專(zhuān)利名稱：：來(lái)自麥蛾繭蜂胡蜂的毒素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的昆蟲(chóng)毒素，編碼對(duì)昆蟲(chóng)具有毒性的蛋白質(zhì)的DNA序列，包含編碼對(duì)昆蟲(chóng)具有毒性的蛋白質(zhì)的DNA序列的重組DNA構(gòu)建物和包含所述昆蟲(chóng)毒素，DNA序列或重組DNA構(gòu)建物的生物防治劑。對(duì)許多群居胡蜂的毒液已進(jìn)行了廣泛的研究，它們被已知含有一系列有效的生物活性胺，致痛神經(jīng)肽，變態(tài)反應(yīng)原和神經(jīng)毒素(Piek(1991)Toxicon，29，139-149)。對(duì)于獨(dú)居胡蜂，尤其是過(guò)著寄生生活類(lèi)型的那些種類(lèi)的毒液了解甚少。許多獨(dú)居寄生的胡蜂捕食昆蟲(chóng)，已觀察到多于250個(gè)種類(lèi)使它們的宿主麻醉(對(duì)于研究參見(jiàn)Piek和Spanjer(1986)膜翅目的毒液，TPiek(編)AcademicPress，倫敦pp161-307)。許多種類(lèi)屬于小繭蜂科。大多數(shù)小繭蜂胡蜂為初(primary)寄生物。成蟲(chóng)幾乎專(zhuān)門(mén)在其它昆蟲(chóng)中或之上產(chǎn)下它們的卵，孵化之后，胡蜂幼蟲(chóng)在它們的宿主上生活。引起人們注意的一個(gè)小繭蜂種類(lèi)為麥蛾繭蜂(Braconhebetor(Bracon＝Microbracon＝Harbrobracon)。麥蛾繭蜂(B.hebetor)為具隱蔽或作繭包藏生活類(lèi)型的鱗翅目幼蟲(chóng)的小的(3mm)寄生物。成年雌胡蜂在宿主幼蟲(chóng)外產(chǎn)卵，幾乎同時(shí)注射麻醉毒液，數(shù)分鐘內(nèi)，宿主幼蟲(chóng)變得不協(xié)調(diào)并最終被完全麻醉。雖然不直接致死，這種麻醉是持久性的，并且使昆蟲(chóng)不能行動(dòng)直至胡蜂幼蟲(chóng)以它們的宿主為食。麥蛾繭蜂的毒液具有極有效的麻醉活性。在較大的大蠟螟，(Galleria，mellonella)的幼蟲(chóng)中，已測(cè)出在1份毒液對(duì)應(yīng)于200,000,000份宿主血淋巴的水平上產(chǎn)生完全持久的麻醉(Beard(1952)Conn.Agric.Exp.Stn.NewHavenBulletin，562，27)。而且，對(duì)于昆蟲(chóng)以及昆蟲(chóng)的目之間，毒液顯示出選擇性毒性。蜘蛛，螯蝦，蛙，大鼠和豚鼠的神經(jīng)肌肉標(biāo)本均對(duì)該毒液不敏感(Rathmayer和Walther(1976)動(dòng)物，植物和微生物毒素，2，PlenumPress，NewYork，299-307；Deitmer(1973)。麥蛾繭蜂毒液的麻醉成分被認(rèn)為通過(guò)突觸前阻斷神經(jīng)肌肉接頭處的興奮性谷氨酸遞質(zhì)，可能通過(guò)抑制突觸小泡的釋放來(lái)起作用(Walther和Reinecke(1983)神經(jīng)科學(xué)9，213-224；Piek和Mantel(1970)合成普通藥物學(xué)，1，87-92；Piek(1966)昆蟲(chóng)生理學(xué)雜志12，561-568)。來(lái)自許多捕食昆蟲(chóng)的節(jié)肢動(dòng)物的毒液已被發(fā)現(xiàn)含有選擇性對(duì)昆蟲(chóng)起作用的毒素。這些對(duì)昆蟲(chóng)具有選擇性的神經(jīng)毒素可以成為研究昆蟲(chóng)神經(jīng)生物學(xué)的重要的分子工具。麥蛾繭蜂毒素的作用方式及對(duì)昆蟲(chóng)的選擇性預(yù)示著它可用于鱗翅目的神經(jīng)肌肉傳輸?shù)难芯恳约镑[翅目神經(jīng)肌肉接點(diǎn)的小泡的釋放的研究。還可認(rèn)為這種對(duì)昆蟲(chóng)的選擇性在防治昆蟲(chóng)害蟲(chóng)中非常有利。然而，因?yàn)辂湺昀O蜂的蛋白質(zhì)毒素的公開(kāi)的信息表明可能存在多種毒素，那么首先必須純化和表征對(duì)鱗翅目幼蟲(chóng)具有高度神經(jīng)毒性活性的毒素。我們目前已純化并表征了兩種神經(jīng)毒性蛋白，僅為了引用方便，將它們稱為繭蜂毒素1和2(下文稱為BrhTX-1和BrhTX-2)。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種包含四種多肽亞基的昆蟲(chóng)毒素，其中多肽亞基具有示于序列IDNos.1，2，3和4中的N末端氨基酸序列。該昆蟲(chóng)毒素相當(dāng)于BrhTX-1。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種可從寄生性胡蜂獲得的昆蟲(chóng)毒素，該昆蟲(chóng)毒素用本文詳細(xì)說(shuō)明的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法測(cè)得具有估測(cè)的約34,000Da，約21,000Da，約18,500Da和約17,000Da的分子量。這種昆蟲(chóng)毒素相當(dāng)于稱為BrhTX-2的毒素。我們還分離并表征了至少BrhTX-1的多肽亞基。因此根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含如序列IDNO.19所示的核酸序列的分離DNA；與如序列IDNO.19所示的核酸序列顯示出60％或更大同源性的序列；與如序列IDNO.19所示的核酸序列雜交的序列；和為如序列IDNO.19所示的核酸的簡(jiǎn)并遺傳密碼以及編碼相同多肽的序列。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含如SequenceIDNO.46所示的核酸序列的分離DNA；對(duì)如SequenceIDNO.46所示的核酸序列顯示出60％或更大同源性的序列；與如SequenceIDNO.46所示的核酸序列雜交的序列；以及為如SequenceIDNO.46所示的核酸的簡(jiǎn)并遺傳密碼和編碼相同多肽的序列。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含如SequenceIDNO.57所示的核酸序列的分離DNA；對(duì)如SequenceIDNO.57所示的核酸序列顯示出60％或更大同源性的序列；與如SequenceIDNO.57所示的核酸序列雜交的序列；以及為如SequenceIDNO.57所示的核酸的簡(jiǎn)并遺傳密碼和編碼相同多肽的序列。根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供了包含如SequenceIDNO.36所示的核酸序列的分離DNA；對(duì)如SequenceIDNO.36所示的核酸序列顯示出60％或更大同源性的序列；與如SequenceIDNO.36所示的核酸序列雜交的序列；以及為如SequenceIDNO.36所示的核酸的簡(jiǎn)并遺傳密碼和編碼相同多肽的序列。本發(fā)明的DNA可為cNDA，基因組DNA或合成DNA。如上面所提到的，本發(fā)明包括對(duì)本發(fā)明DNA序列顯示出60％或更大同源性的DNA。通常優(yōu)選≥65％，較優(yōu)選≥70％，更優(yōu)選≥75％或80％的核苷酸。尤其優(yōu)選的是顯示85％，90％，95％或99％或更大同源性的序列。本發(fā)明還包括與本發(fā)明DNA雜交的DNA。這種雜交優(yōu)選在低和高嚴(yán)格條件下或之間發(fā)生。在通用術(shù)語(yǔ)中，低嚴(yán)格條件可定義為在約室溫至約65℃下3×SCC，高嚴(yán)格條件為在約65℃下，0.1×SSC。SSC為0.15MNaCl，0.015檸檬酸三鈉的緩沖液。3×SSC為SSC強(qiáng)度的3倍等等。本發(fā)明還包括作為本發(fā)明DNA的遺傳密碼的簡(jiǎn)并DNA。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種多肽，該多肽為一種昆蟲(chóng)毒素，并且基本上不含通常與它相關(guān)的其它蛋白質(zhì)，它由本發(fā)明任一種DNA所編碼，還包括它的衍生物。還根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了具有SequenceIDNos.20，47，58或37中之一的氨基酸序列的多肽，包括它的衍生物。所述氨基酸衍生物優(yōu)選為同源變異體，優(yōu)選具有80％或更多相同的氨基酸，較優(yōu)選具有90％或更多相同的氨基酸。任何改變優(yōu)選為保守氨基酸改變。對(duì)于保守氨基酸改變我們指用來(lái)自相同類(lèi)型的氨基酸置換來(lái)自一種氨基酸類(lèi)型的氨基酸，即疏水性，極性，酸性或堿性氨基酸。這種變化的一個(gè)實(shí)例是用甲硫氨酸置換纈氨酸，反之亦然。本發(fā)明還包括從mRNAs翻譯的多肽，該mRNAs由來(lái)自每一種同種基因的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的替代剪接途徑而來(lái)。本發(fā)明還包括通過(guò)本發(fā)明多肽的翻譯后修飾而制備的多肽。該翻譯后修飾包括多肽的酶切，輔基的加入，糖基化作用或多亞基結(jié)構(gòu)的形成。本發(fā)明cDNAs編碼形成本發(fā)明昆蟲(chóng)毒素的多肽。本發(fā)明的多肽相當(dāng)于本發(fā)明昆蟲(chóng)毒素的亞基。此外，本發(fā)明的每一個(gè)cDNA序列編碼可獨(dú)自產(chǎn)生對(duì)昆蟲(chóng)具有毒性的效果的多肽。從而本發(fā)明每種多肽均可提供對(duì)昆蟲(chóng)具有毒性的效果。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含本發(fā)明DNA序列的重組DNA構(gòu)建物。這些構(gòu)建物包括克隆用載體，例如適宜于轉(zhuǎn)化目的細(xì)胞的質(zhì)粒和噬菌體。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，重組DNA構(gòu)建物為表達(dá)載體，本發(fā)明包括為可變或可變?yōu)榭勺兊娜魏芜m宜載體。進(jìn)一步根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含本發(fā)明重組構(gòu)建物的被轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞，非哺乳類(lèi)脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞和植物細(xì)胞。本發(fā)明還包括細(xì)菌，酵母，尤其是用本發(fā)明重組構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的真菌，和它們的基因組已被直接或間接進(jìn)行遺傳處理以使它們能摻入本發(fā)明的DNA的病毒。轉(zhuǎn)化/遺傳處理的適宜系統(tǒng)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員為已知的。制備該重組構(gòu)建物系統(tǒng)的方法與本發(fā)明不是特別有關(guān)的，可以采用適宜于靶的任何方法；這些方法在本領(lǐng)域?yàn)橐阎?。本發(fā)明的DNA/毒素/多肽可從寄生性胡蜂獲得，例如從姬蜂總科獲得。毒素優(yōu)選可從繭蜂科獲得。繭蜂科的實(shí)例為絨繭蜂屬，繭蜂屬、小繭蜂屬和螟繭蜂屬。在尤其優(yōu)選的具體例子中，DNA/毒素/多肽從麥蛾繭蜂得到。本發(fā)明的DNA/毒素/多肽可通過(guò)不同的途徑從其它來(lái)源獲得，例如使用常規(guī)的克隆技術(shù)或合成方法。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種包含本發(fā)明昆蟲(chóng)毒素，多肽，重組DNA構(gòu)建物，或被轉(zhuǎn)化體系的生物防治劑。在這種情況下，生物防治劑優(yōu)選進(jìn)一步包括農(nóng)學(xué)上可接受的固體或液體載體。從而提供了一種與棲息地中的昆蟲(chóng)害蟲(chóng)作斗爭(zhēng)的方法，該方法包括用防治害蟲(chóng)有效量的本發(fā)明的昆蟲(chóng)毒素處理害蟲(chóng)或棲息地。本發(fā)明還包括具有包含受促使所述核酸表達(dá)的啟動(dòng)子序列控制的本發(fā)明的核酸的基因組的生物防治劑。因此包括在術(shù)語(yǔ)生物防治劑中的為病毒，原核或真核生物，這些生物當(dāng)與昆蟲(chóng)相聯(lián)系時(shí)能感染昆蟲(chóng)，干擾其正常的生化，生理或電生理過(guò)程并最終導(dǎo)致昆蟲(chóng)的死亡。在本發(fā)明范圍內(nèi)的適宜的生物防治劑包括以昆蟲(chóng)的細(xì)菌，病毒，真菌病原體為基礎(chǔ)的那樣。細(xì)菌病原體包括例如桿菌，如蘇云金芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌等。昆蟲(chóng)的真菌病原體包括例如白僵菌屬，例如球孢白僵菌。另一方面，生物防治劑可以為被遺傳修飾的植物內(nèi)寄生菌，其中基因組被改變摻入至少一個(gè)本發(fā)明的核酸序列。當(dāng)該內(nèi)寄生菌與植物結(jié)合時(shí)，核酸所編碼的毒素可由植物內(nèi)的內(nèi)寄生菌表達(dá)，對(duì)以植物為食或棲息在植物上的昆蟲(chóng)產(chǎn)生有毒的作用。在另一種變化中，生物防治劑可為植物本身，尤其是種植作為纖維產(chǎn)品或食物的作物植物，其中植物的基因組通過(guò)摻入至少一個(gè)本發(fā)明的核酸序列而被修飾?，F(xiàn)參考附圖通過(guò)非限制性實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明各種優(yōu)選的特征和具體實(shí)例，其中圖1顯示分離毒液腺提取物B-1和B-2以及純化的毒素BrhTX-1和BrhTX-2的SDS-PAGE分析；圖2顯示使用非變性PAGE回收的提取物被進(jìn)一步使用陰離子交換層析分離時(shí)的結(jié)果；圖3顯示B-1的大小分級(jí)層析的結(jié)果；圖4顯示用于計(jì)算天然B-1毒素分子量的圖；圖5顯示在還原和非還原條件下，使用PAGE的對(duì)BrhTX-1分級(jí)分離的結(jié)果；圖6顯示從BrhTX-1獲得的亞基的N-末端氨基酸序列信息；圖7顯示亞基BrhTX-1(a)的N-末端氨基酸序列和BH(a)A，BH(a)B和BH(a)I的對(duì)應(yīng)的簡(jiǎn)并寡核苷酸設(shè)計(jì)；圖8顯示亞基BrhTX-1(a)的cDNA序列和推定的氨基酸序列；圖9顯示亞基BrhTX-1(d)的N-末端氨基酸序列和BH(d)A，BH(d)B和BH(a)I的對(duì)應(yīng)的簡(jiǎn)并寡核苷酸設(shè)計(jì)；圖10顯示亞基BrhTX-1(d)的cDNA序列和推定的氨基酸序列；圖11顯示pBrhTX-1(b)1的插入片段的cDNA序列和推出的氨基酸序列，其中引物序列，BH(b)C和BH(b)D用黑體字表示，5′-3′方向用箭頭表示；圖12顯示來(lái)自質(zhì)粒pBrhTX-1(b)b的亞基pBrhTX-1(b)的推想的cDNA序列和推出的氨基酸序列；圖13顯示具有成熟多肽的亞基BrhTX-1(b)的推想的cDNA的蛋白質(zhì)翻譯以下劃線表示；圖14顯示亞基BrhTX-1(b)的共用的cDNA序列和推出的氨基酸序列；圖15顯示來(lái)自亞基BrhTX-1(c)的肽片段和它們推測(cè)的編碼序列；圖16顯示使用引物BH(c)A和BH(c)B獲得的亞基BrhTX-1(c)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列；圖17顯示亞基BrhTX-1(c)的cDNA序列和推出的氨基酸序列。實(shí)施例lBrhTX-1和BrhTX-2的分離和鑒定材料和方法(i)昆蟲(chóng)在25℃，光照期16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗下，將建立的麥蛾繭蜂(從DrRTArbogast獲得，USDA-ARS，P.O.BOX22909，Savannah，Georgia，USA)群體飼養(yǎng)在印度谷螟(Plodiainterpunctella)幼蟲(chóng)上。印度谷螟和大蠟螟幼蟲(chóng)從共同資源科學(xué)和工業(yè)研究公司，昆蟲(chóng)學(xué)部的已建立的群體獲得，并在25℃下，對(duì)于大蠟螟用由600g稻粉幼嫩谷物，60g啤酒酵母，125ml蜂蜜和125ml甘油組成的飼料，對(duì)于印度谷螟，為由1000g豆粉，500g糠，250g干酵母，250g小麥幼芽，500g敲碎的小麥，500g輾壓的燕麥和375g甘油組成的飼料來(lái)喂養(yǎng)。(ii)毒素活性的生物測(cè)定通常使用大蠟螟幼蟲(chóng)來(lái)確定麥蛾繭蜂蛋白制品中的麻醉活性。用于生物分析的幼蟲(chóng)的年齡和生長(zhǎng)狀況不確定，然而，僅使用重量在0.15g至0.2g之間的幼蟲(chóng)。通過(guò)在腹足之間將要使用的10μl蛋白質(zhì)樣品，或?qū)φ站彌_液注射至血腔中來(lái)進(jìn)行生物分析。如果除非驅(qū)使幼蟲(chóng)，否則它們不移動(dòng)并且在將它們翻過(guò)來(lái)后在30秒內(nèi)不能恢復(fù)正常的話則來(lái)計(jì)算麻醉。通過(guò)使用終點(diǎn)分析法易于毒素的精確監(jiān)測(cè)，在該方法中分析試驗(yàn)提取物一系列稀釋度的活性。使用GalleriaUnit(GU)(Drenth(1974)Toxicon，12，198-192)方法的修改測(cè)定麻醉活性。通過(guò)計(jì)算在注射后約2小時(shí)導(dǎo)致幼蟲(chóng)麻醉的提取物稀釋度的倒數(shù)來(lái)確定在10μl注射提取物中GU的數(shù)目。接著將該值乘以100而獲得GU/ml提取物的數(shù)目。(iii)毒液腺成分的提取在4℃下將雌胡蜂麻醉，接著置于冰上，同時(shí)用細(xì)鑷子輕輕牽拉產(chǎn)卵器來(lái)提取它們的毒液腺。50個(gè)毒液腺中的多數(shù)被提取至50μl用0.02％疊氮化鈉配制的，含有蛋白酶抑制劑EDTA(乙二胺四乙酸，二鈉鹽)(5mM)，抑蛋白酶肽(5mM)，和胃蛋白酶抑制劑(0.1μg/ml)的等滲Pringle’s鹽溶液。蛋白酶抑制劑從Boerhringer-Mannheim獲得。使用微量勻漿器用手將腺體勻漿，在Eppendorfmicrofuge中以14.000rpm轉(zhuǎn)速離心5分鐘，將不溶物沉淀。接著用0.22μmultrafree-mC濾器(Millpore，Bedford，MA)過(guò)濾含有毒素的上清。(iv)蛋白質(zhì)的測(cè)定及濃度用從Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室獲得的蛋白質(zhì)分析盒，使用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。按照制造商的建議使用Ultrafree-MC濃縮裝置(Millipore)濃縮蛋白質(zhì)樣品。(v)聚丙烯酰胺凝膠電泳和陰離子交換層析聚丙烯酰胺凝膠電泳(下文稱為PAGE)儀和試劑，PAGE和凝膠過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物以及銀染試劑均可購(gòu)自Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室。如Laemmli(1970)自然，222，680-685所描述的使用15％/平板膠(11cm×14cm×0.075cm)和4％堆積膠來(lái)進(jìn)行變性的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。在蛋白質(zhì)樣品中加入0.125mMTris-HCl[pH6.8]，10％甘油，10％SDS(+二烷基磺酸鈉)，0.25％β-巰基乙醇，0.025％溴酚蘭，并在上樣至凝膠前，在95-100℃下加熱5分鐘。用200V電壓分離蛋白質(zhì)，直至溴酚蘭指標(biāo)染料到達(dá)凝膠底部(約45分鐘)。用考馬斯蘭(從Gradipore獲得)染色2小時(shí)，接著在蒸餾水中過(guò)夜去掉染色或用銀染來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)。通過(guò)與下面標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分子量比較來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)的分子量免肌肉磷酸化酶b(97,400Da)；牛血清白蛋白(66,200Da)；卵清蛋白(45,000Da)；牛碳酸酐酶(31,000Da)；大豆胰蛋白酶抑制劑(21,500Da)；溶菌酶(14,400Da)。在4％堆積膠的7.5％聚丙烯酰胺平板膠(11cm×14cm×0.075cm)上進(jìn)行非變性的自然PAGE。按SDS-PAGE凝膠相同的方式，除開(kāi)不將SDS加入到凝膠或電泳緩沖液中之外來(lái)制備自然的凝膠。在樣品中加入0.125mMTris-HCl[pH6.8]，10％甘油，在上樣至凝膠前不加熱。4℃下，用200V電壓將電泳進(jìn)行1.5小時(shí)。使用自然的PAGE實(shí)現(xiàn)可溶性毒液腺蛋白的初步分離。將600只的毒液腺的提取物上樣至每一條凝膠中。電泳后，將凝膠水平地分成4mm的條，4℃下，在600μl50mMTris-HCl[pH8.0]中輕輕搖晃16小時(shí)將蛋白從凝膠切片上被動(dòng)地洗脫下來(lái)。用50mMTris-HCl[pH8.0]將每一洗脫液的等分試樣稀釋50倍，如上所述分析大蠟螟中的麻醉活性。使用SMART層析系統(tǒng)(Pharmacia)，在陰離子交換柱，即MiniQ(PC，3.2mm×3cm，Pharmacia)上進(jìn)一步純化麻醉活性。上柱之前，將含有麻醉活性的自然PAGE洗脫液通過(guò)0.22μm的濾器。柱用50mMTris-HCl[pH8.0]平衡，使用0-1MNaCl的線性梯度以200μl/分鐘的流速洗脫蛋白質(zhì)。收集200μl級(jí)份進(jìn)行麻醉活性的分析。再將具有麻醉活性的級(jí)份通過(guò)SDS-PAGE來(lái)分析。(vi)凝膠過(guò)濾層析為了估測(cè)天然麻醉毒素的分子量，將50μl具有麻醉活性的自然PAGE洗脫液加到凝膠過(guò)濾柱上，即已預(yù)先用下列標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的Superose12(PC，3.2mm×30cm，Pharmacia)甲狀腺球蛋白(670,000Da)；γ球蛋白(158,000Da)；卵清蛋白(44,400Da)；肌紅蛋白(17,000Da)維生素B12(1,350Da)。柱已預(yù)先用50mMTris-HCl[pH8.0]，150mMNaCl平衡，蛋白質(zhì)被用相同的緩沖液以40μl/分鐘的流速洗脫。通過(guò)監(jiān)測(cè)280nm處洗脫液的光吸收來(lái)檢測(cè)從柱上洗脫的蛋白質(zhì)。收集40μl級(jí)份，并在用于麻醉活性分析之前用50mMTris-HCl[pH8.0]稀釋20倍。結(jié)果(i)起始物質(zhì)的選擇由于成年麥蛾繭蜂個(gè)體小(2-3mm)以及毒液腺相應(yīng)更微小，我們起初檢測(cè)是整個(gè)胡蜂還是分離的毒液腺產(chǎn)生用于神經(jīng)毒素分離的最適宜的起始物質(zhì)。分析了25只完整雌性胡蜂或分離毒液腺的三個(gè)標(biāo)本的蛋白質(zhì)含量和麻醉活性(GUs)。結(jié)果表明兩種標(biāo)本均擁有類(lèi)似的毒性活性(約25,000GUs)，但如下表1所示完整雌胡蜂的提取物具有比分離的毒液腺的提取物高10倍的可溶性蛋白質(zhì)濃度。這表明兩點(diǎn)觀察到的神經(jīng)毒性活性與可溶性毒液腺成分有關(guān)；并且毒液腺提取物產(chǎn)生10倍富集的神經(jīng)毒素。腺體被用作神經(jīng)毒素純化的起始物質(zhì)。表1aa數(shù)值為每一組為25只胡蜂或毒液腺的3組標(biāo)本的結(jié)果(±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。(ii)聚丙烯酰胺凝膠電泳和陰離子交換層析首先通過(guò)自然PAGE分離可溶性毒液腺提取物。電泳后，將凝膠水平切成4mm的薄片，每一薄片被放置在緩沖液中以通過(guò)被動(dòng)洗脫回收蛋白質(zhì)。神經(jīng)毒性活性通常相當(dāng)分散，被發(fā)現(xiàn)存在于大部分凝膠中。然而，終點(diǎn)分析表明電泳2小時(shí)后，活性主要位于凝膠的開(kāi)始2-3cm處。從凝膠這個(gè)區(qū)域回收的毒素在其后被稱為B-1。毒性活性甚至在延長(zhǎng)的電泳時(shí)間后3-4小時(shí)也沒(méi)有明顯的遷移。用回收毒素注射的大蠟螟的幼蟲(chóng)表現(xiàn)出與神經(jīng)肌肉麻醉一致的中毒癥狀。未觀察到骨骼肌肉活性；然而，可見(jiàn)到口部分能動(dòng)并排放排泄物。偶爾觀察到第二種麻醉活性，在其后被稱為B-2，它遷移稍快于B-1。因?yàn)樵诜窍噜彽哪z薄片中發(fā)現(xiàn)這兩種活性并且可被完全分辨，它們被認(rèn)為是獨(dú)特和單獨(dú)的活性。自然PAGE分級(jí)分離提供了90倍富集的來(lái)自完整胡蜂的B-1神經(jīng)毒性活性，如下表2所示和41％的總的毒性活性的回收。表2a<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="810">純化步驟蛋白質(zhì)(μg)毒性(GU×103)特異活性(GU/μg蛋白)回收(％)純化(倍數(shù))毒液腺提取物772±3b203±4626310010c自然PAGE37±984±342,2704186陰離子交換4133,3337127</table></tables>a數(shù)值從使用自然PAGE分離的每一組為300個(gè)毒液腺的3個(gè)不同組獲得。接著收集自然PAGE制備物用于陰離子交換層析，為了比較，將蛋白質(zhì)和毒素的單位值除以3。b平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差c基于完整雌胡蜂和毒液腺提取物之間的比較的值(見(jiàn)表1)。使用SDS-PAGE對(duì)毒液腺提取物，B-1和B-2的分離示于圖1中。在圖1中，道1對(duì)應(yīng)于毒液腺提取物；道2對(duì)應(yīng)于自然PAGE純化的B-1；道3對(duì)應(yīng)于自然PAGE純化的B-2；道4對(duì)應(yīng)于陰離子交換層析純化的BrhTX-1(約1μg)；道5對(duì)應(yīng)于陰離子交換層析純化的BrhTX-2(約3μg)；和道6對(duì)應(yīng)于分子量標(biāo)記。雖然蛋白質(zhì)分布仍然是復(fù)雜的，但可見(jiàn)分子量為約22,000Da，18,000Da，17,000Da和16,000Da的多肽的帶的特定的富集。在最后的純化步驟中，使用陰離子交換層析進(jìn)一步分級(jí)分離B-1和B-2。當(dāng)分別通過(guò)柱時(shí)，每一活性以約200mMNaCl洗脫，并被限制為與圖2中所示的B-1的一個(gè)清晰層析峰有關(guān)的單一級(jí)份，圖2顯示上柱的含有B-1的自然PAGE洗脫液的層析分析。在級(jí)份No.9發(fā)現(xiàn)所有麻醉活性。收集的級(jí)份的生物分析表明B-1和B-2的可測(cè)定的麻醉活性存在于這一單一級(jí)份中。自然PAGE與陰離子交換層析的結(jié)合從完整胡蜂中將B-1活性純化了126倍，起始毒性活性總回收為7％。在還原條件使用SDS-PAGE對(duì)陰離子交換層析純化的B-1和B-2分析表明兩種活性看來(lái)類(lèi)似，均解離為四種多肽，下文稱為B-1的亞基BrhTX-1(a)，BrhTX-1(b)，BrhTX-1(c)和BrhTX-1(d)，B-2的亞基BrhTX-2(e)，BrhTX-2(f)，BrhTX-2(g)，和BrhTX-2(h)。純化的毒素稱為繭蜂毒素-1(BrhTX-1)和繭蜂毒素-2(BrhTX-2)。在純化的這個(gè)階段，BrhTX-1相當(dāng)于來(lái)自毒液腺提取物的可溶性蛋白質(zhì)的約0.5％更尤其是，這些技術(shù)表明BrhTX-1的多肽BrhTX-1(a)，BrhTX-1(b)，BrhTX-1(c)和BrhTX-1(d)分別具有估測(cè)的分子量15,000Da，17,000Da，21,000Da和34,000Da。BrhTX-2的多肽BrhTX-2(e)，BrhTX-2(f)，BrhTX-2(g)和BrhTX-2(h)分別具有估測(cè)的分子量17,000Da，18,500Da，21,000Da和34,000Da。(iii)凝膠過(guò)濾層析使用SDS-PAGE從四種解離的多肽計(jì)算出的BrhTX-1和BrhTX-2預(yù)計(jì)的分子量分別為87,000Da和90,500Da。為了確定BrhTX-1和BrhTX-2的天然分子量，天然PAGE級(jí)份在Superose12凝膠過(guò)濾柱上被分離。大部分毒性活性被洗脫在相當(dāng)于層析譜中的單一主峰的兩個(gè)級(jí)份中。BrhTX-1的結(jié)果示于圖3中。該圖顯示BrhTX-1的大小分級(jí)分離層析；畫(huà)陰影線的峰表示含麻醉活性的級(jí)份。使用來(lái)自蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的用于校準(zhǔn)柱的標(biāo)準(zhǔn)曲線，BrhTX-1的天然毒素被計(jì)算出具有約為81,000Da的分子量，如圖4所示。更詳細(xì)地計(jì)算了每一標(biāo)準(zhǔn)的Kav，并畫(huà)出了對(duì)蛋白質(zhì)分子量的曲線。運(yùn)用毒性活性的Kav和作為標(biāo)準(zhǔn)的回歸線的斜率和截距(r2＝0.98)，計(jì)算出麻醉活性物質(zhì)的分子量。BrhTX-2也被計(jì)算出約為81,000Da。(iv)BrhTX-1二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析在非還原和還原條件下，使用SDS-PAGE研究BrhTX-1的二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果示于圖5，其中道1相當(dāng)于在缺乏還原劑時(shí)，使用SDS-PAGE分級(jí)分離的BrhTX-1；道2相當(dāng)于道1中相同的但已置于3％β-巰基乙醇的樣品。如圖5所示，多肽(a)和(b)的遷移基本不受存在或缺乏還原劑的影響。雖然在非還原條件下，多肽(b)看來(lái)以雙聯(lián)體的形式存在。相反，在非還原條件下，未見(jiàn)到多肽(c)和(d)，而出現(xiàn)一明顯的約為45,000Da的新的多肽。相反地，當(dāng)在還原條件下，使用SDS-PAGE再進(jìn)行分級(jí)分離時(shí)，這條帶解離成34,000Da和21,000Da的二條多肽(數(shù)據(jù)未顯示)。這表明多肽(c)和(b)借助于分子外或分子內(nèi)二硫鍵交聯(lián)，這尤其令人感興趣，因?yàn)樵缙诘难芯?，例如Visser等(1983)比較生物化學(xué)生理學(xué)，B75B，523-538已表明當(dāng)毒液置于還原劑DTT和BME中時(shí)，麥蛾繭蜂麻醉活性喪失。討論對(duì)25個(gè)毒液腺和25只完整雌胡蜂的提取物的定量研究表明各自含有平均為13,500單位的麻醉活性(GUs)。這支持了在大蠟螟生物分析中鑒定的毒性活性物質(zhì)與可溶性毒液腺內(nèi)含物有關(guān)這一假說(shuō)。為了純化該麻醉劑，毒液腺提取物被首先使用天然PAGE進(jìn)行分級(jí)分離。在采用的電泳條件下，毒性活性物質(zhì)沒(méi)有迅速遷移。由于天然PAGE利用電荷及大小進(jìn)行分離，這表明毒性活性物質(zhì)具有總的正電荷和/或高的分子量?？磥?lái)在分子量上僅有3,500Da的不同的兩種不同活性物質(zhì)的分離表明電荷是毒素遷移比例的主要決定因素。B-1的陰離子交換層析產(chǎn)生了單一蛋白質(zhì)。這一純化的制備物(BrhTX-1)代表了存在毒液腺和大概完整的雌胡蜂中的起始麻醉活性物質(zhì)的7％和可溶性毒液腺蛋白的0.5％。毒性活性物質(zhì)總的富集為127倍，產(chǎn)生了比活為3,333單位毒性活性物質(zhì)/μg蛋白質(zhì)的制備物。這里報(bào)道的數(shù)據(jù)提供了我們已純化出兩種寡聚體毒素BrhTX-1和BrhTX-2的證據(jù)，它們?cè)谔烊籔AGE或溫和層析條件下不發(fā)生解離。這兩種毒素由四種可使用SDS-PAG分離的多肽組成。而且，在還原和非還原條件下，使用SDS-PAGE對(duì)BrhTX-1的分離表明兩個(gè)亞基，BrhTX-1(c)和BrhTX-1(d)借助二硫鍵相連。實(shí)施例2-BrhTX-1的序列分析(i)蛋白質(zhì)純化使用天然PAGE和SMART體系中的陰離子交換層析純化45,000個(gè)腺體，產(chǎn)生300μgBrhTX-1。當(dāng)使用SDS-PAGE，接著銀染分析時(shí)，毒素基本上是均一的，由四種多肽-BrhTX-1(a)，BrhTX-1(b)，BrhTX-1(c)和BrhTX-1(d)組成。最終制備物的比活為3,250,000GUs/mg蛋白質(zhì)。而且，通過(guò)這一數(shù)據(jù)可以計(jì)算出0.3ng純化的毒素可完全麻醉重量為0.2g的大蠟螟幼蟲(chóng)。比活值還使得可以將該毒素與來(lái)自虱狀蒲螨(Pyemotestritici)的毒素進(jìn)行比較。已報(bào)道的虱狀蒲螨毒素的麻醉劑量為330-550μg/kg大蠟螟幼蟲(chóng)。BrhTX-1具有約2μg/kg大蠟螟幼蟲(chóng)的麻醉劑量，BrhTX-1被發(fā)現(xiàn)在4℃時(shí)非常穩(wěn)定，甚至在數(shù)周后，仍存在大于90％的活性。(ii)序列分析使用SDS-PAGE，接著通過(guò)在室溫下在10mMCaps(兼性離子緩沖液)[pH11.0]/60mAmps的10％甲醇中電轉(zhuǎn)移1小時(shí)將約200μgBrhTX-1毒素分離成亞基。將分離的亞基電泳印跡到PVDF(聚偏氟乙烯)膜上。轉(zhuǎn)移后，將印跡在Milli-Q水中漂洗1小時(shí)，接著真空干燥。通過(guò)在0.0005％硫氰酸胺B(可以Sigma購(gòu)得)的30％甲醇/0.2％乙酸溶液中染色約30秒，接著在水中脫色可肉眼觀察到蛋白帶。少量毒素，約10μg最初被用于尋找最佳印跡條件，此后，制備150μg毒素用于序列分析。使用ABI477A蛋白質(zhì)序列測(cè)定系統(tǒng)(來(lái)自AppliedBiosystems)。在BrhTX-1(a)，BrhTX-1(b)和BrhTX-1(c)的序列測(cè)定中遇到了問(wèn)題；明顯地，2或3次循環(huán)之后，來(lái)自氨基酸分析儀的清晰可檢測(cè)的信號(hào)消滅，這說(shuō)明在序列分析過(guò)程中大量的該蛋白被從膜上除去。這個(gè)問(wèn)題通過(guò)對(duì)膜使用更大濃度的蛋白質(zhì)得到解決。得到如圖6所示的所有四種亞基氨基末端序列(*表明在氨基酸序列的同一性中存在一些錯(cuò)讀的氨基酸殘基)。對(duì)于亞基BrhTX-1(a)，序列信息也示于SequenceIDNO.1；對(duì)于亞基BrhTX-1(b)為SequenceIDNO.2；對(duì)于亞基BrhTX-1(c)為SequenceIDNO.3，和對(duì)于亞基BrhTX-1(d)為SequenceIDNO.4。(iii)亞基結(jié)構(gòu)研究毒素活性被發(fā)現(xiàn)與來(lái)自14,000Da和18,000Da之間的BrhTX-1的小的多肽有關(guān)，該小的多肽已使用含有TritonX-100的天然PAGE進(jìn)行了分離。從上樣的總共約30,000GU中從凝膠中回收約1,500GU。雖然這僅代表加到凝膠中的總活性的約5％，但相當(dāng)大量的活性很快遷移到了凝膠中。這些結(jié)果說(shuō)明該亞基具有相當(dāng)大的活性。(iv)Western印跡分析通過(guò)使用上述直接蛋白質(zhì)序列測(cè)定可制得的N-末端序列(圖6和分別為SequenceIDNos1，3和4)來(lái)產(chǎn)生抗BrhTX-1(a)，BrhTX-1(c)和BrhTX-1(d)亞基的抗體。這些抗體如下面提到的由ChironMimitopes(Clayton，Victoria)商業(yè)生產(chǎn)。合成肽被生產(chǎn)來(lái)匹配可獲得的序列，并被接至白喉毒素載體上。接著用這些結(jié)合物來(lái)免疫三個(gè)獨(dú)立的新西蘭白兔。將兔用在弗氏完全佐劑中的0.39mg肽來(lái)進(jìn)行肌肉內(nèi)免疫。第一次免疫完成后，將兔用套管從耳緣靜脈中放血，并隨后在14，35和42天時(shí)再放血。通過(guò)將血在37℃溫育30分鐘，接著在通過(guò)低速了除去細(xì)胞物質(zhì)之前，在冰上冷卻15小時(shí)來(lái)制備血清。將血清貯存于-20℃。在ELISA中滴定抗免疫肽，白喉毒素和親和素的生物素標(biāo)記的衍生物的所有粗抗血清。在這些滴定實(shí)驗(yàn)中，ELISA平板用親和素覆蓋，從而生物素標(biāo)記的肽和試驗(yàn)的抗體與它結(jié)合。使用與辣根過(guò)氧化物酶連接的抗兔IgG血清將抗體定量。使用抗各種亞基的最高滴定度的血清，進(jìn)行抗被前述的SDS-PAGE分離成其組成亞基的純化BrhTX-1的Western印跡。電泳之后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上(Biorad，Hercules，Ca)。使用由SDS-PAG分離的10μl純化的BrhTX-1(約8μg)，獲得針對(duì)所有三種試驗(yàn)血清的相關(guān)亞基的特定反應(yīng)。(v)肽/消化序列測(cè)定通過(guò)前述的SDS-PAGE將約800μgBrhTX-1分離成它的組成亞基。電泳后，用考馬斯亮蘭染色在凝膠中可見(jiàn)亞基。接著從凝膠中切下對(duì)應(yīng)于各亞基的帶，通過(guò)在含有0.2M碳酸氫銨，0.02％Tween-20的緩沖液中洗滌兩次將SDS從凝膠中洗脫。接著加入0.5μg序列測(cè)定級(jí)胰蛋白酶(Promega，Madison，WI)，通過(guò)加入約20μ(0.2M碳酸氫銨將凝膠充分再水合。隨后將凝膠片轉(zhuǎn)移至microfuge管中，用0.2M碳酸氫銨，0.02％Tween-20覆蓋，30℃保溫過(guò)夜。通過(guò)加入1/10體積的10％W/V三氟乙酸中止反應(yīng)。消化后，通過(guò)在30℃下，在100μl0.1％W/V三氟乙酸的60％乙腈溶液中提取40分鐘將產(chǎn)生的肽從凝膠中洗脫下來(lái)。通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(Hetovac(Heto)Scandinavia將產(chǎn)生的上清液減小到最終體積為20μl。通過(guò)使用μRPC(2/C18SC2.11/10柱的SMART系統(tǒng)中的反相層析分離多肽。通過(guò)使用0.065％三氟乙酸和0.05％三氟乙酸的40％乙腈緩沖液在柱上形成梯度。使用“峰分級(jí)分離”操作收集級(jí)份。接著將來(lái)自層析步驟的各峰進(jìn)行質(zhì)譜法(Tofspec，F(xiàn)isonsInstruments)以確定回收的肽的大小。使用Porcise-HT序列分析儀(AppliedBiosystems)對(duì)各峰進(jìn)行序列測(cè)定。對(duì)從BrhTX-1的亞基獲得的胰蛋白酶片段的序列的總結(jié)列于下面表3中。表3亞基所測(cè)序的片段的總數(shù)所得序列1BrhTX-1(d)5INI(O/R)VAQIVTYYLDS(I/H)KBrhTX-1(c)6GIAQDVGHAAHSFTK(H/G)VHNPGNFRBrhTX-1(b)5MIKPGETYGDVTNKEWVHDNAGTLLPRDVHDNAGTLLPRPHTVYDKHESLQBrhTX-1(a)4FNPETHREAYIQNHGA</table></tables>1在獲得的序列中存在錯(cuò)讀處，可能的選擇示于被斜線(/)分開(kāi)的括號(hào)中。實(shí)施例3-BrhTX-1亞基的克隆cDNA文庫(kù)的產(chǎn)生和文庫(kù)的平板接種從新近出現(xiàn)的麥蛾繭蜂雌蟲(chóng)中分離全部RNA，在液氮中凝固并置于-70℃。為了分離全部RNA，在液氮中將約1g凝固的胡蜂磨成粉末。再將粉末在20ml8M氯化胍中用手持勻漿器勻漿。用10,000×g離心10分鐘去除大片段的不溶物質(zhì)，在存在32％v/v乙醇時(shí)沉淀全部RNA。如Sambrook等(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港出版社中描述的進(jìn)行全部RNA隨后的純化。按生產(chǎn)商的說(shuō)明，使用從PharmaciaBiotech(Uppsala，Sweden)獲得的寡(dT)-纖維素自旋柱從全部RNA中分離mRNA。約5μgmRNA被用于cDNA合成。將EcoRI/Not接頭連接到平端雙鏈cDNA上，連接到EcoRI消化的λgt11DNA中，并且將其轉(zhuǎn)化到商業(yè)可購(gòu)得的大腸桿菌Y1090中，隨后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)擴(kuò)增。在通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行文庫(kù)的篩選(Sambrook1989)之前使用從商業(yè)可購(gòu)得的大腸桿菌LE392菌株制備的平板接種細(xì)胞來(lái)進(jìn)行滴定。文庫(kù)的效價(jià)為1.25×109pfu/ml。為了篩選500,000pfu，以每平板約50,000噬菌斑的量接種10個(gè)140mm培養(yǎng)皿。使用標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook1989)一次三份地將生成的噬菌斑轉(zhuǎn)移到Hybond-N膜上(AmershamInternational).實(shí)施例4-BrhTX-1亞基的克隆(i)探針的制備設(shè)計(jì)編碼至少BrhTX-1(a)N末端序列一部分的三個(gè)庫(kù)的簡(jiǎn)并寡核苷酸，稱為BH(a)A，BH(a)B和BH(a)I。由“I”代表的肌苷用于存在完全簡(jiǎn)并性的地方。這些寡核苷酸示于圖7中以及還有SequenceIDNos.5，6和7(其中肌苷用“N”表示)中。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法在AppliedBiosystems380BDNA合成儀上合成寡核苷酸，在55℃下，各寡核苷酸被脫保護(hù)16小時(shí)，接著被分至三個(gè)螺絲帽聚丙烯微離心管中。真空干燥，將三分之一的各種寡核苷酸溶解在100μlH2O中，用紫外光譜定量，1OD260/ml等于25μg/ml。(ii)文庫(kù)的篩選和克隆的分離用一種寡核苷酸，BH(a)A，BH(a)B或BH(a)I對(duì)每組濾器進(jìn)行探測(cè)。通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook1989)，用32P-ATP(AmershamInternational)和T4多核苷酸激酶(NorthumbriaBiologicalsLtd)進(jìn)行5’磷酸化來(lái)標(biāo)記25ng各種寡核苷酸。37℃下，保溫30分鐘。45℃下，在5×SSPE(20×SSPE3.6MNaCl，0.2MNaH2PO4，0.02MEDTA[pH7.7])，5×Denhardt’s試劑[50×Denhardt’s試劑5gFicoll(400型，Pharmacia)，5g聚乙烯基吡咯烷酮，5g牛血清白蛋白(FractionV，Sigma)，0.5％SDS和200μg/ml鮭魚(yú)精子DNA中，將濾器預(yù)雜交2小時(shí)。45℃下，在5×SSPE，5×Denhardt’s試劑，0.5％SDS加上標(biāo)記的探針中將雜交進(jìn)行16小時(shí)。45℃下，將濾器在6×SSC，0.1％SDS中洗滌4×15分鐘，在-80℃下，曝光于具增感屏的KodakX-AR膠片。三個(gè)噬菌斑與BH(a)A和BH(a)I雜交，一個(gè)噬菌斑與BH(a)B和BH(a)I雜交。沒(méi)有噬菌斑與所有三種探針雜交。在隨后的三輪噬菌斑純化之后，四個(gè)噬菌斑中的三個(gè)被純化均一，并繼續(xù)顯示出與BH(a)I雜交。將噬菌體噬菌斑放入1mlSM緩沖液(50mMTris-HCl[pH7.5]，0.1MNaCl，0.2％(w/v)MgSO4·7H2O，0.01％(w/v)明膠)加上10μl氯仿中。(iii)克隆的特征描述噬菌斑純化噬菌體通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(下文稱PCR)分析被用于篩選cDNA插入片段的存在大小。使用如下所示兩個(gè)寡核苷酸，λgt11正向和λgt11反向，它們分別示于SequenceIDNos.8和9。這些寡核苷酸對(duì)λgt11具有特異性，位于EcoRI克隆位點(diǎn)的旁側(cè)。λgt11正向5′-GACTCCTGGAGCCCG-3’λgt11反向5′-TTGACACCAGACCAACTGGTAATG-3’在0.5ml聚丙烯微量離心管中，使用25mol各種濃縮引物，0.5μl噬菌體貯液，8μlUltrapuredNTPs(Pharmacia)，每種均為1.23mM，2.5μl500mMKCl，100mMTris[pH8.4]，15mMMgCl2，0.1％(w/v)明膠和0.2μl(1U)TaqDNA聚合酶(Perkin/ElmerCetus)進(jìn)行PCR反應(yīng)。加入一滴輕礦物油。將管置于TechnePHC-1ProgrammableDri-block中，并經(jīng)歷下列溫度狀態(tài)94℃下5秒；94℃下1秒；40℃下2秒；72℃下3秒(35次)接著為72℃下的最后7秒的保溫階段。用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)10μl各種反應(yīng)液進(jìn)行分析。所有三種貯液產(chǎn)生表明下列cDNA插入片段大小的PCR擴(kuò)增片段λ片段大小的PCR擴(kuò)增片段λBrhTX-1(a)1.1-約600堿基對(duì)(bp)；λBrhTX-1(a)1.2-約620bp；和λBrhTX-1(a)1.3-約590bp。(iv)亞克隆和克隆的序列測(cè)定使用GrossbergerD(1987)核酸研究，15(10)，6737的方法進(jìn)行噬菌體DNA的制備。cDNA插入片段從λBrhTX-1(a)1.1和λBrhTX-1(a)1.2的EcoRI消化來(lái)釋放。來(lái)自λBrhTX-1(a)1.3的cDNA沒(méi)有被釋放，這可能表明在最初文庫(kù)構(gòu)建中EcoRI位點(diǎn)沒(méi)有被再造。在適宜的緩沖條件下(Sambrook，1989)，用T4DNA連接酶將兩個(gè)釋放的插入片段分別連接到EcoRI消化的，磷酸酶處理的質(zhì)粒pUC19上。在標(biāo)準(zhǔn)條件下(Sambrook，1989)，連接混合物被用于轉(zhuǎn)化適宜的商業(yè)上可購(gòu)得的大腸桿菌DH5α細(xì)胞。在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體，稱為pBrhTX-1(a)1.1和pBrhTX-1(a)1.2。使用Sequenase試劑盒(USB，Cleveland，Ohio)和下面所示并列于SequenceIDNos.10至18的9種合成寡引物。PUC45’-GCTGATGTGCTGCAAGGCGATTAAG-3’PUC15’-TTCACAGAGGAAACAGCTATGAC-3’BH(a)F15’-TCGTGAAGTGAAGAATTA-3’BH(a)F25’-AATGTGTTTGCACTCACG-3’BH(a)F35’-CATATACAGCGAAGTACC-3’BH(a)F45’-TTATATGAAGTTCTTAGA-3’BH(a)R15’-GGCGCAATAATTCTTCAC-3’BH(a)R25’-TAACTATGGGATTCTTAG-3’BH(a)R35’-ATATTTAAAGCCTCCCGC-3’兩種引物，即PUC4和PUC1位于mcs旁側(cè)的pUC19的區(qū)域雜交。使用由初始PUC4和PUC1序列測(cè)定操作產(chǎn)生的序列數(shù)據(jù)來(lái)設(shè)計(jì)其它引物。獲得的核苷酸序列示在SequenceIDNo.19。核苷酸序列的翻譯產(chǎn)生了125個(gè)氨基酸的開(kāi)放讀框(下文稱為ORF)。這個(gè)推斷的氨基酸序列示于SequenceIDNo.20。氨基酸17-36相當(dāng)于示于SequenceIDNo.1的亞基的N-末端序列。氨基酸1至16具有蛋白質(zhì)輸出信號(hào)序列的特點(diǎn)。這個(gè)核苷酸序列及相應(yīng)的氨基酸序列示于圖8中。(v)克隆的分析肽消化/序列測(cè)定-將使用肽消化方法獲得的序列與從cDNA推斷的氨基酸翻譯產(chǎn)物排序的結(jié)果列于下面肽序列FNPETHRcDNA序列FNPETHR肽序列EAYIQNHGAcDNA序列EACIQNHGA在第二種排序中的明顯的異?？捎砂腚装彼岬臋z測(cè)是不可靠的這一事實(shí)來(lái)解釋。基因組Southern印跡通過(guò)下面的方法從麥蛾繭蜂雄性和雌性成蟲(chóng)中制備基因組DNA。在500μlLifton溶液(0.2M蔗糖，0.05MEDTA，0.5MSDS，0.1MTris-HClpH9.0)中將約0.1g冷凍的麥蛾繭蜂輕輕均漿。當(dāng)大部分物質(zhì)被破碎時(shí)，再加入500μlLifton溶液，攪拌勻漿液直至組織停止凝集。在加入250μl0.6M乙酸鹽之前將勻漿液在65℃下保溫30分鐘。接著輕輕混合該溶液并置于冰上1小時(shí)。通過(guò)4℃下，在半敞開(kāi)離心機(jī)中以10,000rpm離心10分鐘去除大的顆粒物質(zhì)，接著將上清依次用等體積苯酚(用TE飽和)，苯酚/氯仿∶異戊醇(24∶1)(IAC)和IAC提取。將RNAseA加入到最終濃度為10μg/ml的提取物中，37℃下保溫15分鐘。接著將2倍體積的乙醇加入該溶液中，室溫下，在半敞開(kāi)離心機(jī)中以8,000rpm離心15分鐘沉淀DNA。在用80％乙醇洗滌沉淀的DNA并干燥后，將DNA重新懸浮于50μlTE中，用分光光度法測(cè)定DNA濃度。用下面限制酶消化純化的DNAPstI，BclI，AccI，片段通過(guò)在TAE緩沖液中的0.7％瓊脂糖凝膠電泳來(lái)分離。在20×2×SSC梯度上，將DNA印跡到HybondC+(AmershamInternational)硝酸纖維素膜上，通過(guò)在80℃烘烤4小時(shí)將其粘接到膜上。通過(guò)使用引物BH(a)R1和BH(a)R3和質(zhì)?？寺BrhTX-1(a)1.1作為靶DNA的PCR來(lái)合成32P標(biāo)記的cDNA探針。使用下面PCR條件制備探針95℃下，5分鐘；接著95℃下30秒；45℃下1.5分鐘；72℃下1分鐘(5個(gè)循環(huán))；接著95℃下30秒；50℃下1.5分鐘；72℃下1分鐘(5個(gè)循環(huán))；接著72℃下5分鐘。在下面條件下進(jìn)行預(yù)雜交和雜交預(yù)雜交-42℃，在含有6×SSC，5×Denhardt試劑，0.5％SDS，50％甲酰胺，0.1％磷酸鈉和100μg/ml鮭魚(yú)精子DNA(在加入前超聲處理并煮沸)的預(yù)雜交溶液中2小時(shí)。雜交-42℃，在加入32P標(biāo)記的探針的預(yù)雜交溶液中過(guò)夜。在加入至濾器和預(yù)雜交溶液中之前，將探針煮沸并在冰上迅速冷卻。雜交后，42℃，用2×SSC，0.1％SDS將濾器洗滌4次。每次洗滌進(jìn)行15分鐘。洗滌后，將濾器吸干，用粘膜包裹，對(duì)Fuji醫(yī)用膠片曝光。結(jié)果表明僅序列的單拷貝存在于基因組中(1)使用PstI對(duì)基因DNA的消化產(chǎn)生約340bp的單雜交片段；(2)使用BclI的消化產(chǎn)生1400bp的單雜交片段(在探針雜交序列緊接著之后，在cDNA序列中存在BclI位點(diǎn))；和(3)使用AccI的消化產(chǎn)生與cDNA序列中在357bp處存在的AccI位點(diǎn)一致的兩個(gè)雜交片段(見(jiàn)圖8)。實(shí)施例5-BrhTX-1亞基的克隆(i)探針的產(chǎn)生設(shè)計(jì)三個(gè)庫(kù)的簡(jiǎn)并寡聚體，BH(d)A，BH(d)B和BH(d)I。使用肌苷存在全簡(jiǎn)并性。這些寡核苷酸示于圖9和SequenceIDNos.21，22和23，這些寡核苷酸通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法在AppliedBiosystems380BDNA合成儀上合成。在55℃下，將各種寡核苷酸去保護(hù)16小時(shí)，并分至兩個(gè)帶螺絲帽的聚丙烯微離心管中，真空干燥。將各種寡核苷酸的一半溶解在100μl水中，用紫外光譜法定量，1OD260/ml等于25μg/ml。(ii)文庫(kù)的篩選和克隆的分離使用上面對(duì)亞基BrhTX-1(a)所述方法篩選文庫(kù)。七個(gè)噬菌斑與BH(d)I雜交。在連續(xù)三輪的噬菌斑純化后，六個(gè)噬菌斑被純化均一，并仍顯示與BH(d)I雜交。將噬菌體噬菌斑置于lmlSM緩沖液和10μl氯仿中。(iii)克隆的特征鑒定使用上面對(duì)亞基BrhTX-1(a)所述方法篩選和分析噬菌斑純化的噬菌體。六個(gè)噬菌體貯液中的五個(gè)產(chǎn)生了表明下面cDNA插入片段大小的PCR擴(kuò)增片段(也列出了相同起源的噬菌斑的復(fù)制物)。λBrhTX-1(d)1.1-約1200bp；λBrhTX-1(d)1.2-約1200bp；λBrhTX-1(d)2.1-約1200bp；λBrhTX-1(d)3.1-約1800bp；λBrhTX-1(d)3.2-約1800bp；λBrhTX-1(d)3.3-約1800bp；λBrhTX-1(d)3.4-約1800bp；λBrhTX-1(d)4.1-約1200bp；λBrhTX-1(d)4.2-約1200bp；λBrhTX-1(d)4.3-約1200bp；λBrhTX-1(d)5.1-約700bp；(iv)亞克隆和克隆的序列測(cè)定對(duì)于亞基BrhTX-1(a)，使用Grossberger(1987)的方法進(jìn)行噬菌體DNA制備。cDNA插入片段來(lái)自于用EcoRI對(duì)λBrhTX-1(d)1.2，λBrhTX-1(d)3.1，λBrhTX-1(d)3.3，λBrhTX-1(d)3.4和λBrhTX-1(d)4.3的消化。其它插入片段沒(méi)有釋放，這可能表明在起始文庫(kù)構(gòu)建期間沒(méi)有重建EcoRI位點(diǎn)。如對(duì)亞基BrhTX-1(a)所描述的將釋放的插入片段克隆至pUC19的EcoRI位點(diǎn)，并接著轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α細(xì)胞中。如對(duì)亞基BrhTX-1(a)所描述的，使用包括PUC4和PUC1(上面已給出并在SequenceIDNos.10和11中)的十四種合成寡引物對(duì)克隆pλBrhTX-1(d)1.2的插入片段進(jìn)行序列測(cè)定。使用由初始PUC4和PUC1序列測(cè)定操作產(chǎn)生的序列數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)其它十二種引物，并示于下面及SequenceIDNos.24至25BH(d)F15’-CFTCAAATTAGTGTACGA-3’BH(d)F25’-TGTGGCAATGCACAGAAC-3’BH(d)F35’-TCAAGATGCTAGATTGTC-3’BH(d)F45’-TAATAAATGGTCATGATG-3’BH(d)F55’-CGCTTTCAAATAGTCACT-3’BH(d)R15’-ATTCACCATCTGAGCAAT-3’BH(d)R25’-ACACAATTAGCCACTGTC-3’BH(d)R35’-TTGTACTCAGAATGGACT-3’BH(d)R45’-ATGTATGGAGCGATACCA-3’BH(d)R55’-ACATCATGAATTGCCTTG-3’BH(d)R65’-TGTAAATGTGTAGTGGGT-3’BH(d)R75’-GCGAGAAATTCACTATCA-3’獲得的核苷酸序列示于SequenceIDNo.36中。核苷酸序列的翻譯產(chǎn)生275個(gè)氨基酸的ORF。氨基酸23-25相當(dāng)于亞基BrhTX-1(d)的N-末端序列。氨基酸1-22包括一候選的信號(hào)序列。cDNA編碼的成熟蛋白質(zhì)的測(cè)定的分子量為28.2kDa。推斷的氨基酸序列示于SequenceIDNo.37。核苷酸序列和氨基酸序列也示于圖10中。(v)克隆的分析肽消化/序列測(cè)定-方法為上面對(duì)亞基BrhTX-1(a)所描述的方法。獲得的序列與推斷的氨基酸翻譯物的比較列于下面肽序列INI(Q/R)VAQIVTYYLDS(I/H)KcDNA序列GNIKVAQIVTYYLDWIK這些錯(cuò)配可歸于序列測(cè)定的矯作物(artefact)?；蚪MSouthern印跡如前面實(shí)施例4中所描述的制備基因組DNA。將雄蜂和雌蜂DNA的等分試樣用BclI，NdeI，BglII和PstI消化。消化的DNA用TAE緩沖液的0.7％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。接著在2-20×SSC梯度中將DNA印跡制硝酸纖維素膜上(HybondC+；AmershamUK)，通過(guò)在80℃烘烤4小時(shí)將其粘接到膜上。在下面條件下，通過(guò)使用引物BH(d)F4和BH(d)R7和pBrhTX-1(d)1.2，質(zhì)粒DNA作為靶DNA的PCR合成32P標(biāo)記的探針95℃下5分鐘；95℃下30秒；43℃下1.5分鐘；82℃下1分鐘(35個(gè)循環(huán))；接著72℃下5分鐘。雄性和雌性DNA的結(jié)果是相同的。BclI消化產(chǎn)生兩個(gè)雜交片段，一個(gè)為10.0kbp和一個(gè)為9.1kbp。這個(gè)結(jié)果與在cDNA序列的探針雜交區(qū)域存在NdeI位點(diǎn)一致。BglII和Pst消化產(chǎn)生分別為18.5kbp和22.1kbp的單雜交片段，這與在cDNA的探針雜交區(qū)域不存在任何一個(gè)這些位點(diǎn)一致。實(shí)施例6BrhTX-1亞基(b)的克隆(i)探針的制備從SequenceIDNo.2中給出的N-末端序列；設(shè)計(jì)兩個(gè)多種引物。這些探針示于下面及SequenceIDNos.38和39。BH(b)A5′-AC(TCA)TTGTT(TC)AC(TCA)GA(TC)CG(TC)AA-3′BH(b)B5′-GG(ATG)CC(AG)AA(AGT)GT(TC)TT(AG)TC-3′這些引物被用于PCR實(shí)驗(yàn)中以從如上面描述的雌性mRNA合成的cDNA制備PCR產(chǎn)物。0.2μlTaqDNA聚合酶/50μl反應(yīng)的PCR反應(yīng)條件如下95℃下，5分鐘；接著95℃下，30秒，50℃下，1.5分鐘；72℃下，1分鐘(5個(gè)循環(huán))；接著95℃下，30秒；55℃下，1.5分鐘，72℃下，1分鐘(30個(gè)循環(huán))；接著72℃下5分鐘。在TBE緩沖液的15％凝膠的PAGE測(cè)得的該P(yáng)CR產(chǎn)物為約54bp。用溴化乙錠染色在凝膠中可見(jiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物。接著將該片段克隆至商業(yè)上可購(gòu)得的質(zhì)粒pBluescriptSK-的EcoRV位點(diǎn)，該質(zhì)粒使用TaqDNA聚合酶在尾部帶有胸腺嘧啶殘基(T-加尾)。下面條件用于T-加尾70℃下，50mMKCl，10mMTris-HCl[pH8.3]，1.5mMMgCl2，2mMdTTP中2小時(shí)。使用可從AppliedBiosystemsInc購(gòu)得的下面染料引物對(duì)克隆的PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定通用M13-20染料引物5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′M13反向染料引物5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′使用ABI370ADNA分析系統(tǒng)(AppliedBiosystems)進(jìn)行序列測(cè)定。PCR產(chǎn)物的序列示于SequenceIDNo.40及下面。5′-ACCTTGTTTACAGACCGCAAGTGGTGTGGACGTGCCGATAAGACTTTCGGCCC-3′(ii)文庫(kù)的篩選和克隆的分離如上所述進(jìn)行文庫(kù)平板接種，除開(kāi)將產(chǎn)生的噬菌斑一式兩份地轉(zhuǎn)移到Nitropure硝酸纖維素膜上。137mm0.45微米(MicrobSeparations，Westboro，MA，OSA)。在初次篩選中，每一濾器上(總共4個(gè)濾器)篩選到3.6×105噬菌斑，在第二次和第四次篩選時(shí)每一濾器篩選到100-250個(gè)噬菌斑。通過(guò)PCR制備32P標(biāo)記的探針。在存在32P標(biāo)記dATP時(shí)，使用SequenceIDNos.38和39中所示的寡核苷酸BH(b)A和BH(b)B進(jìn)行PCR，帶有SequenceIDNo.40所示序列的PCR產(chǎn)物作為靶。使用下面PCR條件在加入Taq聚合酶之前，95℃上，5分鐘；接著95℃下，30秒；45℃下，1.5分鐘和72℃下，1分鐘(5個(gè)循環(huán))；接著95℃下，30秒；50℃下，1.30分鐘和72℃下，1分鐘(30個(gè)循環(huán))；接著72℃下，5分鐘(1個(gè)循環(huán))。在如亞基BrhTX-1(a)的基因組Southern印跡所述的相同的預(yù)雜交和雜交條件下。將濾器用上述32P標(biāo)記探針進(jìn)行探測(cè)。一開(kāi)始鑒定出了10個(gè)與該探針雜交的噬菌斑。通過(guò)第二輪和第三輪篩選，三個(gè)噬菌體被純化至均一。將噬菌斑純化的噬菌體放入1mlSM緩沖液加上10μl氯仿中。(iii)克隆的特征鑒定通過(guò)使用寡核苷酸λgt11正向和λgt11反向的PCR分析，噬菌斑純化的噬菌體被用來(lái)篩選cDNA插入片段的存在及大小。從通過(guò)將10μl貯液煮沸5分鐘而純化的貯液制備PCR的λDNA。2μlDNA被用于PCR實(shí)驗(yàn)。通過(guò)在TAE緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增的片段進(jìn)行大小測(cè)定，并用已知大小的標(biāo)記進(jìn)行大小測(cè)定。在第三個(gè)純化的噬菌體中，在一個(gè)噬菌體中發(fā)現(xiàn)了約500bp的插入片段，該噬菌體稱為λBrhTX-1(b)。在其它兩個(gè)噬菌斑純化的噬菌體中沒(méi)有檢測(cè)出插入片段。(iv)亞克隆和克隆的序列測(cè)定如Sambrook等(1989)中所描述的，通過(guò)在CsCl的等密度離心純化噬菌體DNA。通過(guò)用NotI消化分離來(lái)自λBrhTX-1(b)1的cDNA插入片段，并將其連接到已用NotI消化并用磷酸酶處理的pBluescriptSK-中。使用ABI染料-引物序列測(cè)定試劑盒(如上所述)對(duì)克隆的插入片段進(jìn)行序列測(cè)定。質(zhì)?？寺?，pBrhTX-1(b)1，插入片段的序列示于序列IDNo.41和圖11中。氨基酸27-44與示于SequenceIDNo.2的N-末端序列的氨基酸匹配，但是由SequenceIDNo.41中的序列編碼的ORF的非常小的表觀大小意味著該克隆被嚴(yán)重平截。我們因此在克隆的5′末端設(shè)計(jì)了ORF的兩個(gè)引物，即BH(b)C和BH(b)D，分別示于SequenceIDNos.42和43。使用這些引物及將pBrhTX-1(b)1.1作為靶，我們?cè)谙旅鏃l件下通過(guò)PCR制備了32P標(biāo)記的探針95℃上，5分鐘；95℃下，30秒；45℃下，1.5分鐘；72℃下，1分鐘(5個(gè)循環(huán))；接著95℃下，30秒；55℃下，1.5分鐘；72℃下1分鐘(5個(gè)循環(huán))；接著72℃下，5分鐘。使用上面描述的條件再次篩選文庫(kù)。通過(guò)三輪噬菌斑純化中至均一性，純化了六種強(qiáng)烈雜交的噬菌斑。通過(guò)用NotI消化從噬菌體中分離cDNA插入片段，并將其連接到已用NotI消化及磷酸酶處理的pBluescriptSK-中。通過(guò)NotI消化及限制片段在TAE緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠中的分離測(cè)定了插入片段的大小。測(cè)定了下面cDNA插入片段的大小λBrhTX-1(b)2-約500bp；和λBrhTX-1(b)3，λBrhTX-1(b)4，λBrhTX-1(b)5和λBrhTX-1(b)6均為約1200bp。使用ABI370ADNA分析系統(tǒng)和前面描述的染料引物對(duì)質(zhì)粒，稱pBrhTX-1(b)6進(jìn)行序列測(cè)定。使用ABI染料-終止子系統(tǒng)結(jié)合BH(b)C，BH(b)D(SequenceIDNos.42和43)引物和兩個(gè)下面所示及示于SequenceIDNos.44和45的另外的引物來(lái)完成序列測(cè)定BH(b)EGTTGTCAATACACCCTGBH(b)FAGAACGAGATGTTATTGTAT獲得的核苷酸序列示在SequenceIDNo.46。核苷酸序列的翻譯物示于SequenceIDNo.47，并產(chǎn)生依賴于所用起始密碼子的182或165個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。可能的蛋白質(zhì)分別具有21或4個(gè)氨基酸的疏水性前導(dǎo)序列，產(chǎn)生161個(gè)氨基酸的成熟多肽。亞基BrhTX-1(b)的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列還示于圖12中，其中推斷ORF示于黑體文中。特別地，cDNA的蛋白質(zhì)翻譯物示于圖13中，其中成熟肽用下劃線表示。(v)克隆的分析肽消化/序列測(cè)定-獲得的序列與推斷的氨基酸翻譯物的比較如下肽序列MIKPGETYGDVTNKEWVHDNAGTLLPRcDNA序列MIKPGETYGDVTNKEWVHDNALLPR肽序列PHTVYDKHESLQDVHDNAGTLLPRcDNA序列PHTVYDKHESLYWVHDNALLPQ末端氨基酸被錯(cuò)誤序列測(cè)定不是不常見(jiàn)的；然而，在兩個(gè)獨(dú)立的情況下被序列測(cè)定的肽序列中的一種包含了特征性的GT氨基酸對(duì)。這些GT對(duì)在被序列測(cè)定的克隆的推測(cè)的ORF中缺乏。因此我們推出克隆pBrhTX-1(b)6包含序列測(cè)定的矯作物或從它而產(chǎn)生的cDNA包含錯(cuò)誤，即在合成/克隆期間，產(chǎn)生了6個(gè)bp的缺失。因此我們通過(guò)PCR重新克隆了包含表觀“GT”對(duì)/缺失的區(qū)域。引物BH(b)E和BH(b)F以及作為靶的cDNA被用于PCR實(shí)驗(yàn)中以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。如前面cDNA文庫(kù)構(gòu)建所描述的(實(shí)施例3)從麥蛾繭蜂雌蟲(chóng)mRNA合成cDNA。接著將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至如前所述已被T-加尾的pBluescript的EcoRV位點(diǎn)。接著對(duì)這些克隆進(jìn)行序列測(cè)定。所有均被發(fā)現(xiàn)異常含有與pBrhTX-1(b)6旁側(cè)表觀GT相同的序列，但具有相當(dāng)于G和T密碼子的另外六個(gè)堿基對(duì)，即GGAACT。從這些數(shù)據(jù)，顯然在cDNA合成/原始λ克隆的克隆期間異常地產(chǎn)生了GT。pBrhTX-1(b)cDNA和推斷的ORF的共有序列示于圖14和SequenceIDNos.48和49。這些序列也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。基因組Southern印跡如前所述進(jìn)行用PstI，EcoRV，AccI和XhoI消化的麥蛾繭蜂雄蜂和雌蜂基因組DNA的Southern印跡。32P標(biāo)記的探針通過(guò)PCR，從pBrhTX-1(b)6的5′區(qū)，使用引物BH(b)C和BH(b)D，在下面條件來(lái)制備95℃下，5分鐘；95℃，30秒；45℃下，1.5分鐘；72℃下，1分鐘(5個(gè)循環(huán))；接著95℃下，30秒；50℃下，1.5分鐘；72℃下1分鐘(5個(gè)循環(huán))；接著72℃下，5分鐘。如前所述用探針進(jìn)行雜交。對(duì)于雄性和雌性DNA結(jié)果相同。在PstI消化中，觀察到13.0kpb和4.1kpb兩條雜交帶。這個(gè)結(jié)果與在cDNA序列的探針雜交區(qū)域存在PstI位點(diǎn)一致。EcoRV，AccI和XhoI消化分別產(chǎn)生3.3kbp，13.0kbp和7.0kbp的單一雜交帶。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，使用引物BH(b)E和BH(b)F，在下面條件下，從pBrhTX-1(b)5克隆的3′區(qū)制備32P標(biāo)記探針95℃下，5分鐘；95℃下，30秒；45℃下，1.5分鐘；72℃下，1分鐘(5個(gè)循環(huán))，接著95℃下，30秒；50℃下，1.5分鐘；72℃下，1分鐘(5個(gè)循環(huán))，接著72℃下，5分鐘。這探針與如前所述的使用用BclI，NdeI，BglII和PstI消化的雄性和雌性基因組DNA而制備的Southern印跡雜交。對(duì)于雄性和雌性DNA結(jié)果相同，用BclI和BglII消化，產(chǎn)生了1.7kbp和9.1kbp的單一雜交帶。雖然這些結(jié)果與在探針雜交區(qū)域存在兩種這樣的位點(diǎn)不一致，即正常預(yù)計(jì)看到兩條雜交帶。兩個(gè)位點(diǎn)與探針區(qū)域的末端相對(duì)很近，用在該實(shí)驗(yàn)中使用的大的探針可很好地避開(kāi)檢測(cè)含有雜交區(qū)域較小部分的片段。在NdeI和PstI消化中，檢測(cè)到2.4和22.2kbp的單一雜交帶。實(shí)施例7.BrhTX-1亞基(c)的克隆示于SequenceIDNO.3中的N-末端序列不足以進(jìn)行PCR操作來(lái)分離編碼它的基因。從而使用上面概述的肽消化方法獲得肽片段。這些肽序列和它們推測(cè)的編碼序列示于圖15(其中“？”代表第一個(gè)氨基酸不確定，括號(hào)中所示的氨基酸為其中存在兩種可能的選擇)，以及SequenceIDNos.50和51中。從這些序列，合成如下所示及SequenceIDNos.52和53中的下列多種引物，BH(c)A和BH(c)BBH(c)A5′-TG(ATG)CC(AGT)AC(AG)TC(AGT)GC-3′BH(c)B5′-GT(TCAG)(CATC)AA(TC)CC(ACT)GG(TAC)AA-3′如上面對(duì)亞基BrhTX-1(b)所述的，使用這些引物，在下面條件下對(duì)麥蛾繭蜂cDNA進(jìn)行PCR；95℃下，5分鐘(1個(gè)循環(huán))，接著95℃下，30秒；45℃下，1分鐘；72℃下，1分鐘(5個(gè)循環(huán))，接著95℃下，30秒；50℃下，1分鐘；72℃下，1分鐘(30個(gè)循環(huán))，接著72℃下，5分鐘(1個(gè)循環(huán))。產(chǎn)生約300bp的PCR產(chǎn)物，將其克隆至T-加尾的pBluescriptSK-中，如上所述進(jìn)行序列測(cè)定。PCR產(chǎn)物的序列示于SequenceIDNo.54和圖16中。(ii)文庫(kù)的篩選和克隆的分離如對(duì)亞基BrhTX-1(b)一樣進(jìn)行文庫(kù)平板接種。使用引物BH(c)A和BH(c)B通過(guò)PCR合成32P標(biāo)記探針，帶有該序列的克隆的PCR產(chǎn)物示于SequenceIDNO.54，其被作為靶DNA。在下面條件下進(jìn)行PCR95℃下，5分鐘(1個(gè)循環(huán))，接著95℃下，30秒；45℃下，1.5分鐘；72℃下，1分鐘(5個(gè)循環(huán))，接著95℃下，30秒；50℃下，1.5分鐘；72℃下，1分鐘(30個(gè)循環(huán))，接著72℃下，5分鐘(1個(gè)循環(huán))如前所述通過(guò)三輪噬菌斑純化將五個(gè)噬菌斑純化均一。(iii)克隆的特征鑒定如前所述使用λGT11正向和反向引物通過(guò)PCR來(lái)測(cè)定cDNA插入片段的大小。測(cè)定了下面插入片段的大小λBrhTX-1(c)1-約690bpλBrhTX-1(c)2-約1,8000bpλBrhTX-1(c)3-約690bpλBrhTX-1(c)4-約700bpλBrhTX-1(c)6-約690bp(iv)亞克隆和克隆的序列測(cè)定通過(guò)如Sambrook等(1989)描述的CsCl等密度離心純化噬菌體DNA。用NotI消化來(lái)釋放來(lái)自λBrhTX-1(c)5的cDNA插入片段，并如前所述將其克隆至pBluescriptSK-的NotI位點(diǎn)。該質(zhì)?？寺》Q為pλBrhTX-1(c)5。如前所述使用ABI染料-引物和ABI染料-終止子序列測(cè)定系統(tǒng)結(jié)合下面引物對(duì)pBrhTX-1(c)5中的插入片段進(jìn)行序列測(cè)定。BH(c)F1CGCTCTGGCAAACACTCTATBH(c)R1GGTGGAGCAAGCAAACTAAA該引物也示于SequenceIDNos.55和56。獲得的核苷酸序列示于SequenceIDNo.57，該cDNA序列的推測(cè)的翻譯物產(chǎn)生145個(gè)氨基酸，估測(cè)的分子量為18.8kDa的ORF，其被示于SequenceIDNo.58。cDNA的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列還示于圖18中。(v)克隆分析肽消化/序列測(cè)定-從BrhTX-1(c)亞基直接獲得的N-末端蛋白質(zhì)序列與從克隆的cDNA推出的氨基酸的比較列于下面肽序列MDDGE--E--MNP--DcDNA序列MDDGETCERCLNPLEL直接蛋白質(zhì)序列后半部分的錯(cuò)配可歸于來(lái)自可獲得的相對(duì)少量的蛋白質(zhì)的序列測(cè)定矯作物，它還引起氨基酸缺失(它在序列測(cè)定中產(chǎn)生難以辨認(rèn)的峰)胰蛋白酶解肽序列與從cDNA推斷的氨基酸序列的比較列在下面肽序列(G/H)VHNPGNFRcDNA序列HVHNPGNFR上面所示的序列末端的不同/錯(cuò)讀可歸于蛋白質(zhì)序列測(cè)定中的矯作物?；蚪MSouthern印跡如前所述對(duì)用BclI，NdeI和BglII消化的雄性和雌性麥蛾繭蜂基因組DNA進(jìn)行Southern印跡。從pBrhTX-1(c)5克隆的5′區(qū)，使用引物BH(c)F1和BH(c)R1在下面條件下通過(guò)PCR產(chǎn)生32P標(biāo)記的探針95℃下，5分鐘；95℃下，30秒；45℃下，1.5分鐘；72℃下，1分鐘(5個(gè)循環(huán))，接著95℃下，30秒；50℃下，1.5分鐘；72℃下，1分鐘(5個(gè)循環(huán))，72℃下，5分鐘；如前所述用探針進(jìn)行雜交。對(duì)于雄性和雌性DNA結(jié)果相同，在BclI消化中，觀察到3.3kbp和1.8kbp的兩條雜交帶，這一結(jié)果與在cDNA序列的探針雜交區(qū)域存在BclI位點(diǎn)一致。在BglII消化中，分別產(chǎn)生3.1kbp，17.6kbp的單雜交帶。序列表中所用符號(hào)的索引符號(hào)組核苷酸AA腺嘌呤CC胞嘧啶GG鳥(niǎo)嘌呤TT胸腺嘧啶(在DNA中)UU尿嘧啶(在RNA中)YC或T(U)嘧啶RA或G嘌呤MA或C氨基KG或T(U)酮基SG或C強(qiáng)的相互作用(3個(gè)氫鍵)WA或T(U)弱的相互作用(2個(gè)氫鍵)HA或C或T(U)非GBG或T(U)或C非AVG或C或A非T或非UDG或A或T(U)非CNG，A，C或T(U)任一種單字符三字符氨基酸AAla丙氨酸RArg精氨酸NAsn天冬酰胺DAsp天冬氨酸CCys半胱氨酸QGln谷氨酰胺EGlu谷氨酸GGly甘氨酸HHis組氨酸IIle異亮氨酸LLeu亮氨酸KLys賴氨酸MMet甲硫氨酸FPhe苯丙氨酸PPro脯氨酸SSer絲氨酸TThr蘇氨酸WTrp色氨酸YTyr酪氨酸VVal纈氨酸BAsx天冬氨酸或天冬酰胺ZGlx谷氨酸或谷氨酰胺XXaa任何氨基酸序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱ZENECALimited(B)街道15StanhopeGate(C)城市倫敦(E)國(guó)家英國(guó)(F)郵編(ZIP)W1Y6LN(A)名稱CommonwealthScientificandIndustrialResearchOrganisation(B)街道407RoyalParade(C)城市Parkville(D)州Victoria(E)國(guó)家澳大利亞(F)郵編(ZIP)3052(ii)發(fā)明名稱新的毒素(iii)序列數(shù)目58(iV)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，版本#1.25(EPO)(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO1PheAsnProGluThrHisArgGluCysLysAsnTyrCysAlaLysGlu151015HisGlyGluGlu20(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO2ThrLeuPheThrAspArgLysTrpSerGlyArgAlaAspLysThrPhe151015GlyPro(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO3MetAspAspGlyGluXaaXaaGluXaaXaaMetAsnProXaaXaaAsp151015(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO4IleIleAsnGlyHisAspAlaThrGluGluGlnPheProProThrAla151015TyrMetThrArgMetAlaArgAsnVal2025(2)SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO5TTYAAYCCNGARACNCAYNGNGA23(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO6GCNAAAGARCASGGNGARGA20(2)SEQIDNO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度59個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO7TTCAACCCNGARACNCACNGNGARNNNAARAACTACNNNGCNAARGARCATGGNGARGA59(2)SEQIDNO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度15個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO8GACTCCTGGAGCCCG15(2)SEQIDNO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO9TTGACACCAGACCAACTGGTAATG24(2)SEQIDNO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO10GCTGATGTGCTGCAAGGCGATTAAG25(2)SEQIDNO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO11TTCACAGAGGAAACAGCTATGAC23(2)SEQIDNO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO12TCGTCAAGTGAAGAATTA18(2)SEQIDNO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO13AATGTGTTTGCACTCACG18(2)SEQIDNO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO14CATATACAGCGAAGTACC18(2)SEQIDNO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO15TTATATGAAGTTCTTAGA18(2)SEQIDNO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO16GGCGCAATAATTCTTCAC18(2)SEQIDNO17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO17TAACTATGGGATTCTTAG18(2)SEQIDNO18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO18ATATTTAAAGCCTCCCGC18(2)SEQIDNO19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度563個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置13..387(xi)序列描述SEQIDNO19TTTGGATAAATCATGAAATTTTTATATCTAATACTCCTTTTAATTGCA48MetLysPheLeuTyrLeuIleLeuLeuLeuIleAla1510GGAGTAGTATCATTCAATCCGGAGACACATCGTGAATGTAAGAATTAT96GlyValValSerPheAsnProGluThrHisArgGluCysLysAsnTyr152025TGCGCCAAAGAGCACGGCGAGGAATATCGTACGTGGTCTTTCCGTTAC144CysAlaLysGluHisGlyGluGluTyrArgThrTrpSerPheArgTyr303540GAACTTGGTGATATTTTTAAATGTGTTTGCACTCACGGAAAGAATCTT192GluLeuGlyAspIlePheLysCysValCysThrHisGlyLysAsnLeu45505560ATGGGAAGCGAGAATTATGGTAAGTGTAGAGAAGCATGTATTCAAAAT240MetGlySerGluAsnTyrGlyLysCysArgGluAlaCysIleGlnAsn657075CATGGAGCGGGAGGCTTTAAATATGCCTTTCCCATATACAGCGAAGTA288HisGlyAlaGlyGlyPheLysTyrAlaPheProIleTyrSerGluVal808590CCAGCATCATGGGCATGCATATCACTCACGAGAAAAATAAGACATTTT336ProAlaSerTrpAlaCysIleSerLeuArgArgLysIleArgHisPhe95100105GTATACATGCTTGCTCAGAAATTCATCACAAGGCCCCACCTAAGAATC384ValTyrMetLeuAlaGlnLysPheIleThrArgProHisLeuArgIle110115120CCATAGTTATGAAAAATGGACAATGCTACTACCAAGATCACAGGGGTGTTGAC437Pro125AGGTATTGTGAAGTTTATATGAAGTTCTTAGATGCGTTGGAATCAATTTAACAATGATCA497AATTCATGTTATCAATGAAGGAAGAATAATGAATTAATAATAATTATCAAAAATCAAAAA557AAAAAA563(2)SEQIDNO20的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度125個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO20MetLysPheLeuTyrLeuIleLeuLeuLeuIleAlaGlyValValSer151015PheAsnProGluThrHisArgGluCysLysAsnTyrCysAlaLysGlu202530HisGlyGluGluTyrArgThrTrpSerPheArgTyrGluLeuGlyAsp354045IlePheLysCysValCysThrHisGlyLysAsnLeuMetGlySerGlu505560AsnTyrGlyLysCysArgGluAlaCysIleGlnAsnHisGlyAlaGly65707580GlyPheLysTyrAlaPheProIleTyrSerGluValProAlaSerTrp859095AlaCysIleSerLeuArgArgLysIleArgHisPheValTyrMetLeu100105110AlaGlnLysPheIleThrArgProHisLeuArgIlePro115120125(2)SEQIDNO21的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO21ATNATNAAYGGNCAYGAYGCNAC23(2)SEQIDNO22的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO22GAYGCNACNGARGARCARTTYCC23(2)SEQIDNO23的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度71個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO23ATNATNAWCGGNCATGWCGCNACNGARCARTTYCCNCCNACNGANTAYATGACNNGNATG60GCNNGNAAYGT71(2)SEQIDNO24的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO24CTTCAAATTAGTGTACGA18(2)SEQIDNO25的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO25TGTGGCAATGCACAGAAC18(2)SEQIDNO26的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO26TCAAGATGCTAGATTGTC18(2)SEQIDNO27的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO27TAATAAATGGTCATGATG18(2)SEQIDNO28的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO28CGCTTTCAAATAGTCACT18(2)SEQIDNO29的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO29ATTCACCATCTGAGCAAT18(2)SEQIDNO30的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO30ACACAATTAGCCACTGTC18(2)SEQIDNO31的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO31TTGTACTCAGAATGGACT18(2)SEQIDNO32的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO32ATGTATGGAGCGATACCA18(2)SEQIDNO33的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO33ACATCATGAATTGCCTTG18(2)SEQIDNO34的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO34TGTAAATGTGTAGTGGGT18(2)SEQIDNO35的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18個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i)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO45AGAACGAGATGTTATTGTAT20(2)SEQIDNO46的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1197個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO46CACGCCTACTTAGATAATTTCTCAATTCTTTGCAAATTATGAAATAAGTGCAAGAGATGT60GTATGACACCTCAATCTGAGTTTGTTCATAATTCGAGAGGGATAAATAAGGAAGTCTCTG120TGTACAAAAGAAAACTACCTCATATAAATCTTGCATTTTTCCGTGAGAGAGAAAAAAAAA180CCCTGAAAAACTGAGTAAGGCAATAATTTTNCCTCATAACAATGTCAATCATATGTAAAA240TAATCTTGTTGGTGCTACTGAGTTGGACATCGATGGTATCGTCAACATTATTTACAGACC300GAAAGTGGTGTGGACGTGCCGATAAGACTTTTGGTCCTTCACGGTCGCTAGGAGGAGGTG360TTGGTGATTGCTGCAGAAGTCATGACAGCTGTGGCCGCATGATTAAACCAGGAGAGACTT420ATGGAGATGTTACGAATAAAGGATTTTCAAATATTTGGGAATGCCGATGTGACTATGCAT480TTTTTCAATGTCTTCAGCGTTCCAATGGTAAAATGAAAAATGTTGTGGAAATATTGCATT540TTGACGTTGTCAATACACCCTGTTACTTCATGAAAGATGGCCGTGCTAAAATATCACCCC600ATACTGTATATGATAAACACGAATCACTCTATCAACTTATACTACACAAAGATAATTTTA660AGGAGTGGGTGCATGATAATGCTCTTCTCCCGCAAGAGCTGGGGATTAAAGATGAGCATG720TGTGGGAGACACTGATGGCATGGATGGACTTTAGATTTCCAACTGAATAATAAATATTCC780AAATACAGATATCCTTTTGATAAAATGTCGTAAACATGATTGTTTAGATGAATGGTAAAT840TAATGAAAAGATTGATTGAAAATGTCTGAAGTAACTNNNGGATNNGACATATAATATATA900ATATTTGCCTTATTNGATAAACTTCTACCNTTAANAAAGGAAAAAGGAGGAGGNGTAGGA960GGAGGATTAGGATATTTTACAAGGATTTTAAAAATAATTAAACAATTAGATCTTCTGTAA1020ATTGATTGATCATGTATTAAATACAATAACATCTCGTTCTCATAGTACAATGAAAAAGAA1080CATAACAGTATGCACAAAAATAATGACGGTAAATATCTATGTATGTATGTAGAGAGAAGA1140AAATAAAAATAGTTAGACAGGTACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA1197(2)SEQIDNO47的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度182個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO47(xi)SEQUDENCEDESCRIPIIONSEQIDNO47MetSerIleIleCysLysIleIleLeuLeuValLeuLeuSerTrpThr151015SerMetValSerSerThrLeuPheThrAspArgLysTrpCysGlyArg202530AlaAspLysThrPheGlyProSerArgSerLeuGlyGlyGlyValGly354045AspCysCysArgSerHisAspSerCysGlyArgMetIleLysProGly505560GluThrTyrGlyAspValThrAsnLysGlyPheSerAsnIleTrpGlu65707580CysArgCysAspTyrAlaPhePheGlnCysLeuGlnArgSerAsnGly859095LysMetLysAsnValValGluIleLeuHisPheAspValValAsnThr100105110ProCysTyrPheMetLysAspGlyArgAlaLysIleSerProHisThr115120125ValTyrAspLysHisGluSerLeuTyrGlnLeuIleLeuHisLysAsp130135140AsnPheLysGluTrpValHisAspAsnAlaLeuLeuProGlnGluLeu145150l55160GlyIleLysAspGluHisValTrpGluThrLeuMetAlaTrpMetAsp165170175PheArgPheProThrGlu180(2)SEQIDNO48的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1201個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置222..773(xi)序列描述SEQIDNO48CACGCCTACTTAGATAATTTCTCAATTCTTTGCAAATTATGAAATAAGTGCAAGAGATGT60GTATGTCACCTCAATCTGAGTTTGTTCATAATTCGAGAGGGATAAATAAGGAAGTCTCTG120TGTACAAAAGAAAACTACCTCATATAAATCTTGCATTTTTCCGTGAGAGAGAAAAAAAAA180CCCTGAAAAACTGAGTAAGGCAATAATTTTCCCTCATAACAATGTCAATCATA233MetSerIleIle1TGTAAAATAATCTTGTTGGTGCTACTGAGTTGGACATCGATGGTATCG281CysLysIleIleLeuLeuValLeuLeuSerTrpThrSerMetValSer5101520TCAACATTATTTACAGACCGAAAGTGGTGTGGACGTGCCGATAAGACT329SerThrLeuPheThrAspArgLysTrpCysGlyArgAlaAspLysThr253035TTTGGTCCTTCACGGTCGCTAGGAGGAGGTGTTGGTGATTGCTGCAGA377PheGlyProSerArgSerLeuGlyGlyGlyValGlyAspCysCysArg404550AGTCATGACAGCTGTGGCCGCATGATTAAACCAGGAGAGACTTATGGA425SerHisAspSerCysGlyArgMetIleLysProGlyGluThrTyrGly556065GATGTTACGAATAAAGGATTTTCAAATATTTGGGAATGCCGATGTGAC473AspValThrAsnLysGlyPheSerAsnIleTrpGluCysArgCysAsp707580TATGCATTTTTTCAATGTCTTCAGCGTTCCAATGGTAAAATGAAAAAT521TyrAlaPhePheGlnCysLeuGlnArgSerAsnG1yLysMetLysAsn859095100GTTGTGGAAATATTGCATTTTGACGTTGTCAATACACCCTGTTACTTC569ValValGluIleLeuHisPheAspValValAsnThrProCysTyrPhe105110115ATGAAAGATGGCCGTGCTAAAATATCACCCCATACTGTATATGATAAA617MetLysAspGlyArgAlaLysIleSerProHisThrValTyrAspLys120125130CACGAATCACTCTATCAACTTATACTACACAAAGATAATTTTAAGGAG665HisGluSerLeuTyrGlnLeuIleLeuHisLysAspAsnPheLysGlu135140145TGGGTGCATGATAATGCTGGAACTCTTCTCCCGCAAGAGCTGGGGATT713TrpValHisAspAsnAlaGlyThrLeuLeuProGlnGluLeuGlyIle150155160AAAGATGAGCATGTGTGGGAGACACTGATGGCATGGATGGACTTTAGA761LysAspGluHisValTrpGluThrLeuMetAlaTrpMetAspPheArg165170175180TTTCCAACTGAATAATAAATATTCCAAATACAGATATCCTTTTGATAAAATG813PheProThrGluTCGTAAACATGATTGTTTAGATGAATGGTAAATTAATGAAAAGATTGATTGAAAATGTCT873GAAGTAACTTTTGGATTTTACATATAATATATAATATTTGCCTTATTTGATAAACTTCTA933AATTAAAAAAGAAAAAGGAGGAGGAGTAGGAGGAGGATTAGGATATTTTACAAGGATTTT993AAAAATAATTAAACAATTAGATCTTCTGTAAATTGATTGATCATGTATTAAATACAATAA1053CATCTCGTTCTCATAGTACAATGAAAAAGAACATAACAGTATGCACAAAAATAATGACGG1113TAAATATCTATGTATGTATGTAGAGAGAAGAAAATAAAAATAGTTAGACAGGTACCAAAA1173AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA1201(2)SEQIDNO49的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度184個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO49MetSerIleIleCysLyslleIleLeuLeuValLeuLeuSerTrpThr151015SerMetValSerSerThrLeuPheThrAspArgLysTrpCysGlyArg202530AlaAspLysThrPheGlyProSerArgSerLeuGlyGlyGlyValGly354045AspCysCysArgSerHisAspSerCysGlyArgMetIleLysProGly505560GluThrTyrGlyAspValThrAsnLysGlyPheSerAsnIleTrpGlu65707580CysArgCysAspTyrAlaPhePheGlnCysLeuGlnArgSerAsnGly859095LysMetLysAsnValValGluIleLeuHisPheAspValValAsnThr100105110ProCysTyrPheMetLysAspGlyArgAlaLysIleSerProHisThr115120125ValTyrAspLysHisGluSerLeuTyrGlnLeuIleLeuHisLysAsp130135140AsnPheLysGluTrpValHisAspAsnAlaGlyThrLeuLeuProGln145150155160GluLeuGlyIleLysAspGluHisValTrpGluThrLeuMetAlaTrp165170175MetAspPheArgPheProThrGlu180(2)SEQIDNO50的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型肽(xi)序列描述SEQIDNO50XaaIleAlaXaaAspValGlyHisAlaAlaHisSerPheThrLysXaa151015ValHisAsnProGlyAsnPheArg20(2)SEQIDNO51的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度66個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO51ATHGCNCARGAYGTNGGDCAYGCNGCNCAYWSNTTYACNAARGTNCAYAAYCCNGGNAAY60TTYMGN66(2)SEQIDNO52的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO52TGDCCDACRTCDGC14(2)SEQIDNO53的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO53GTNCAYAAYCCHGGHAA17(2)SEQIDNO54的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度275個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO54STGCACAATCCAGGAAACTTCCGAGTCTCCAAATGTGTATGCGACATTGCGCTCAAGGAG60TGCCTCACTACTCATCCTGAAATGAGTTTCAAATTTGTTAAAGCACTCTTTTTTGATTTG120CTTGCTCCACCCTGTTTTGATCAGATTGCTGATTGGGGTAAGAAAAAATTGAAAAATAAG180CAGGCATTTTCACTGCATGATTTACAATCAGCTGCCCACGCGCTCTGGCAAACACTCTAT240GACGCTGTCAAGGGCATAGCTCAAGATGTCGGCCA275(2)SEQIDNO55的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO55CGCTCTGGCAAACACTCTAT20(2)SEQIDNO56的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQIDNO56GGTGGAGCAAGCAAACTAAA20(2)SEQIDNO57的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度685個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型cDNA(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置156..590(xi)序列描述SEQIDNO57GCGCGCGCAGCAAGACTAAGAGTAAGAGAGGGGAACATAGAAGAGTGTTTACAATAGTGG60AGATGTGGGGGCTTTCATTTCTATTAGTTCCGTGCTGGAGTTTTTCAACCTACGCTGGGT120GTGGTGGATATAATCGGTCCATTACTAAGCGACAGATGGACGATGGTGAGACG173MetAspAspGlyGluThr15TGCGAAAGGTGTTTGAATCCACTCGAATTAGTAAATGACGCTGTAGAC221CysGluArgCysLeuAsnProLeuGluLeuValAsnAspAlaValAsp101520TCGTGCATTGAAGCTCATGAGGAATGTGAGGAATTCATGGAAGGCGGG269SerCysIleGluAlaHisGluGluCysGluGluPheMetGluGlyGly253035ATGGAAATGCTTCATGTACACAATCCAGGAAACTTCCGAGTCTCCAAA317MetGluMetLeuHisValHisAsnProGlyAsnPheArgValSerLys404550TGTGTATGCGACATTGCGCTCAAGGAGTGCCTCACTACTCATCCTGAA365CysValCysAspIleAlaLeuLysGluCysLeuThrThrHisProGlu55606570ATGAGTTTCAAATCTGTTAAAGCACTCTTTTTTGATTTGCTTGCTCCA413MetSerPheLysSerValLysAlaLeuPhePheAspLeuLeuAlaPro758085CCCTGTTTTGACCAGATTGCTGATTGGGGTAAGAAAAAATTGAAAAAT461ProCysPheAspGlnIleAlaAspTrpGlyLysLysLysLeuLysAsn9095100AAGCAGGCATTTCCACTGCATGATTTACAATCAGCTGCCCACGCGCTC509LysGlnAlaPheProLeuHisAspLeuGlnSerAlaAlaHisAlaLeu105110115TGGCAAACACTCTATGACGCTGTCAAGGGCATAGCTCAGGATGTCGGA557TrpGlnThrLeuTyrAspAlaValLysGlyIleAlaGlnAspValGly120125130CATGCTGCACATTCTTTTGAAAAAATGTTACAGTAACAGTTAAATATGAAAAA610HisAlaAlaHisSerPheGluLysMetLeuGln135140145GGTCCATGATAGTAGAATACAGTTATTGTTGTATAAATAAATAATATATTCAGAATGATA670AAAAAAAACGGCCGC685(2)SEQIDNO58的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度145個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO58MetAspAspGlyGluThrCysGluArgCysLeuAsnProLeuGluLeu151015ValAsnAspAlaValAspSerCysIleGluAlaHisGluGluCysGlu202530GluPheMetGluGlyGlyMetGluMetLeuHisValHisAsnProGly354045AsnPheArgValSerLysCysValCysAspIleAlaLeuLysGluCys505560LeuThrThrHisProGluMetSerPheLysSerValLysAlaLeuPhe65707580PheAspLeuLeuAlaProProCysPheAspGlnIleAlaAspTrpGly859095LysLysLysLeuLysAsnLysGlnAlaPheProLeuHisAspLeuGln100105110SerAlaAlaHisAlaLeuTrpGlnThrLeuTyrAspAlaValLysGly115120125IleAlaGlnAspValGlyHisAlaAlaHisSerPheGluLysMetLeu130135140Gln14權(quán)利要求1.分離DNA，包括SequenceIDNO.19所示核酸序列；與SequenceIDNO.19所示核酸序列顯示出60％或更大同源性的序列；與SequenceIDNO.19所示核酸序列雜交的序列；以及由于SequenceIDNO.19所示核酸的遺傳密碼簡(jiǎn)并而得到的序列和編碼相同多肽的序列。2.分離DNA，包括SequenceIDNO.46所示核酸序列；與SequenceIDNO.46所示核酸序列顯示出60％或更大同源性的序列；與SequenceIDNO.46所示核酸序列雜交的序列；以及由于SequenceIDNO.46所示核酸遺傳密碼簡(jiǎn)并而得到的序列和編碼相同多肽的序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2的分離DNA，包括SequenceIDNO.48所示核酸序列；與SequenceIDNO.48所示核酸序列顯示出60％或更大同源性的序列；與SequenceIDNO.48所示核酸序列雜交的序列；以及由于SequenceIDNO.48所示核酸的遺傳密碼簡(jiǎn)并而得到的序列和編碼相同多肽的序列。4.分離DNA，包括SequenceIDNO.57所示核酸序列；與SequenceIDNO.57所示核酸序列具有60％或更大同源性的序列；與SequenceIDNO.57所示核酸序列雜交的序列；以及由于SequenceIDNO.57所示核酸遺傳密碼簡(jiǎn)并而得到的序列和編碼相同多肽的序列。5.分離的DNA，包括SequenceIDNO.36所示核酸序列；與SequenceIDNO.36所示核酸序列顯示出60％或更大同源性的序列；與SequenceIDNO.36所示核酸序列雜交的序列；以及由于SequenceIDNO.36所示核酸遺傳密碼簡(jiǎn)并而得到的序列和編碼相同多肽的序列。6.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的分離DNA，包括與SequenceIDNO.19，46，48，57，或36所示核酸序列顯示出70％或更大同源性的序列。7.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的分離DNA，其為cDNA，或合成DNA。8.分離DNA，其為基因組DNA，如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的DNA一樣編碼相同的多肽。9.由前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的DNA所編碼的分離多肽，包括其衍生物。10.包括SequenceIDNO.20所示氨基酸序列的分離多肽，包括其衍生物。11.包括SequenceIDNO.47所示氨基酸序列的分離多肽，包括其衍生物。12.根據(jù)權(quán)利要求11包括SequenceIDNO.49所示氨基酸序列的分離多肽，包括其衍生物。13.包括SequenceIDNO.58所示氨基酸序列的分離多肽，包括其衍生物。14.包括SequenceIDNO.37所示氨基酸序列的分離多肽，包括其衍生物。15.分離多肽，其為權(quán)利要求10至14任一項(xiàng)的分離多肽的同源變異體，與SequenceIDNO.20，47，49，58或37所示氨基酸序列顯示出80％或更大同源性。16.根據(jù)權(quán)利要求115的分離多肽，與SequenceIDNO.20，47，49，58或37所示氨基酸序列顯示出90％或更大同源性。17.分離多肽，其通過(guò)權(quán)利要求8的基因組DNA的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的變異體剪接而產(chǎn)生。18.重組DNA構(gòu)建物，包括權(quán)利要求1至8至少任一項(xiàng)的DNA。19.根據(jù)權(quán)利要求18的重組DNA構(gòu)建物，為克隆載體。20.根據(jù)權(quán)利要求18的重組DNA構(gòu)建物，為表達(dá)載體。21.包含權(quán)利要求18的重組DNA構(gòu)建物的轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，非哺乳動(dòng)物脊椎動(dòng)物或無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞，植物細(xì)胞，細(xì)菌或酵母。22.根據(jù)權(quán)利要求21的轉(zhuǎn)化酵母，其為真菌。23.遺傳操作病毒，包括權(quán)利要求1至8至少任一項(xiàng)的DNA。24.一種昆蟲(chóng)毒素，包括具有SequenceIDNO.1，2，3和4所示N-末端氨基酸序列的四種多肽亞基。25.一種昆蟲(chóng)毒素，包括一種或多種權(quán)利要求9的多肽。26.一種昆蟲(chóng)毒素，包括一種或多種權(quán)利要求10至17任一項(xiàng)的多肽。27.一種可從寄生胡蜂獲得的昆蟲(chóng)毒素，包括通過(guò)本文定義的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定的分子量為約34,000Da，21,000Da，18,500Da和17,000Da的四種多肽。28.一種生物防治劑，包括(i)一種權(quán)利要求24至27任一項(xiàng)的昆蟲(chóng)毒素，(ii)權(quán)利要求10至17任一項(xiàng)的多肽；(iii)根據(jù)權(quán)利要求18的重組DNA構(gòu)建物；或(iv)根據(jù)權(quán)利要求21至23任一項(xiàng)的被轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。29.一種殺滅昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的方法，包括用防治害蟲(chóng)有效量的權(quán)利要求28的生物防治劑處理害蟲(chóng)或其棲息地。全文摘要可從麥蛾繭蜂獲得的新的昆蟲(chóng)毒素,包括編碼它的DNA序列,包含至少一種編碼所述毒素的DNA序列的重組DNA構(gòu)建物,以及包含所述重組DNA構(gòu)建物的生物防治劑。文檔編號(hào)A01N63/00GK1172503SQ9519730公開(kāi)日1998年2月4日申請(qǐng)日期1995年11月21日優(yōu)先權(quán)日1994年11月22日發(fā)明者J·D·溫德斯,R·E·鄧肯,V·J·鮑爾,P·D·克里斯汀申請(qǐng)人:曾尼卡有限公司,聯(lián)邦科學(xué)及工業(yè)研究組織