專利名稱：Heterorhabditis bacteriophora殺蟲劑組合物及有關(guān)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及含有具有增強(qiáng)的殺蟲效應(yīng)的含有傳染期異型桿狀(heterorhabditid)雜交線蟲的新的殺蟲劑組合物；具有該特征的新的線蟲；以及通過在已感染土壤處施用有效效量的該殺蟲組合物以減少土壤習(xí)居害蟲蟲口的方法。
本發(fā)明的背景含有生物殺蟲劑或者昆蟲病原性線蟲成份的殺蟲劑組合物開辟了一個(gè)引人矚目的用生物控制劑抗土壤習(xí)居害蟲的領(lǐng)域。它們比市售的化學(xué)殺蟲劑具有許多重要的優(yōu)勢。線蟲殺蟲劑的優(yōu)越性包括高毒性，廣譜的宿主范圍，安全性，政府注冊免稅及易于大批生產(chǎn)。
異型桿狀型族的線蟲構(gòu)成了和Photorhabdus細(xì)菌的特有的共生聯(lián)系。它們對多群昆蟲具有病原性。異型桿狀體是雌雄同體的。一般地，傳染性的幼體通常是通過腸或氣門穿入其宿主昆蟲如白蠐螬的血腔。異型桿狀體帶有一個(gè)背齒從而便于穿入其它區(qū)域(如節(jié)間膜)。線蟲消化系統(tǒng)的細(xì)菌釋放于宿主體內(nèi)，并且該宿主一般會在48小時(shí)內(nèi)死于敗血癥。該線蟲在宿主尸體內(nèi)喂養(yǎng)，發(fā)育，成熟并繁殖，且通常在多代后，又產(chǎn)生感染性的幼蟲，羽化，再尋找新的宿主昆蟲。
希望提供含有那些具有改進(jìn)的抗土壤習(xí)居害蟲效應(yīng)的殺蟲劑線蟲的殺蟲劑組合物；具有該改進(jìn)效應(yīng)的新的線蟲；使用該改進(jìn)的殺蟲劑線蟲以控制土壤習(xí)居有害昆蟲的方法；以及生產(chǎn)該改進(jìn)的殺蟲劑線蟲的工藝和設(shè)備。
本發(fā)明的概述本發(fā)明所提供的是新的殺蟲劑組合物以及通過在已有蟲害處施用含有有效劑量的本發(fā)明的傳染期的昆蟲病原性線蟲的新的殺蟲劑組合物從而控制土壤習(xí)居的有害昆蟲的改進(jìn)方法。本發(fā)明的殺蟲劑組合物包括有效劑量的帶有Heterorhabditis bacteriophora雜交株HB(NJ)及其有效的變異體，突變體或者雜種的殺蟲劑特性的幼態(tài)的傳染期的殺蟲的昆蟲病原性線蟲以及為此的生者雜種的殺蟲劑特性的幼態(tài)的傳染期的殺蟲的昆蟲病原性線蟲以及為此的生物適應(yīng)性載體。本發(fā)明所提供的還有本發(fā)明的殺蟲組合物中的新的昆蟲病原性線蟲，其在控制土壤習(xí)居昆蟲方面有高效性，包括對多種昆蟲宿主有提高的病原性和增強(qiáng)的生殖力。本發(fā)明的詳細(xì)說明該Heterorhabditis bacteriophora HB(NJ)雜交株是通過雜交一大系列從四個(gè)不同的棲息所收集的土壤標(biāo)本中所得的H.bacteriophora的野生型分離株而獲得的。該棲息所是草地，長有零散樹的草地，長滿雜草的原野以及長有零散樹的長滿雜草的原野，該棲息所代表許多收集點(diǎn)。
該雜交株的增強(qiáng)的特性包括對多種昆蟲宿主增強(qiáng)的病原性或者傳染性以及提高的生殖力。
通過下述試驗(yàn)測定傳染性。所用的傳染性標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)是把50個(gè)傳染性的幼蟲放置于砂柱(5cm直徑×5cm高)的頂部，砂柱底部有一種靶昆蟲(蠟蛾，Galleria mellonella)。該試驗(yàn)一般是在25℃下進(jìn)行，并且砂中含有10％的重量百分比的水分。允許該線蟲有24小時(shí)來尋找靶昆蟲，在那一時(shí)刻取出該昆蟲，在蒸餾水中漂洗并在25℃下再培育24小時(shí)以使該線蟲有時(shí)間在宿主中發(fā)育。然后，解剖宿主并計(jì)數(shù)那些成功地定居于宿主中的線蟲的數(shù)目。在每組重復(fù)20次的兩組試驗(yàn)中，HB(NJ)的平均感染率為每個(gè)宿主有10.45和11.1個(gè)線蟲(標(biāo)準(zhǔn)差(SE)分別為1.053和1.095)，全部宿主均被傳染且在實(shí)驗(yàn)過程中死亡。在可比較的試驗(yàn)中，該HB(NJ)株表現(xiàn)的結(jié)果要比兩種已知的H.bacteriophora株(HBNC和HBHP88)的好得多。它們僅分別殺死50％和70％的宿主，并且平均感染率分別是每個(gè)宿主只有0.08和1.20個(gè)線蟲。該HB(NJ)株對其它昆蟲的傳染率也顯示了其類似的優(yōu)勢。
生殖力通過以下試驗(yàn)測定。標(biāo)準(zhǔn)的生殖力試驗(yàn)是在25℃下定量那些從已用傳染性的幼蟲常規(guī)接種(n＝20)的標(biāo)準(zhǔn)重量(0.24-0.26克)的單個(gè)宿主(Galleria mellonella)中產(chǎn)生的新的傳染性的幼蟲的數(shù)目。關(guān)于用HB(NJ)的30次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到的平均生殖力水平為383,046.7(標(biāo)準(zhǔn)差(SE)為15212.9)。說明HB(NJ)的生殖力是優(yōu)越的。
本發(fā)明所提供的Heterorhabditis bacteriophora雜交菌株HB(NJ)具有保藏號ATCC_。
該殺蟲劑組合物可以以含水的噴霧劑組合物形式；以使用藻酸鈣或者其形式存在。
用于固定線蟲或者部分干燥它們的載體可以減緩它們的新陳代謝并改善其對極端溫度的耐受性。雖然由于線蟲的生活能力迅速下降使得在室溫下持久地貯藏的效果一般較差，但還是可以購得生存于潮濕的基質(zhì)諸如泡沫，蛭石，和泥炭上的線蟲。本發(fā)明的Heterorhabditis組合物適于貯存于10℃-15℃下且該有機(jī)體應(yīng)保持在有氧的環(huán)境中。
可以使用包括小型壓力噴霧器，噴霧鼓風(fēng)機(jī)，靜電噴霧器，風(fēng)扇噴霧器，以及空中噴灑機(jī)的常用農(nóng)業(yè)化學(xué)設(shè)備來施用線蟲。昆蟲病原性線蟲可以耐受300磅/英寸2的壓力并能用所有常規(guī)的開口直徑小至50微米的噴口型噴霧器(如“01”噴頭)噴灑。然而，一些類型的壓出設(shè)備產(chǎn)生大量的熱，而一旦該噴霧器管路中的溫度升至32℃以上則對該線蟲有副面影響。幸運(yùn)的是它極少發(fā)生并且通常只是在該噴霧器箱幾乎是空的以及幾乎沒有吸熱用水的情況下發(fā)生的問題。
通常使用的田間濃度超過25億個(gè)線蟲/公頃(10億/畝)以確保有足夠蟲口的線蟲與靶昆蟲接觸從而產(chǎn)生控制作用。需要高濃度來克服無生命的和有生命的土壤環(huán)境的消極影響。也需要高線蟲濃度來對付某些在鉆入根部前只在土壤中停留幾天的昆蟲，如卷心菜蛆(D.radicum)，以及對付那些由于體積小且移動靈活而不易受線蟲感染的昆蟲。例如，需要高濃度的線蟲對付早期未成熟階段的螻蛄(Scapteriscus spp.)，根蛆(Delia spp.)和玉米根蠕蟲(Diabroticaspp.)。
有關(guān)適用于提供本發(fā)明的殺蟲組合物的配方和應(yīng)用以及有關(guān)本發(fā)明的工藝的廣泛的討論見于Randy Gaugler博士和Harry K.kaya博士編輯的論文集，“昆蟲病原線蟲在生防中的應(yīng)用”，第9章，“Ramon Georgis配方和應(yīng)用技術(shù)”，CRC出版社(Boca Raton，Ann Arbor，Boston)，1990。
用于測評線蟲的殺蟲活性的Galleria mellonella識別試驗(yàn)按下述方法進(jìn)行，將Whatman 1號濾紙置于35mm的培養(yǎng)皿中。再將Galleria mellonella宿主置于濾紙上。將100個(gè)幼年線蟲懸浮于500微升水中。通過打濕該濾紙幾處的方法而將水懸浮液置于紙上。如果該Galleria mellonella在試驗(yàn)?zāi)┢谧兗t則表明Galleria mellonella宿主已死亡。
在用于分離線蟲的Galleria mellonella誘鉺方法中，感染了Heterorhabditisbacteriophora的Galleria mellonella通常會死亡并變成紅色。所取的土壤樣的bacteriophora的Galleria mellonella通常會死亡并變成紅色。所取的土壤樣的直徑是2厘米且長度是15厘米。為了提供本發(fā)明的Heterorhabditisbacteriophora雜交株HB(NJ)，大約使用了150個(gè)Heterorhabditis bacteriophora分離株。
用于提供該HB(NJ)菌株的雜交育種法包括常規(guī)的步驟。
所提供的對本發(fā)明的改變和修改對于本領(lǐng)域的那些熟練技術(shù)人員來說是顯而易見的，并且在本發(fā)明的精神之內(nèi)的改變和修改也是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的。
權(quán)利要求
1.一種用于減少一種或多種土壤習(xí)居昆蟲蟲口的殺蟲組合物，其包括有效劑量的一種具有Heterorhabditis bacteriophora雜交株Hb(NJ)或其有效的變異體或突變體的殺蟲特性的幼態(tài)傳染期殺蟲的昆蟲病原性線蟲以及為此的生物適應(yīng)性載體。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中的線蟲是Heterorhabditis bacteriophora雜交株Hb(NJ)。
3.一種用于降低土壤習(xí)居的白蠐螬或其它昆蟲蟲口的方法，其包括在該昆蟲侵?jǐn)_的土壤處施用含有效劑量的具有Heterorhabditis bacteriophora雜交株Hb(NJ)或其變異體或突變體的殺蟲特性的處于傳染期的一種殺蟲的昆蟲病原性線蟲的殺蟲組合物。
4.權(quán)利要求3的方法，其中的線蟲是傳染期的Heterorhabditisbacteriophora雜交菌株Hb(NJ)線蟲。
5.一種Heterorhabditis bacteriophora雜交菌株HB(NJ)的線蟲，其在幼態(tài)傳染期內(nèi)施于已有蟲害的土壤處能降低一種或多種土壤習(xí)居的昆蟲蟲口。
6.權(quán)利要求5的一種幼態(tài)傳染期線蟲。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種殺蟲劑組合物,其包含有效劑量的處于幼態(tài)傳染期的能殺蟲的昆蟲病原性Heterorhabditisbacteriophora雜交株Hb(NJ)或其突變體或者變異體,以及為此的生物適合性載體。相比于含有已知的H.bateriophora線蟲HBHP88的已知?dú)⑾x組合物,該殺蟲組合物提供了改進(jìn)了的殺蟲活性。本發(fā)明還公開了降低土壤中土壤習(xí)居昆蟲蟲口的方法,其是將上述殺蟲組合物施于感染有這種昆蟲的土壤處而進(jìn)行。另外,還提供了該Hb(NJ)雜交線蟲株。
文檔編號A01N25/00GK1180375SQ96192982
公開日1998年4月29日 申請日期1996年1月25日 優(yōu)先權(quán)日1996年1月25日
發(fā)明者蘭迪·高格勒, 羅賓·斯圖爾特 申請人:洛特格斯新澤西州立大學(xué)