%牛肉膏 0.3% MgSO4.7H2O 0.02%PH6.5-7.2實(shí)施例1∶500立升發(fā)酵罐生產(chǎn)"華能201"及抑菌結(jié)果采用本發(fā)明分離到的地衣芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵培養(yǎng)的組成，玉米粉3.0%，黃豆粉1.0%，棉餅粉1.0%，胰蛋白胨0.1%，酵母粉0.1%，MnSO40.001%，(NH4)2SO40.5%，K2HPO40.05%，MgSO4.7H2O 0.02%。PH調(diào)節(jié)在6.5-7.2的范圍內(nèi)。發(fā)酵罐容積為500立升，發(fā)酵最適溫度范圍為28-30℃，攪拌速度為200rpm-300rpm轉(zhuǎn)/分，空氣流量比為1∶0.75，罐壓保持在0.6-1Kg/cm2，罐發(fā)酵最適周期為20-24小時(shí)，一般可以測定菌體數(shù)，若每毫升發(fā)酵液菌體數(shù)達(dá)到100億個(gè)菌體時(shí)，發(fā)酵可視為到達(dá)終點(diǎn)，一般采用上述方法，發(fā)酵周期控制在18-24小時(shí)之間，發(fā)酵即可達(dá)到理想的結(jié)果，發(fā)酵液都具有較高的生物活性。以此，發(fā)酵液對部分植物病菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，其結(jié)果如下"華能201"的抗菌譜結(jié)果試驗(yàn)菌(植物病原菌)抑菌圈(mm)馬鈴薯瘟病17馬鈴薯青枯病19水稻白葉枯病65稻瘟病20
水稻惡菌病20花生青枯病20黃瓜枯萎病26黃瓜炭疽病26黃瓜角斑病14黃瓜霜霉病+++棉花枯萎病28棉花立枯病37白菜軟腐病21白菜黑腐病70注+++對孢子萌發(fā)的抑制能力。
一般測定抑菌圈超過23mm的發(fā)酵液，可以列為高效產(chǎn)品。抑菌圈在18-23mm之間，的產(chǎn)品為合格產(chǎn)品。
實(shí)施例2"華能201"防治水稻白葉枯病試驗(yàn)結(jié)果一、材料方法1、"華能201"生物農(nóng)藥。
2、20%的葉青雙可濕粉劑(又名噻枯唑，川化-018，浙江溫州龍灣化工廠生產(chǎn))化學(xué)農(nóng)藥作對照藥劑。
3、試驗(yàn)共有四個(gè)處理(1)、"華能201"50倍液(2)、"華能201"100倍液
(3)、20%葉青雙2兩/畝(4)、空白對照噴等量清水各處理重復(fù)三，隋機(jī)組排列，每小區(qū)面積20平方米。
4、試驗(yàn)田選在信陽縣五里店鄉(xiāng)豐臺(tái)村，常年發(fā)病重的田塊。水稻品種"燦優(yōu)63"。由于干旱，白葉枯病較常年發(fā)生偏晚。8月15日噴第一次藥，一周后噴第二次藥，每畝噴液量50Kg。
各施藥區(qū)防治白葉枯病效果見表一二、結(jié)果從上表中可以看出"華能201"生物農(nóng)藥對水稻白葉枯病有明顯的防治效果，是取代化學(xué)農(nóng)藥葉青雙防治水稻白葉枯病的優(yōu)良藥劑。
實(shí)施例3"華能201"防治黃瓜霜霉病試驗(yàn)結(jié)果一、材料方法1、"華能201"生物農(nóng)藥2、25%甲霜靈WP3、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)共設(shè)五個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)三次，共十五個(gè)小區(qū)，隋機(jī)排列，每個(gè)小區(qū)面積為15平方米，處理濃度為(1)、"華能201"25倍液50倍液100倍液(2)、25%的甲霜靈WP1000倍液(3)、空白對照防效試驗(yàn)見表二二、結(jié)果201殺菌劑能有效地抑制黃瓜霜霉病的發(fā)展，在防治中應(yīng)采用兩次或者視病情發(fā)展情況進(jìn)行至少兩次的噴藥，每次噴藥間隔期為七天，并盡早噴藥，以發(fā)病初期噴藥為宜。
實(shí)施例4"華能201"防治蚜蟲初步試驗(yàn)結(jié)果一、材料方法1、"華能201"生物農(nóng)藥2、空白對照為清水3、試驗(yàn)處理(1)、"華能201"50倍稀釋(2)、"華能201"100倍稀釋(3)、空白對照等量清水各處理重復(fù)二次，隋機(jī)排列，每小區(qū)面積30平方米。
結(jié)果見下表竹子蚜蟲試驗(yàn)結(jié)果處理7小時(shí)死亡率24小時(shí)死亡率"華能201"50倍液10%95%"華能201"100倍液8%92%CK(空白水時(shí)照)0%0%實(shí)施例5201防治荔枝霜霉病結(jié)果一、材料方法1、華能201生物農(nóng)藥。
2、瑞毒霉600倍稀釋，化學(xué)農(nóng)藥作為對照藥劑。
3、試驗(yàn)共四個(gè)處理①華能"201"，50倍稀釋液;②華能"201"，100倍稀釋液;
③瑞毒霉，600倍稀釋;④空白對照噴等量清水。
防治荔枝霜霉病結(jié)果如下處理調(diào)查果數(shù)健果%病果%發(fā)病率%防治效果%"201"50倍稀釋197180178.6373.13"201"100倍稀釋63323149.2153.21瑞毒霉600稀釋1231101310.5767.09對照清水1651125332.12無4、結(jié)果分析華能"201"50倍稀釋，防治荔枝霜霉病藥效比目前生產(chǎn)上用的50%的瑞毒霉-錳舒效果更好。
從初步試驗(yàn)結(jié)果，"201"100倍稀釋對防治菜蚜和其它蚜蟲和2.5%敵殺死效果差不多，但"201"對人畜無害，對周圍環(huán)境無污染，無殘留，雖然防治不能立即看出，但24小時(shí)的防治結(jié)果和其它化學(xué)農(nóng)藥效果相比更好。故為很有前途的微生物農(nóng)藥。
權(quán)利要求
1.用地衣芽孢桿菌生產(chǎn)生物農(nóng)藥的方法，其特征在于使用的生產(chǎn)菌是特殊分離到的一株地衣芽孢桿菌，它的發(fā)酵液對植物病、蟲害有明顯的防治作用，尤其對革蘭氏陰性菌和植物病原真菌有較強(qiáng)的頡抗作用，如說明書中所述，該菌在本發(fā)明中所設(shè)計(jì)的含有碳、氮源培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)可以獲得具有較高生物活性的發(fā)酵液，在本發(fā)明中命名為“華能201”。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于使用地衣芽孢桿菌生產(chǎn)"華能201"的溫度范圍是15-55℃之間，最佳溫度是28-30℃。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于本發(fā)明設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基是碳源采用含淀粉的物質(zhì)或糖或糖蜜和氮源是含蛋白質(zhì)的物質(zhì)或無機(jī)氮，以及無機(jī)鹽類，用磷酸氫二鉀，硫酸鎂，硫酸錳。
4.如權(quán)利要求3所述的方法所說的培養(yǎng)基碳源，其特征在于含淀粉的物質(zhì)是用玉米粉，含量為0.1-3%或糖蜜在1.5-2.5%，最佳為2%，或糖可以用葡萄糖含量可在0.5-1.5%范圍，最佳1%，或者蔗糖可在0.5-1.5%范圍，最佳含量1%。
5.如權(quán)利要求3所述的方法所說的培養(yǎng)基中氮源其特征在于可以用黃豆粉，含量為0.5-1.0%，硫酸銨0.2-0.5%。
6.如權(quán)利要求3所述的方法所說的培養(yǎng)基無機(jī)鹽其特征在于磷酸氫二鉀含量0.05-0.5%，硫酸鎂含量為0.02%，硫酸錳含量0.001-0.5%。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于使用地衣芽孢桿菌生產(chǎn)"華能201"發(fā)酵時(shí)間在16-30小時(shí)之間，最適時(shí)間應(yīng)控制在20-24小時(shí)之內(nèi)。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于使用地衣芽孢桿菌生產(chǎn)"華能201"的PH范圍可以控制在5-8之間，最適PH是在6.5-7.2之間。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物農(nóng)藥的新方法。用本發(fā)明的地衣芽孢桿菌為生產(chǎn)菌，通過微生物發(fā)酵的方法制得菌體發(fā)酵液對植物病害菌，如水稻白葉枯病、黃瓜枯萎病、黃瓜霜霉病、馬鈴薯瘟病和棉花枯萎病等有明顯防治效果，并對有害的蚜蟲、紅蜘蛛和螨蟲有殺滅作用。該菌使用的培養(yǎng)基主要成分有玉米粉，黃豆粉，硫酸銨，硫酸鎂和硫酸錳等無機(jī)鹽。最適pH值6.5—7.2，最適溫度28—30℃，最適發(fā)酵周期為18—24小時(shí)。
文檔編號(hào)A01N63/02GK1090130SQ9310017
公開日1994年8月3日 申請日期1993年1月20日 優(yōu)先權(quán)日1993年1月20日
發(fā)明者楊惠芳, 程素琴, 王天縱, 寇平原 申請人:河南華能科技發(fā)展公司, 中國華能技術(shù)開發(fā)公司