專利名稱：：重組桿狀病毒殺蟲劑的制作方法
背景技術(shù)：
：化學(xué)殺蟲劑是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的必要部分，并且已經(jīng)是一種通過控制蟲害而減少作物損失的有效方法。然而，由于其對環(huán)境污染的潛在作用，對農(nóng)學(xué)上的害蟲的抗性群體的篩選，以及對非靶生物的毒性，所以化學(xué)試劑正受到不斷的審查。結(jié)果是，正在尋找一種替代策略，該策略應(yīng)是有效的，甚至對非靶群體及環(huán)境是有益的。其中的一種策略包括使用微生物，該微生物是自然存在的針對昆蟲群體的病原體。然而，許多有希望的昆蟲控制劑作為候選昆蟲病原體都缺少一些經(jīng)典的化學(xué)殺蟲劑的特征，而這些特征是農(nóng)場主或其它從事農(nóng)業(yè)的人已習(xí)慣的。例如，桿狀病毒科家族的昆蟲特異性病毒有許多優(yōu)點，包括宿主-特異性及惰性環(huán)境的特點，但卻缺乏在重大的作物損失發(fā)生前迅速控制靶群體的能力。幸運的是，現(xiàn)代分子生物學(xué)提供了改造這些特性的必要工具，以便能滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的需要。桿狀病毒對于無脊椎動物是病毒性病原體，其特征是有一雙鏈、環(huán)狀DNA基因組，大小約80到200千堿基。桿狀病毒分為3個亞族，包括無包含體桿狀核型病毒(NOVs)，顆粒體病毒(GVs)和核多角體病毒(NPVs)。NOVs的例子是椰二疣獨角仙病毒和HelicoverpuzeaNOVs，GVs的例子包括小菜蛾顆粒體病毒，蘋果蠹蛾顆粒體病毒，甘藍(lán)粉蝶顆粒體病毒，和粉紋夜蛾顆粒體病毒。NPVs的例子包括苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒，甜菜夜蛾核型多角體病毒，棉鈴蟲核型多角體病毒，HelicoverouzeaNPV，單地夜蛾核型多角體病毒，粉紋夜蛾核型多角體病毒，甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒，舞毒蛾核型多角體病毒，斜紋夜蛾核型多角體病毒，銀紋夜蛾核型多角體病毒，樅色卷蛾核型多角體病毒，梨豆夜蛾核型多角體病毒，和綠棉鈴蟲核型多角體病毒。盡管曾認(rèn)真研究了一些特定的顆粒體病毒和無包含體桿狀核型病毒，核多角體病毒是桿狀病毒各亞族中定性最為徹底的。NPV的感染周期包括二種病毒粒子。感染昆蟲細(xì)胞后，出芽病毒粒子(BVs或胞外病毒，ECV)在核衣殼向質(zhì)膜運動中被制造。這些病毒粒子將核來源的衣殼排入胞質(zhì)中并通過出芽通過細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入宿主昆蟲的血腔中。這一過程導(dǎo)致了宿主昆蟲的系統(tǒng)感染。在感染階段的后期，病毒粒子在含有大量多角體蛋白的蛋白基質(zhì)中被包被，(包含體病毒粒子)，這樣形成多角包含體(PIB或包含體，OBs)。這些包含體是病毒的口腔感染形式，并且能在昆蟲宿主間水平轉(zhuǎn)移(1，2)。未被感染的幼蟲用含病毒的食物喂食并且吞下PIBs。蛋白樣基質(zhì)被昆蟲中腸中的酸性pH的活動所溶解這一現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)于許多鱗翅目幼蟲中。釋放了的病毒粒子核衣殼，含有病毒基因組DNA，接觸并感染幼蟲中腸的表皮組織。典型地，被感染昆蟲將繼續(xù)發(fā)育并在病毒在宿主內(nèi)指數(shù)擴(kuò)增中繼續(xù)消耗植物物質(zhì)。漸漸地，經(jīng)常是幾周或更長一段時間后，感染的幼蟲將完全受害并死亡。桿狀病毒的一個吸引人的特性是其狹窄的宿主特異性。這類病毒僅感染節(jié)肢動物，并且即使在一個特別的昆蟲目內(nèi)也具有相對狹窄的宿主范圍。宿主特異性曾用電鏡，DNA雜交及重組DNA技術(shù)檢驗(3～5)。這些研究表明狹窄的宿主范圍至少部分上是由于桿狀病毒不能將病毒DNA轉(zhuǎn)入哺乳動物細(xì)胞核中。NPV被用作真核生物表達(dá)載體來合成理想的異源蛋白(6，7)，這部分是由于易于得到有效的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)及克隆載體。特別是叫苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)的一種病毒，是一種已被接受的模型病毒，可用于在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中導(dǎo)入并表達(dá)異源基因。該病毒常規(guī)上被作為在真核表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)大量重組蛋白的一種重要的體外方法，并能提供對表達(dá)蛋白進(jìn)行合適的翻譯后修飾，AcNPV能夠感染鱗翅目昆蟲的許多家族，而這些昆蟲是重要的經(jīng)濟(jì)學(xué)害蟲。盡管基于桿狀病毒的害蟲控制劑有潛在的實用的優(yōu)點，然后許多缺點卻限制了它們在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。在中耕農(nóng)業(yè)中更廣泛運用該類病毒的最大障礙是其在時間上的滯后，即在使用病毒和有效地控制由宿主昆蟲引起的作物損失間的時間上的滯后，不象使用經(jīng)典的化學(xué)殺蟲劑后可快速地觀察到生效，有效的野生型桿狀病毒所介導(dǎo)的昆蟲控制僅當(dāng)體內(nèi)病毒群體達(dá)一危及宿主活動的高水平后才發(fā)生。然而，通過運用重組DNA技術(shù)，可通過導(dǎo)入控制殺蟲蛋白表達(dá)的基因或通過從病毒基因組中刪除一些基因，使得NPV從遺傳學(xué)上被改造，從而提高其昆蟲殺滅速率(8～10)。已經(jīng)改造成表達(dá)昆蟲選擇性神經(jīng)毒素的最有效的重組NPVs(11～18)。這些重組病毒殺死宿主用的時間比野生型NPVs至少少20～30％。現(xiàn)在，已有已構(gòu)建好的重組NPVs，其致力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于以前構(gòu)建的NPVs。這些重組NPVs被加工以表達(dá)一編碼蝎子(Leiurusquinquestriatushebraeus)的昆蟲選擇性毒素蝎毒素LqhIT2的異源基因(19，20)?；谀壳暗难芯浚瑤в羞@種合成基因的重組NPVs可使病毒的殺蟲的特性有很大的提高。發(fā)明概述本發(fā)明涉及重組桿狀病毒，桿狀病毒經(jīng)過加工可以很好地表達(dá)編碼昆蟲-選擇性神經(jīng)毒素的基因。更具體地說，本發(fā)明涉及一分離自蝎子Leiurusquinquestriatushebraeus的編碼蝎毒素LqhIT2的核酸序列，這里所說的序列經(jīng)優(yōu)化后適合于在核多角體病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)基因。本發(fā)明還涉及包括一密碼子經(jīng)優(yōu)化的LqhIT2核酸序列的嵌合基因，以及包括表達(dá)一密碼子經(jīng)優(yōu)化，昆蟲選擇性神經(jīng)毒素比如LqhIT2毒素基因的桿狀病毒的殺蟲組合物，本發(fā)明也涉及在農(nóng)學(xué)的和非農(nóng)學(xué)的環(huán)境下控制昆蟲的方法，其中也包括使用含有密碼子經(jīng)優(yōu)化的，編碼昆蟲選擇性神經(jīng)毒素如LqhIT2毒素的核酸序列的昆蟲桿狀病毒。本例發(fā)明中的昆蟲桿狀病毒選自核多角體病毒，單或多包含體核多角體病毒，和顆粒體病毒組。優(yōu)選桿狀病毒選自多核衣殼核多角體病毒。特別優(yōu)選的是苜蓿銀紋夜蛾多衣殼核型多角體病毒(AcNPV)。本發(fā)明包括一編碼LqhIT2蛋白的合成基因，其中該基因密碼子選擇上是偏向于選擇核多角體病毒以及支持病毒復(fù)制的細(xì)胞所優(yōu)選的密碼子，這一點通過觀察-已經(jīng)表征的核多角體病毒蛋白，多角蛋白的編碼基因以及幾個鱗翅昆蟲蛋白的編碼基因的密碼子利用而得到確定。帶有合成的LqhIT2基因的重組桿狀病毒感染細(xì)胞后，在細(xì)胞中所得的遺傳構(gòu)建物可有效地表達(dá)LqhIT2。對煙芽夜蛾使用這些重組病毒后導(dǎo)致幼蟲的快速麻痹。更有甚者，帶有偏倚性密碼子的基因的病毒殺死其昆蟲宿主的速度遠(yuǎn)快于那些帶有LqhIT2基因互補(bǔ)DNA(cDNA)拷貝的病毒。附圖簡述，生物保藏及序列表圖1.蝎子Leiurusquinquestriatushebraeus的LqhIT2基因的cDNA序列(LqhITcDNA)以及編碼LqhIT2的密碼子-偏倚性的合成的結(jié)構(gòu)基因(LqhITNPV)的序列圖。黑體字符表示cDNA序列中的無義核苷酸變化，這些變化的引入是為了促進(jìn)基因表達(dá)。圖2.用來構(gòu)建LqhIT2基因的密碼子-偏倚性形式的合成寡核苷酸的序列。寡核苷酸Lq1編碼家蠶素的信號肽。寡核苷酸Lq1和Lq10用作合成基因的PCR擴(kuò)增中的引物。圖3.制備LqhIT2基因的密碼子偏倚性形式的策略的流程圖。寡核苷酸Lq1和Lq10(以“X”為標(biāo)記)作為PCR反應(yīng)的擴(kuò)增引物。單一的限性酶切位點已給出。圖4.具密碼子-偏倚性的LqhIT2基因的核酸序列及相應(yīng)氨基酸序列。核酸序列中的小寫字(核苷酸1～57，編碼氨基酸1～19)表示編碼家蠶素信號肽的核酸序列。圖5.質(zhì)粒pTE18R.LqhIT2(包含合成的具密碼子偏倚性LqhIT2基因的中間克隆載體)，pAcUW21(桿狀病毒轉(zhuǎn)動載體)和質(zhì)粒pAcUW21、LqhIT2的衍生物，即一種包含合成的，具密碼子-偏倚性的LqhIT2基因的桿狀病毒轉(zhuǎn)運載體，的圖譜。圖6.用AcLqhIT2和對照病毒處理后的煙芽夜蛾的3齡幼蟲的死亡時間(致死時間)圖示。圖7.用野生型和重組桿狀病毒處理煙芽夜蛾的幼蟲后引起的植物破壞的抑制(即植物保護(hù))的圖示。所報道的數(shù)據(jù)是相對于對照植物(未受侵染的)存留的葉子物質(zhì)的百分比。本發(fā)明還包括按照布達(dá)佩斯條約規(guī)定保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)中的重組桿狀病毒，ATCC地址為1230/ParklawnDrive，Rockville，MD20852，這些保藏物的保藏號為重組桿狀病毒保藏號保藏日期AcLqhIT2ATCCVR-25011995年5月2日CG201-3-1ATCCVR-25021995年5月2日申請人提供了13個序列的列表。這些序列同“專利申請中核酸和氨基酸序列的標(biāo)準(zhǔn)描述規(guī)則”(EPO主席決議的附錄I和II，在OFEPO的補(bǔ)充2中出版，1992年12月)以及37C.F.R1.821-1.825和附錄A和B(“含核酸和/或氨基酸序列的申請聲明的要求”)中的規(guī)定相符合。發(fā)明詳述在本文的上下文中，要用到許多術(shù)語及縮略語?！癗PN”代表核多角體病毒?！癙IBs”是多角包涵體?！癆cNPV”代表野生型的苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒?！癓qhIT2”代表源于蝎子Leiurusquinquestriatushebraeus的昆蟲選擇性神經(jīng)毒素?！癆aIT”表示源于Androctonusaustralis的昆蟲選擇性神經(jīng)毒素?！癆cLqhIT2”是AcNPV的縮寫形式，而該AcPNV已經(jīng)過遺傳修飾以包含編碼LqhIT2的基因，且該基因處于桿狀病毒晚期P10啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下。“AcAaIT”是經(jīng)遺傳修飾的包含編碼AaIT基因的AcNPV的縮寫形式。“表達(dá)”是指一結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯并最終生成編碼的蛋白質(zhì)。正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的，結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平是受調(diào)控序列(啟動子，多聚腺苷酸位點，增強(qiáng)子等)以及表達(dá)結(jié)構(gòu)基因的宿主細(xì)胞影響的。此處所用的，恰當(dāng)?shù)摹罢{(diào)控序列”是指位于結(jié)構(gòu)基因上游(5′)，和/或下游(3′)的核酸序列之間，這些核酸序列同細(xì)胞的蛋白生物合成裝置一起，潛在地控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)。這些調(diào)控序列包括啟動子，增強(qiáng)元件，轉(zhuǎn)錄終止序列，和多聚腺苷酸序列?！皢幼印敝傅氖俏挥诮Y(jié)構(gòu)基因5′末端并決定轉(zhuǎn)錄起始的核酸序列，對于啟動下游基因的表達(dá)，啟動子序列是必需的，但并不總是有效。通常，啟動子啟動轉(zhuǎn)錄的方向優(yōu)選的是下游方向，雖然當(dāng)基因被置于啟動子上游也可顯示出啟動活性(表達(dá)水平下降)。轉(zhuǎn)錄水平由啟動子序列調(diào)控。這樣，在構(gòu)建異源啟動子/結(jié)構(gòu)基因組合時，結(jié)構(gòu)基因被置于啟動子的調(diào)節(jié)控制下以便基因的表達(dá)可被啟動子序列控制。優(yōu)選地，啟動子位于結(jié)構(gòu)基因的上游并且啟動子同轉(zhuǎn)錄起始位點的距離應(yīng)同啟動子同其自然條件下控制的基因間的距離差不多。正如本領(lǐng)域所知曉的，能夠耐受距離上的一些變異且啟動子的功能并不喪失?！?′非編碼序列”指的是一個基因的一部分DNA序列，這段序列包含有多聚腺苷酸信號和能影響mRNA加工或基因表達(dá)的任意其它調(diào)節(jié)信號。多聚腺苷酸信號通常定性為影響向mRNA前體的3′末端加上多聚腺苷酸片段。此處用到的“基因”指的是參與蛋白合成的全部DNA序列部分。一個基因包括DNA的結(jié)構(gòu)或編碼區(qū)域，編碼區(qū)從5′末端的轉(zhuǎn)譯起始密碼子(通常為ATG)開始直至3′末端的終止密碼子(TAG，TGA或TAA)?；蜻€包括一啟動子區(qū)域，通常位于結(jié)構(gòu)基因的5′端或上游，其可以起始并調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)?；蛑幸舶?′非編碼序列?！扒逗匣颉敝傅氖且话ó愒凑{(diào)控序列和編碼序列的基因?！爱愒椿颉敝傅氖且欢卧谒拗魃镏袥]有但通過基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入的基因。“結(jié)構(gòu)基因”是指包含編碼蛋白，多肽或其一部分的DNA片段在內(nèi)的基因的一部分，但不包括參與基因表達(dá)調(diào)控的5′或3′序列。結(jié)構(gòu)基因可以是通常在細(xì)胞中可發(fā)現(xiàn)的，或者也可以是通常在細(xì)胞中不存在但是是被導(dǎo)入的，在這種情況下，其被稱為異源基因。正如本領(lǐng)域所熟知的，一個異源基因可以全部或部分來自任何來源，包括細(xì)菌基因組或游離體，真核，核或質(zhì)粒DNA，cDNA，病毒DNA或化學(xué)合成DNA。一個結(jié)構(gòu)基因可以在編碼區(qū)或非翻譯區(qū)含有一個或多個修飾，這些修飾可以影響到表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)。也可影響到表達(dá)的速率或表達(dá)控制方式。這類修飾包括，但不限于突變，插入，刪除和1個或多個核苷酸替換，一個結(jié)構(gòu)基因可以構(gòu)成一個不間斷的編碼序列或者它也可以包括一個或多個的內(nèi)含子，通過正確的剪切接合而相連。一個結(jié)構(gòu)基因也可以是來自許多來源的片段的組合，不管是天然存在的或是合成的。結(jié)構(gòu)基因也可以是編碼一個融合蛋白?！昂铣傻幕颉敝傅氖墙Y(jié)構(gòu)基因的DNA序列其全部或是絕大部分編碼區(qū)域是化學(xué)合成的。正如此處引出的例子，寡核苷酸構(gòu)建是用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的步驟合成的，然后再連接并通過接合形成基因片段，基因片段再用酶切處理以裝配成全基因。正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所明白的，功能和結(jié)構(gòu)上同此處所述的合成基因相類似的基因也可以通過本領(lǐng)域中所用的定點突變或其它相關(guān)方法來制備。術(shù)語“可操縱相連”指的是單一核酸分子上相互聯(lián)系的核酸序列，這樣一個核酸序列的功能可被另外的核酸序列影響。比例，當(dāng)一個啟動子能影響一個結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)時，則該啟動子同此結(jié)構(gòu)基因可操縱相連，(也就是說，那個結(jié)構(gòu)基因處于此啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下)?！稗D(zhuǎn)染”指將一個帶有功能基因的DNA片段穩(wěn)定地導(dǎo)入到一個以前不含該基因的生物體中?！肮厕D(zhuǎn)染”指的是向一生物體中同時導(dǎo)入多于一個的DNA片段?！懊艽a子偏倚性”指的是一特定宿主細(xì)胞在用核酸密碼編碼一給定氨基酸上所表現(xiàn)出的偏倚性。當(dāng)為在宿主細(xì)胞中獲得更高的表達(dá)而合成一基因時，設(shè)計基因時，使得密碼子運用的頻率接近宿主細(xì)胞所偏愛的密碼子運用的頻率是較理想的。“無密碼子偏倚性”指的是無偏倚的，自然的，天然的或是野生型的?！盎瘜W(xué)合成”，就其同DNA序列的關(guān)系而言，意思是核苷酸成分是在體外組裝成的。運用已成熟建立的步驟可以成功地完成DNA的人工化學(xué)合成(21)，或用許多種商售的儀器中的一種來完成自動化學(xué)合成。本發(fā)明涉及構(gòu)建和利用重組桿狀病毒殺蟲劑，通過工程方法來表達(dá)昆蟲選擇性神經(jīng)毒素。所揭示的是一合成的編碼真正的LqhIT2毒素的基因，基因中密碼子的運用是傾向于用在鱗翅目昆蟲中可高表達(dá)的桿狀病毒基因所頻繁使用的密碼子。盡管合成基因的DNA序列同天然的LqhIT2的編碼序列不同，其編碼的氨基酸序列卻與天然毒素的氨基酸序列相同，一個包含桿狀病毒啟動子，編碼一個信號肽以促進(jìn)表達(dá)毒素分泌的核酸片段及編碼毒素的合成核酸片段的嵌合基因被插入到核多角體病毒的基因組中。該嵌合基因的表達(dá)導(dǎo)致毒素有效的表達(dá)并且相對于非重組桿狀病毒而言，重組桿狀病毒的殺昆蟲特性得到增強(qiáng)。這種增強(qiáng)的活性通過對目標(biāo)昆蟲群體更快的控制并且導(dǎo)致了由這些昆蟲引起的作用因被取食而造成的損失的大大減少而得到證實。令了吃驚地，這種快速的重組桿狀病毒也表現(xiàn)也比另一種重組病毒更快的昆蟲控制，后者是通過工程處理來表達(dá)另一種昆蟲選擇性毒素，AaIT。桿狀病毒殺蟲劑極有可能提供一種對環(huán)境有好處的農(nóng)業(yè)有害昆蟲控制的辦法。然而，為使其能同目前的化學(xué)昆蟲控制藥物競爭，還需提高其效能。提高的一種辦法就是通過病毒的遺傳改變。比如，通過修飾病毒基因組來提高病毒的宿主范圍，來增加其環(huán)境穩(wěn)定性和病毒的持續(xù)性，或者可提高其感染性及傳播性，這些都是可能的。此外，提高病毒的作用效率以殺死感染的昆蟲將會極大地增強(qiáng)桿狀病毒殺蟲劑作為佐劑或化學(xué)害蟲控制劑的替代品的魅力。一種提高病毒影響昆蟲宿主的速度的辦法是導(dǎo)入編碼昆蟲毒蛋白的外源基因，這樣，昆蟲的死亡或其能力的喪失將不再單單依靠病毒的感染過程，而是也受到外源蛋白毒性水平積聚的影響。許多節(jié)肢動物生產(chǎn)被稱為毒液的一些物質(zhì)的混合物，從這些物質(zhì)由特別的腺體組織合成，這些物質(zhì)通過叮咬或穿刺裝置，可導(dǎo)致節(jié)肢動物的獵物麻痹。慢速移動或靜止的節(jié)肢動物發(fā)展了一種策略，可利用毒液中的很低濃度的神經(jīng)毒素成分使得他們的獵物很快癱瘓。這些成分或是神經(jīng)毒素通過有效地同一些特定的受體位競爭而擾亂昆蟲神經(jīng)組織的功能。許多的這類神經(jīng)毒素是多肽；它們可以根據(jù)宿主特異性的和作用方式被分為不同的類(22)。比如，從許多種蝎子中分離的神經(jīng)毒肽被分為影響節(jié)肢動物類和影響哺乳動物類。幾種節(jié)肢動物特異的毒素被認(rèn)為是昆蟲選擇性肽。比如，鉗蝎表達(dá)兩類昆蟲選擇性神經(jīng)毒素，此兩類毒素對于靶昆蟲的生物學(xué)效應(yīng)相拮抗。在麗蠅中，那些被分類為興奮性毒素的可產(chǎn)生立即的，快速的并是可逆的收縮麻痹，這是由于誘導(dǎo)并重復(fù)激發(fā)運動神經(jīng)元末梢所致(23～25)。這些毒素是單鏈多肽，約為70個氨基酸，并且通過四個二硫鍵相交聯(lián)。興奮性效應(yīng)是由于增加了鈉傳導(dǎo)性，并使電壓依賴性的通道的關(guān)閉減慢，結(jié)果是在效應(yīng)神經(jīng)元中的負(fù)電荷排出。AaIT一種產(chǎn)自蝎子Androctonusaustralis毒液的毒素，是第一個分離自那些正示出這種興奮行為的生物體昆蟲毒素。第二類的昆蟲選擇性神經(jīng)毒素是抑制性毒素，包括BjIT2(27)，LqqIT2(28)和LqhIT2(19)，這些毒素是60到65個氨基酸的多肽，它們有特別的但都是相似的一級氨基酸序列，其序列同興奮性毒素不同，這些毒素誘導(dǎo)緩慢的，漸進(jìn)的麻痹并可使昆蟲的肌肉系統(tǒng)完全松馳。這些活動是由于誘發(fā)性動作電位的阻斷造成的(28，29)，并且也是由于鈉通道傳導(dǎo)的抑制及軸突膜的去極化引起的。用于制備表達(dá)異源基因的重組桿狀病毒的方法和策略在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的(6，7，30)。這些基因表達(dá)的方法可以經(jīng)濟(jì)地在一真核表達(dá)載體系統(tǒng)中制備哺乳動物蛋白，在許多情況下可以使蛋白獲得其正確的三級構(gòu)型并且形成正確的活性必須的二硫鍵。向桿狀病毒基因組中導(dǎo)入異源基因的方法之一是通過病毒基因組DNA同一合適的含有感興趣的異源基因的“轉(zhuǎn)移載體”間的同源重組實現(xiàn)。這些轉(zhuǎn)移載體一般是可在細(xì)菌宿主中自主復(fù)制且可進(jìn)行多種遺傳操作的多種質(zhì)粒DNA。桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體還含一遺傳盒，該遺傳盒包括一經(jīng)過修飾的，含有下列特征的病毒基因組區(qū)(按5′到3′方向列出)1)含有非必需基因組區(qū)域的5′區(qū)的病毒DNA；2)病毒啟動子；3)一個或多個編碼限性酶切位點的DNA序列，以便易于異源DNA序列的插入；4)轉(zhuǎn)錄終止序列；和5)含有非必需基因組區(qū)域的3′區(qū)的病毒DNA。感興趣的異源基因插入到轉(zhuǎn)移載體上的病毒啟動子下游的限性酶切位點上。能得到的盒包括一嵌合基因，其中并源基因在轉(zhuǎn)移載體上的病毒啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列的轉(zhuǎn)錄控制下。另外，該嵌合基因的側(cè)翼區(qū)是病毒DNA序列，可促進(jìn)在病毒基因組的非必需區(qū)進(jìn)行同源重組。通過用病毒基因組DNA和重組轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞(能夠支持病毒復(fù)制)而創(chuàng)建重組病毒。同源重組發(fā)生在位于轉(zhuǎn)移載體上的側(cè)翼區(qū)的病毒DNA序列及病毒基因組DNA上的同源系列之間，并且導(dǎo)致將嵌合基因插入到病毒基因組的一個區(qū)域而不破壞病毒基本的功能。該重組基因組DNA漸漸被包裹入一感染性的重組病毒粒子中。在一優(yōu)選的的實施方案中，位于轉(zhuǎn)移載體上的病毒基因組的非必需區(qū)包括負(fù)責(zé)多角體生成的病毒DNA區(qū)域。最優(yōu)選的轉(zhuǎn)移載體應(yīng)在側(cè)翼序列間包含完整的多角體基因，側(cè)翼序列參與同源重組。用多角體生成缺陷型(由于多角體基因的基因組拷貝的缺陷造成)的病毒基因組DNA進(jìn)行重組可以導(dǎo)致多角體-陽性表型的恢復(fù)。這種策略可加快重組病毒的鑒定與篩選。在另一個實施方案中，通過向病毒基因組的非必需區(qū)中引入一個獨特的限制性酶識別序列而對桿狀病毒基因組DNA直接修飾。可構(gòu)建一個包含將要在重組病毒中表達(dá)的異源的嵌合基因，異源基因經(jīng)操作同能夠決定在桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列相聯(lián)，而且可直接將嵌合基因插入到病毒基因組上的獨特的限性位點上。這種策略可以不必構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體并能消除對于產(chǎn)生重組病毒的同源重組的依賴。這一技術(shù)由Ernst等(31)和WO94/28114(32)描述。適合轉(zhuǎn)運遺傳上編碼的昆蟲特異的神經(jīng)毒素的重組桿狀病毒載體需要毒素基因的最佳表達(dá)以達(dá)到最高的效率。熟練的技術(shù)人員可采用多種策略來設(shè)計和制備重組桿狀病毒。其中的毒素基因在感染中的合適的時刻以一種功能形式表達(dá)可以產(chǎn)生足夠量的毒素，并且可在昆蟲宿主內(nèi)結(jié)合于靶細(xì)胞。獲得最佳的基因表達(dá)的一個關(guān)鍵是選擇一個合適的決定基因轉(zhuǎn)錄的啟動子元件。已有幾種桿狀病毒的啟動子被描述，它們可在病毒生活史的不同時間介導(dǎo)不同水平的基因表達(dá)。例如，多角體啟動子是一個非常強(qiáng)的決定多角體蛋白的產(chǎn)生的桿狀病毒啟動子，最基本的蛋白包含病毒核衣殼。該基因在病毒生活史的晚期表達(dá)，并且該基因編碼的信使RNA可占到感染細(xì)胞中的總的多聚腺苷酸信使RNA的20％或更多。也可選其它啟動子，它們在病毒生活史晚期表達(dá)并有類似的強(qiáng)度，包括P10和基本啟動子。另外，有報道表明桿狀病毒啟動子可在病毒生活史早期被轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)(33～36)，啟動子包括立早啟動子IEI和IEN，延遲-早期啟動子39K或發(fā)現(xiàn)于AcNPV基因組HindIII-K片段上的一個啟動子(49)。這些啟動子可提供另外的手段來加速桿狀病毒殺蟲劑對于害蟲的控制能力。相對于由非重組病毒產(chǎn)生的殺蟲效果而言，合成毒素從重組桿狀病毒感染的細(xì)胞中分泌出來是在感染昆蟲中產(chǎn)生更快的殺蟲效果的前提(16，18)。胞外分泌的真核蛋白一段用一段短的信號肽來控制蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。然后信號肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的腔面被一信號肽酶切去，成熟蛋白，本案中為一昆蟲毒素，被包裝以便從細(xì)胞中分泌。O’Reilly等(6)的結(jié)果顯示在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中信號序列是有功能的。合適的信號序列可選自黑腹果蠅的表皮信號序列，家蠶的絨毛信號序列，煙草天蛾的載脂蛋白的信號序列，家蠶的性特異性信號序列，煙草天蛾的脂動激素的信號序列，家蠶的pBMHPC-12信號序列，黑腹果蠅的酯酶-6的信號序列和病毒的蛻皮激素糖基轉(zhuǎn)移酶的信號序列。此外，許多天然發(fā)生的位于異源真核蛋白上的信號序列在桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中也起作用以介導(dǎo)向胞外分泌。編碼信號肽和毒素蛋白核酸序列也可對毒素產(chǎn)生的量產(chǎn)生影響，并因而影響到效率和用工程化后的病毒處理昆蟲后，感染昆蟲死亡的速度。包括編碼生長的毒素多肽鏈的氨基酸密碼子在內(nèi)的核酸序列的改變允許了編碼基因的序列的變化(37)。因為每個密碼子包括三個核苷酸，而組成DNA的核苷酸是嚴(yán)格的四種特定堿基，這樣有64種核苷酸的可能組合，其中的61種編碼(氨基酸剩下的3個密碼子編碼轉(zhuǎn)錄終止信號)。結(jié)果是許多氨基酸由不止一種密碼子決定。比如，丙氨酸和脯氨酸由4個三聯(lián)體密碼編碼，絲氨酸和精氨酸由6個編碼，然而色氨酸和蛋白酶僅由一個三聯(lián)體密碼編碼。這種簡并性允許DNA堿基組成可在很廣的范圍內(nèi)變化而不改變該DNA編碼蛋白的氨基酸序列。這種簡并性的進(jìn)化發(fā)展和維持的一種假設(shè)就是由于這種幾個密碼子編碼一個單一氨基酸的靈活性而使得核酸序列中的點突變的潛在的有害結(jié)果變得最小。照此而言，并非所有的一個密碼子中的點突變都導(dǎo)致一個非期望氨基酸的引入并且因此而合成一錯義蛋白，或當(dāng)引入一轉(zhuǎn)譯終止密碼時，導(dǎo)致轉(zhuǎn)譯的不成熟終止并產(chǎn)生一個截短的蛋白。在肽鏈的生長中，許多生物體有一種偏愛，即用一特定的密碼子來引入一特定的氨基酸，密碼子優(yōu)選性或密碼子偏倚性，在生物體間的密碼子應(yīng)用有差異，是由于遺傳密碼的簡并性造成的，并且在許多生物體中的該特性均已被很好地記錄(38～43)。密碼子偏倚性通常同信使RNA(mRNA)的翻譯效率相關(guān)，除了其它因素之外轉(zhuǎn)而言之翻譯效率被認(rèn)為是依賴于被轉(zhuǎn)譯的密碼子的特性以及特別的轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)分子的存在。細(xì)胞中選中的占絕對優(yōu)點tRNAs一段是在肽合成中利用頻率最頻繁的密碼子的反映。照此而論，基于對這些轉(zhuǎn)譯因素的優(yōu)化，在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中，基因可以被加工以便獲得最佳的表達(dá)，為了利用病毒基因組所展現(xiàn)的密碼子偏倚性，可以構(gòu)建合成基因。技術(shù)人員都明白，如果密碼子的運用是傾向于用那些病毒或病毒復(fù)制于其中的細(xì)胞所喜歡的密碼子，那么就可能進(jìn)行成功的基因表達(dá)。優(yōu)選的密碼子的確定可通過詳盡地調(diào)查可得到的病毒或昆蟲基因的序列而定。然而，若昆蟲同病毒的天然宿主在進(jìn)化上相差甚遠(yuǎn)時，則從昆蟲得到的序列信息是有疑問的數(shù)據(jù)。比如，用黑腹果蠅基因組中的偏倚性密碼在AcNPV中表達(dá)異源基因是不合理的，因為蠅(比如，果蠅)和蛾(比如鱗翅目)的最近的共同祖先約在2億五千萬年前(44，45)。用于幫助在NPVs中基因表達(dá)的密碼子選擇的更有用也更具說服力的信息可通過檢查病毒的天然宿主(也就是說，鱗翅目昆蟲)基因的密碼子偏倚性以及通過檢查編碼高表達(dá)病毒蛋白的基因而得到。決定多角體蛋白和Pl0蛋白表達(dá)的NPVs的啟動子已知是一非常晚期的強(qiáng)大的啟動子，因而常被選作用于在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)異源基因。事實上，AcNPV感染昆蟲宿主細(xì)胞27到48小時后，昆蟲細(xì)胞中的多聚腺苷酸化RNA總量的20％約是多角體蛋白mRNA(46，47)。再者，多角體蛋白mRNA可被有效翻譯，導(dǎo)致大量的多角體蛋白。由于啟動子的強(qiáng)大及多角體蛋白在NPV生活史中的重要性，基于NPV多角體基因中的密碼子頻度構(gòu)建了一個合成形式的LqhIT2基因，包括來自AcNPV和黃杉毒蛾NPV的多角體基因?；谠诖?種NPV基因中密碼子的顯現(xiàn)頻率來選擇密碼子。當(dāng)組成多角體蛋白的20種氨基酸及終止信號的編碼密碼子被調(diào)查后，優(yōu)選密碼子很容易地被找出。比如，對于甘氨酸，GGC是優(yōu)勢密碼子，利用率為60％，而GCA和GGG的利用率僅分別為14％和4％。其它優(yōu)選密碼子也輕易被鑒別出，包括天冬氨酸，GAC(74％)對GAT(26％)；精氨酸，GGC(37％)或CGT(33％)對CCG(1％)或CGA(1％)；天冬酰胺，AAC(86％)對AAT(14％)；異亮氨酸，ATC(69％)對ATA(6％)；蘇氨酸，ACC(53％)對ACA(4％)或ACC(13％)，半脫氨酸，TGC(73％)對TGT(27％)；酪氨酸，TAC(81％)對TAT(19％)；苯丙氨酸，TTC(65％)對TTT(35％)；谷氨酰胺，CAA(94％)對CAG(6％)；組氨酸，CAC(83％)對CAT(17％)和脯氨酸，CCC(58％)對CCA(10％)。基于密碼子運用中的優(yōu)勢及明顯的差異，我們設(shè)計并合成了一個LqhIT2的合成基因。事實上，在NPV多角蛋白基因中觀察到的密碼子運用的差異在宿主細(xì)胞及病毒感染的生物體中也存在?？紤]了下列鱗翅昆蟲基因昆蟲基因查閱號1煙芽夜蛾細(xì)胞色素P-450U23506煙芽夜蛾保幼激素結(jié)合蛋白U22515煙芽夜蛾氣味結(jié)合蛋白S62226煙芽夜蛾外激素結(jié)合蛋白S62222煙芽夜蛾線粒體p63分子伴侶X56034煙芽夜蛾ATP酶L16884煙芽夜蛾保幼激素酯酶J04955粉蚊夜蛾P(guān)reproattacinAU46130粉蚊夜蛾溶菌酶前體蛋白U38782粉蚊夜蛾殺菌肽A前體蛋白U38645粉蚊夜蛾熱休克蛋白70U23504粉蚊夜蛾堿性保幼激素s血液蛋白2L03281粉蚊夜蛾堿性保幼激素s血液蛋白1L03280草地夜蛾內(nèi)切蛋白酶FURINZ68888草地夜蛾免疫親合蛋白FKBP46U150381基因庫在許多例子中，多角體基因同鱗翅目昆蟲基因間有相似的密碼子優(yōu)選性。比如，對于天冬氨酸，多角體基因(polh)和鱗翅昆蟲(lep)基因的密碼子GAC的利用率分別為74％和64％。其它優(yōu)選密碼子的頻率包括，異亮氨酸，ATC-polh69％和ATC-lep52％；蘇氨酸，ACC-p0lh53％和ACC-lep36％；半胱氨酸，TGC-polh73％和TGC-lep57％；酪氨酸，TAC-polh81％和TAC-lep73％；及苯丙氨酸，TTC-polh65％和TTC-lep73％。除了這些觀察到的平行性外，比較多角體基因和鱗翅昆蟲基因的密碼子頻率，在這二個基因群體間還未發(fā)現(xiàn)某一特定密碼子的運用是明顯沖突的。表1總結(jié)了從觀察到的5個核型多角體病毒的多角體基因及15個鱗翅昆蟲基因中推斷的密碼子運用的頻率。表1在NPV多角體基因和鱗翅昆蟲基因中密碼子利用頻率頻率1氨基酸密碼子多角體鱗翅目昆蟲丙氨酸GCA0.080.19GCC0.380.32GCG0.250.20GCT0.300.29精氨酸AGA0.120.17AGG0.150.23CGA0.010.09CGC0.370.26CGG0.010.08CGT0.330.16天冬酰胺AAC0.860.66AAT0.140.34天冬氨酸GAC0.740.64GAT0.260.36半胱氨酸TGC0.730.57TGT0.270.43谷氨酰胺CAA0.940.51CAG0.060.49谷氨酸GAA0.460.51GAG0.540.49甘氨酸GGA0.140.29GGC0.600.26GGG0.040.09GGT0.230.35組氨酸CAC0.830.66CAT0.170.34異亮氨酸ATA0.060.17ATC0.690.52ATT0.250.31亮氨酸CTA0.130.09CTC0.280.18CTG0.270.27CTT0.140.16TTA0.070.12TTG0.110.17賴氨酸AAA0.460.36AAG0.540.64甲硫氨酸ATG1.001.00苯丙氨酸TTC0.650.73TTT0.350.27脯氨酸CCA0.100.26CCC0.580.26CCG0.160.18CCT0.150.30絲氨酸AGC0.290.15AGT0.140.13TCA0.060.17TCC0.080.21TCG0.290.14TCT0.140.20蘇氨酸ACA0.040.23ACC0.530.36ACG0.130.14ACT0.300.27色氨酸TGG1.001.00酪氨酸TAC0.810.73TAT0.190.27纈氨酸GTA0.120.23GTC0.280.30GTG0.430.24GTT0.160.23終止子TAA1.000.48TAG0.000.33TGA0.000.191頻率值1.00＝100％在有些情況下，選擇變化的密碼子是為了加快遺傳操作。編碼LqhIT2毒素的密碼子偏倚性型的基因(序列號SEQIDNO12)同天然的LqhIT2(序列號SEQIDNO11)編碼區(qū)的cDNA拷貝相比，186個核苷酸中有41個被改變。為了制備插入到桿狀病毒載體中的密碼子經(jīng)優(yōu)化的LqhIT2基因，設(shè)計并用標(biāo)準(zhǔn)合成手段合成了5套寡聚核苷酸(圖2；SEQIDNO1～10)，每套編碼毒素蛋白的一個特定區(qū)域，每套寡核苷酸經(jīng)退火后均形成雙鏈核酸片段，并且具有特定的單鏈突出。設(shè)計突出部分是為了，有連接酶存在時，核酸片段在合適溫度下溫育，片段可以以定向的，而非隨機(jī)的方式連接到一起，這樣就會形成一編碼連有信號多肽的LqhIT2毒素多肽的單個核酸片段。此外，其5′和3′末端還有一個限性內(nèi)切酶識別位點，用適當(dāng)?shù)拿赶螅纬傻腄NA片段可容易地插入到先前制備的克隆載體的插入位點上。連接后的片段用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，分離擴(kuò)增后的DNA并用合適的限性酶消化，消化得到的片段克隆到中間質(zhì)粒載體上。該中間載體可方便插入毒素基因的操作及測序，這樣就加快了插入片段的識別鑒定，并且可以為以后的亞克隆入一合適的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體做準(zhǔn)備。經(jīng)確證的編碼毒素的片段從中間克隆載體切下并用標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆技術(shù)將之亞克隆入一桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體。在一個實施方案中，插入到轉(zhuǎn)移載體中發(fā)生在桿狀病毒的強(qiáng)大的晚期P10啟動子的下游。該P10-LqhIT2嵌合基因的5′和3′端側(cè)翼序列與桿狀病毒基因組編碼內(nèi)源多角體基因的DNA序列同源。在轉(zhuǎn)化合適的細(xì)菌宿主后，插入方向正確的轉(zhuǎn)化子的篩選是用限性內(nèi)切酶消化DNA，通過觀察消化后得到的不對稱的DNA片段的電泳遷移而確定。選出插入方向正確的克隆，制備該重組轉(zhuǎn)移載體的質(zhì)粒DNA。在另一實施方案中，合成的編碼LqhIT2毒素的結(jié)構(gòu)基因被插入到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的早期IE1啟動子和hr5增強(qiáng)子的下游區(qū)域。相對于啟動子和增強(qiáng)子而言插入方向正確的合適的遺傳構(gòu)建物的鑒定按在P10-LqhIT2轉(zhuǎn)移載體中所描述的方法進(jìn)行。通過共轉(zhuǎn)染含有處于P10或IE1啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的嵌合的信號肽毒素基因，處于多角體啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的多角體基因，以及桿狀病毒側(cè)翼DNA，和來自多角體-陰性桿狀病毒的經(jīng)純化的，線性化后的基因組DNA，成功地將合成的LqhIT2基因?qū)氲綏U狀病毒基因組中。這些DNA通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)導(dǎo)入到感受態(tài)的昆蟲細(xì)胞中。觀察單層轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的噬菌斑形成，并從噬菌斑中觀察多角體包含體的存在。包含體的存在表明含有多角體基因及編碼LqhIT2嵌合基因的轉(zhuǎn)移載體的區(qū)域同多角體-陰性桿狀病毒DNA成功地發(fā)生了重組。在轉(zhuǎn)移載體中存在有多角體基因可彌補(bǔ)桿狀病毒DNA中的多角體基因的功能缺失，這樣就為篩選重組病毒提供了方便的方法。向桿狀病毒基因組中插入LqhIT2基因形成重組桿狀病毒可被Western證明，用的是兔的LqhIT2毒素特異性的多克隆抗體。SDS-PAGE分離感染細(xì)胞抽提物后再轉(zhuǎn)至適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)上作免疫印跡分析。令人驚訝的是，同其它人所報道的數(shù)據(jù)不同，感染細(xì)胞抽提物中含有一分子量同LqhIT2相同的多肽，而特異性識別LqhIT2的抗體是用純化的LqhIT2毒素免疫獲得的。這是編碼LqhIT2蛋白的基因成功表達(dá)的首例報道。用重組及野生型AcNPV口腔感染煙芽夜蛾的一齡或三齡幼蟲后，測其存活，以所來估計表達(dá)LqhIT2的重組桿狀病毒控制靶昆蟲群體的能力。昆蟲幼蟲用接種表達(dá)LqhIT2毒素的重組病毒的食物飼喂。此外，對照昆蟲用未接種的食物或含有1)野生型，非重組病毒或2)表達(dá)AaIT，一個廣泛運用的昆蟲特異性蝎毒素的重組病毒的食物飼喂。觀察幼蟲的行為變化，直至死亡。用含有AcLqhIT2或CG201-3-1飼喂的昆蟲的死亡較那些喂以野生型病毒的昆蟲的死亡快得多。令人吃驚的是，表達(dá)在晚期P10啟動子或早期IEI啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的LqhIT2的重組病毒顯示出比表達(dá)AaIT的重組病毒更快殺昆蟲效應(yīng)。植物保護(hù)實驗也顯示了AcLqhIT2的昆蟲控制成效。昆蟲幼蟲用摻入了待測病毒或?qū)φ詹《镜氖澄镲曃?。感染后的幼蟲放于大豆植物上，并且培養(yǎng)一段適當(dāng)時間后，定量植物物質(zhì)的破壞。實驗結(jié)果顯示相對于野生型病毒和表達(dá)AaIT的重組病毒而言，AcLqhIT2處理可以很大地減少植物被破壞。本發(fā)明的組合物一般可同農(nóng)業(yè)上適宜的載體包括液體或固體溶解物共同使用?？捎玫闹苿┌▔m土、顆粒、餌、塊、懸液、濁液、濕粉、十的流動劑及類似物，需同活性組分的物理特征，使用方式和環(huán)境因子如土壤類型，濕度及溫度相一致，并能同病毒相容?？蓢姙⒅苿┛扇苡谝环N合適的介質(zhì)中，噴灑量從每畝1到幾百升。高強(qiáng)度的組分主要用作進(jìn)一步配制的中間物。制劑中應(yīng)典型包括有效劑量的活性成分，溶劑和表面劑，其范圍如下，各物質(zhì)加和為100重量百分比。重量百分比活性成分溶劑表面活性劑濕粉5-900-741-10油狀懸液，乳液5-5040-950-15溶液(包括乳化濃度)粉末1-2570-990-5顆粒、餌、塊0.01-995-99.990-15高強(qiáng)度組分90-990-100-2典型的固體溶劑在Western等的《殺蟲劑粉塵溶劑和載體手冊》第二版，DorlandBooksCaldwell.新澤西，中有敘述。典型的液體溶劑在Marsclen的《溶劑指南》第二版，Interscience，紐約，(1950)中有敘述。AlluredCorp.，Ridgewood，新澤西，出版的《MoCutcheon’s洗滌劑和乳化劑年鑒》以及ChemicalPubl.Co.Inc.，紐約，(1964)，出版的由Sisely和Wood編寫的《表面活性劑百科全書》列出了表面活性劑并推薦了其應(yīng)用。所有制劑中均包含少量添加劑以減少泡沫，成塊，腐蝕，微生物的生長及諸如此類的事，應(yīng)注意保證所有的組合物中的成分應(yīng)是相互相容的且不能導(dǎo)致病毒感染活性的喪失。好的固體組合物應(yīng)是在一錘擊磨或液體能量磨中通過混合和研磨制得。水分散顆?？赏ㄟ^凝聚一好的粉末組合物生產(chǎn)；參見Cooss等《殺蟲劑配方》，華盛頓D.C.(1988)251～259頁的實例懸液可通過濕磨制備，參見U.S.3,060,084中的實例。顆粒和丸可通過向顆粒狀載體上噴灑活性物質(zhì)或通過凝集技術(shù)制作。參看Browning，“凝集反應(yīng)”，化學(xué)工程，12月4日，1967，147～148頁，《Perry’s化學(xué)工程師手冊》第四版，McGraw-Hill，紐約，(1963)，8～57頁及其后，以及WO91/13546。若想進(jìn)一步了解配方工藝方面的信息，參見U.S.3,235,361，6卷16行到7卷19行以及實例10～41；U.S.3,309,192，5卷43行或7卷62行及實例8，12，15，39，41，52，53，58，132，138～240，162～164，166，167和169～182；U.S.2,891,855，3卷66行到5卷17行以及實例1～4；Klingman的《雜草控制科學(xué)》，JohnWiley和Sons，Inc.，紐約，(1961)，81～96頁；以及Hance等的《雜草控制手冊)》，第八版，BlackwellScientificPublications，劍橋，(1989)。下面的例子中，均是重量百分比且所有配方均按常規(guī)方法制備。實施例A濕粉桿狀病毒65.0％十二烷基苯酚聚乙二醇醚2.0％木素碳酸鈉4.0％硅鋁酸鈉6.0％蒙脫石(煅燒過的)23.0％實施例B顆粒桿狀病毒10.0％硅鎂土顆粒(低揮發(fā)物質(zhì)，0.71/0.30mm；U.S.S.No.25～50篩)實施例C擠出的丸桿狀病毒25.0％脫水硫酸鈉10.0％粗木素磺酸鈣5.0％烷基萘磺酸鈉1.0％鈣/鎂皂土59.0％本發(fā)明的組合物展示出廣譜的抗鱗翅目害蟲的活性，這些害蟲為食葉的，食果實的，食莖的和食種子的，它們對農(nóng)業(yè)、林業(yè)、溫室作物、觀賞作物、苗圃作物及纖維產(chǎn)品影響嚴(yán)重。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會理解并非所有組合物對于所有害蟲的所有發(fā)育階段同樣有效。然而，本發(fā)明中的所有組合物均顯示出抗鱗翅目幼蟲的活性。特別地，這些組合物可抗秋天的粘蟲(草地夜蛾)，煙草芽蟲(煙芽夜蛾)，玉米鈴蟲(HelicoverpaZea)，美洲棉鈴蟲(棉鈴蟲)，甜菜粘蟲(甜菜夜蛾)，鉆石背蠶蛾(小菜蛾)和卷心菜尺蠖(粉紋夜蛾)。本發(fā)明的組合物還可同一種或多種其它的殺蟲劑，殺真菌劑，殺螨劑或其它生物活性復(fù)合物混在一起形成一各組分的殺蟲劑，這就有了更廣的農(nóng)業(yè)防護(hù)譜。能同本發(fā)明的重組病毒相配使用的其它農(nóng)業(yè)保護(hù)劑的例子有殺蟲劑鈉通道激動劑(即擬除蟲菊酯類)，鈉通道阻斷劑(即，吡唑啉類)，乙酰膽堿酯酶抑制劑(即，有機(jī)磷類及氨基甲酸類)、尼古丁乙酰膽堿結(jié)合劑，gabaergic結(jié)合劑，Octapine激動劑或拮抗劑(即甲脒類)及帶氧體解偶聯(lián)劑(即，吡咯殺蟲劑)。特定的可同本發(fā)明的重組桿狀病毒混合殺蟲劑的例子有avermectinB，久效磷，殺蟲威，馬拉松，對硫磷-甲基，地亞農(nóng)，溴丙磷，乙丙硫磷，triflumuron，氟脲殺，蒙五一五，buprofezin，thiodicarbf，殺蟲靈，甲基谷硫磷，毒死蜱，樂果，fipronil，flufenprox，地蟲磷，丙胺磷殺撲磷，甲胺磷，亞胺硫磷，磷胺，伏殺磷，抗蚜威，甲拌磷，特丁磷，敵百蟲，甲氧氯，bifnthrin，biphenate，tefluthrin，分撲菊酯，fluvalinate，imidacloprid，四聚乙醛和魚藤酮。此外，殺真菌劑也可同本發(fā)明的重組病毒混合，其中包括多菌靈，福靈聯(lián)，十二烷胍、代森錳，地茂散，苯菌靈，cymoxanil，fenpropidine，fenpropimorph，triadimefon，克菌丹，甲基托布津，涕必靈，phosethyl-Al，百菌清，氯硝胺，氨丙靈，敵菌丹，二氯苯甲乙基二氧咪唑烷羥酰胺，oxadixyl，烯菌酮，春雷霉素，myclobutanil，tebuvnazole，difenoconazole，diniconazole，fluquincorazole，ipconazole，metconazole，penconazole，propiconazole，uniconzole，flutriafol，prochloraz，pyrifenox，fenarimol，氯苯氧基二甲乙基三唑乙醇，diclobutrazol，氯氧化銅，呋氨丙靈，滅菌丹，flusilazal，殺稻瘟菌素S，diclomezine，克瘟散，富士一號，iprobenfos，mepronil，新一硫甲胂，pencycuron，噻菌靈，pyroquilon，tricydazole，有效霉素，和flutolanil。在一些特定例中，因其它殺蟲劑配合使用有相近的控制范圍但對抗性處理而言，不同的作用方式都有特定的好處。通過向害蟲的包括農(nóng)學(xué)和/或非農(nóng)學(xué)的感染部位的環(huán)境中，向需預(yù)防的地區(qū)，或者直接向受控害蟲施用有效劑量的本發(fā)明的一種或多種組合物，可使鱗翅目害蟲得到控制，并保護(hù)了農(nóng)藝，園藝和特種作物，以及人類健康。優(yōu)選的施用方法是噴霧，可替代地，這些化合物的顆粒制劑也可施于植物的葉子或土壤中。施用的其它方法包括直接或滯留噴霧，空中噴霧，種子包被，微囊，系統(tǒng)攝取，霧劑，氣溶膠，粉塵或其它多種方法，該組合物可滲入到昆蟲要吃的食物(餌)中或放入諸如捕捉器之類的裝置中。該組合物可以其純的形式施用，但最常用的還是以一種含有桿狀病毒及合適的載體，稀釋劑和表面活性劑的制劑使用而且根據(jù)深思熟慮后的最終用途，很可能同一種食物(餌)結(jié)合使用。施用的優(yōu)選方法包括噴灑節(jié)肢動物殺滅劑的水分散劑或精煉的油懸液。同噴霧油、濃縮噴霧油、噴灑劑桿、佐劑、溶劑和協(xié)同劑的聯(lián)用常能增強(qiáng)殺滅節(jié)肢動物的效率。有效控制所需的施用率依賴于諸如受控昆蟲的種類，害蟲的生活史，生活階段，大小，分布，一年中所處時間，宿主作物或動物，取食行為，交配行為，環(huán)境濕度，溫度及類似的因素的影響。在正常環(huán)境下，每畝約0.01到0.05kg的活性成分的施用率足以在農(nóng)學(xué)生態(tài)系統(tǒng)中控制害蟲，但也可能少至0.001kg/公頃的用量就足夠或者是每公頃需要1kg。對于非農(nóng)學(xué)施用，有效使用率在1.0到50mg/平方米的范圍內(nèi)，但也可能少至0.1mg/平方米就足夠或是要用到150mg/平方米。實施例1構(gòu)建合成的LqhIT2結(jié)構(gòu)基因為了制備NPV-偏倚性形式的LqhIT2基因，設(shè)計并用標(biāo)準(zhǔn)的磷亞酰胺化學(xué)合成成了10個寡核苷酸(圖2SEQIDNO1～10)。這些寡核苷酸按照圖3中所描述的流程，采用廠商推薦的方案，用Gibco/BRL(Gaithersburg)公司的激酶磷酸化，退火結(jié)合并用Gibco/BRL的連接酶連接。連接所得片段用PE公司AmpliTaqTM聚合酶(Norwalk，CT)按照廠商方案用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，其修改在下文描述。寡核苷酸Lq1(SEQIDNO1)被用作正向引物而Lq10(SEQIDNOl0)用作逆向引物。這些方案的詳述見下。進(jìn)行了10個獨立的磷酸化反應(yīng)(每個寡核苷酸一個反應(yīng))。每種寡核苷酸(SEQIDNO1～10)取250pmol各放于一個1.5mL微量離心管中。5μl的10×激酶緩沖液，1μl的1mMATP，6μl的激酶(Gibco/BRL，10單位/μl)，以及足量的水隨后加入到每管中以使總的反應(yīng)體積為50μl。10個管于37℃溫育1小時。溫育后，每種磷酸化后的寡核苷酸取5μl(25pmol)放于同一個微量離心管中，將該管置于95℃的干熱加熱塊上。關(guān)閉加熱塊并使之冷卻到室溫以加速磷酸化的寡核苷酸的退火結(jié)合。50μl的磷酸化的，退火結(jié)合的寡核苷酸移于另一微量離心管中，再加入15μl的5×連接酶緩沖液，3μl的10mMATP，4μl的連接酶(Gibco/BRL，5單位/μl)和3μl的去離子水。于37℃將此管溫育30分鐘然后于室溫下過夜。包含退火結(jié)合的和經(jīng)連結(jié)的合成核酸片段用PCR擴(kuò)增，以不同的模板DNA(含有經(jīng)磷酸化，退火結(jié)合并聯(lián)結(jié)后的寡核苷酸)稀釋度做3個PCR反應(yīng)。所用PCR反應(yīng)混合物如下61.5μL去離子水10μL10×PCR緩沖液(Perkin-ElmerCetus)2μLdATP，dCTP，dGTP，dTTP(每種200μM)0.5μLAmpliTaqTM聚合酶(2.5單位/100μL)模板DNA用去離子水稀釋為1∶100，1∶1,000和1∶10,000(體積比)。分別向3個0.5ml微量離心管中移入80μl反應(yīng)混合物。再分別向每管中加入5μl(100pmol)的寡核苷酸Lq1(SEQIDNO1)和5μl(100pmol)的寡核苷酸Lq10(SEQIDNO10)(用作PCR的正向及逆向引物)。向每管中加入經(jīng)適當(dāng)稀釋后的10μl模板。用PE公司的DNA熱循環(huán)儀按下列擴(kuò)增方案進(jìn)行PCR反應(yīng)步驟196℃3分鐘1個循環(huán)75℃3分鐘步驟295℃30秒25個循環(huán)75℃2分鐘步驟395℃30秒1個循環(huán)75℃5分鐘擴(kuò)增產(chǎn)物用2％瓊脂糖膠電泳分析。每個反應(yīng)均可見一約為300堿基對的擴(kuò)增片段。LqhIT2基因及側(cè)翼序列經(jīng)PCR擴(kuò)增后，用1.2％瓊脂糖膠分離該300bp帶并用SpinBindDNA回收系統(tǒng)(FMC，Rockland，ME)按廠商說明純化此帶，分離的片段用BamHI消化以使含有LqhIT2基因及信號序列的合成寡核苷酸產(chǎn)生5′和3′的粘性末端。消化后的片段用常規(guī)的分子克隆技術(shù)插入到質(zhì)粒pTZ-18R(發(fā)瑪西亞，Piscataway，NJ)的BamHI克隆位點上。將pTZ-18R轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLlBLue(Stratagene，Menasha，WI)后，篩克隆并制備質(zhì)粒DNA。鑒定出8個陽性克隆并且用市售的pTZ-18R的正向逆向引物(發(fā)瑪西亞)測序。有一個克隆(16號)被發(fā)現(xiàn)含有編碼合成基因及信號序列的正確序列。所得質(zhì)粒含有2個BamHI位點一個接近毒素基因5′末端，另一個在終止密碼子后。按常規(guī)辦法制備質(zhì)粒DNA，并用BamHI消化以切下含有LqhIT2基因及信號序列的300堿基對片段。通過在1.6％瓊脂糖膠上電泳將此片段同載體分離，將對應(yīng)于該片段的帶切去并用SpinBindTMDNA回收方法(FMC)純化之。實施例2含有處于桿狀病毒晚期啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的合成的LqhIT2結(jié)構(gòu)基因的重組AcNPV的構(gòu)建及檢測經(jīng)純化的LqhIT2基因片段用常規(guī)的分子克隆技術(shù)插入到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcUW21(Pharmingen，圣迭戈，加州)的BglII位點上，該亞克隆導(dǎo)致了合成基因插入到載體所帶的P10啟動子的3′端，而且在位于轉(zhuǎn)移載體上的非-功能LacZ片段的5′端，連接后，DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLlBlue(Stratagene)。連接后，BglII和BamHI位點均被破壞，所得質(zhì)粒用位于LqhIT2基因3′末端的非對稱SphI位點篩選。二十三個轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA的電泳分析表明有3個陽性克隆。用SphI(切割LqhIT2基因3′末端)和BamHI(切割位于轉(zhuǎn)移載體上的多角體基因的編碼序列區(qū))同時消化質(zhì)粒來驗證插入的方向。鑒定出一個帶有LqhIT2基因且插入方向正確的克隆。該構(gòu)建物使得LqhIT2合成的結(jié)構(gòu)基因插入到P10啟動子下游且在多角體基因上游(pAcUW21.LqhIT2；見圖5)。草地夜蛾細(xì)胞(sf-9)用含有3.0％胎牛血清的ExCellTM401培養(yǎng)基(TRHBiosciences，Lenexa，KS)擴(kuò)增培養(yǎng)。向50μl的pAcUW21.LqhIT2(500μg)和線性化的多角體基因-缺陷型AcNPV(2.5μg，BaculogoldTM病毒DNA，pharmingen)中加入LipofectinTM(50μl，濃度0.1mg/ml，Gibco/BRL)。用病毒DNA/轉(zhuǎn)移載體溶液其轉(zhuǎn)染sf-9細(xì)胞(約50％單層時)。共轉(zhuǎn)染后5天收集上清液并用常規(guī)的噬斑純化方法，其中僅能選中多角體-陽性噬斑(12)分離重組病毒?？偣策x出7個斑塊；每個都懸于500μl的含有2.5％胎牛血清的ExCellTM培養(yǎng)基中。用100μl的病毒懸液接種長于35mM碟子中的sf-9細(xì)胞(50％單層時)，并于感染后5天收集上清液。為了制備大量病毒用于定性，這些上清液用于接種更大量的組織培養(yǎng)物以使重組病毒大規(guī)模擴(kuò)增。用免疫印跡及生物方法證明LqhIT2基因插入到桿狀病毒基因組中。sf-9細(xì)胞用野生型AcNPV(對照)或AcLqhIT2(5個不同的分離物)感染。三天后，收集感染細(xì)胞并且用離心細(xì)胞懸液以去除生長培養(yǎng)基。傾去消耗過的培養(yǎng)基，剩余細(xì)胞用BransonSonifierTM(450型)在裝置2裂解30秒。用一冷凍微量離心機(jī)(4℃)有15,000rpm離心10分鐘以去除細(xì)胞碎片。根據(jù)廠商的說明用BCA蛋白測定(Pierce，Rockford，IL)對感染的經(jīng)超聲裂解的細(xì)胞的蛋白濃度進(jìn)行定量。制作基于已知濃度的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品和標(biāo)準(zhǔn)在37℃溫育30分鐘。用分光光度計測量562nm的光吸收。用線性回歸分析來確定每個樣品的蛋白濃度。各個定量樣品的蛋白用蛋白電泳分離。用去離子水將樣品稀釋至324mg/ml蛋白。向75μl的電泳上樣緩沖液(3.8ml去離子水，1.0ml0.5MTris-HCl，pH6.8，0.8ml甘油，1.6ml10％(重量/體積)SDS，0.04mlβ-巰基乙醇；0.4ml0.5％溴酚藍(lán))中加入25μL的樣品。用100μl上樣緩沖液稀釋1μl生物素化的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(Gibco)以制備分子量標(biāo)準(zhǔn)。然后將樣品及標(biāo)準(zhǔn)在95℃加熱2分鐘。向15％小蛋白IITris-HCl制成膠(伯樂，Melvile，NY)上樣(20μl/孔)。向已裝好的電泳裝置中加入電泳緩沖液(1升去離子水中含3gTris堿，14.4g甘氨酸，1.0gSDS)，樣品在40mA電流下電泳約1.5小時。電泳后，用Western印跡法將分離的蛋白從膠上轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。將印跡紙(3MM；Schleicher和Schuell，Keene，NH)和硝酸纖維素膜切得同膠差不多大小并浸于Western轉(zhuǎn)移緩沖液(11.6gTris堿，pH8.3，5.8g甘氨酸，0.74gSDS，400毫升甲醇，1.6L去離子水)中。印跡紙，硝酸纖維素膜和膠按下列順序放置3層印跡紙，膠，硝酸纖維素膜；和3張印跡紙。這種“三明治”結(jié)構(gòu)放在轉(zhuǎn)移儀上，使得膠向著負(fù)極而硝酸纖維素膜向著正極。通過向轉(zhuǎn)移儀通電4小時，60mA，而將蛋白轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移后，拆除轉(zhuǎn)移儀并于空氣中干燥硝酸纖維素膜。轉(zhuǎn)移蛋白的免疫印跡分析按下步驟進(jìn)行，所有操作均在室溫下于一轉(zhuǎn)動振蕩器中進(jìn)行。硝酸纖維素膜上未被轉(zhuǎn)移蛋白覆蓋的位點用溶于TTBS(20mMTris，500mMNaCl，pH7.5，0.05％吐溫-20)中的3％(重量體積比)的膠原封閉30分鐘，移去封閉液并用100mlTTBS潤洗5分鐘膜。向10mlTTBS中加入10μl兔抗體以制備LqhIT2-特異的兔多克隆抗體(從BruceHammock博士處得到，U.C.Davis.Dauis，CA)一抗溶液加到已經(jīng)封閉的硝酸纖維素膜上并溫育1小時。然后，硝酸纖維素膜用100mLTTBS洗10分鐘，重復(fù)三次。向20mlTTBS中加入10μl過氧化物酶聯(lián)結(jié)的羊抗兔IgG(Sigma&amp;Louis，MO)和10μl過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親合素以制成二抗。將膜同二抗溫育1小時。溫育后，用100mlTTBS洗膜10分鐘，重復(fù)三次。向硝酸纖維素膜上加上檢測試劑(ECL檢測試劑盒；Amersham，ArlingHeighos，IL)并溫育60秒。控干膜上的檢測試劑，向膜上蓋一層SaranWrap膜。將處理后的膜對X-線片(柯達(dá)X-OMATAR，Rochester，NY)曝光2到10秒以檢測膜上的信號。所有的5個AcLqhIT2分離物于7,000Mr處均有陽性的免疫印跡反應(yīng)，而AcAaIT的信號則未能檢測到。篩選了5個獨立的AcLqhIT2分離物以測其生物學(xué)活性。這種方法包括比較AcLqhIT2重組病毒和野生型AcNPV(對照)及表達(dá)AalT毒素的重組AcNPVs的生物學(xué)活性。煙芽夜蛾的三齡幼蟲由于取食含有待檢病毒及對照病毒的食物而被口腔感染，然后觀測其行為變化及死亡。富集感染了AcLqhIT2，AcNPV及AcAaIT的細(xì)胞，通過0.5％重量/體積的十二烷基磺酸鈉，5MNaCl及去離子水的逐漸洗滌使得PIBs釋放。水洗后，將游離的PIBs懸于小量的去離子水中，并用血球計數(shù)法計數(shù)，值得注意的是感染四天后，以AcLqhIT2感染的Sf-9細(xì)胞產(chǎn)生的PIBs及細(xì)胞碎片要比感染了野生型病毒AcNPV及AcAaIT的細(xì)胞產(chǎn)生的少得多。各單獨的標(biāo)準(zhǔn)的昆蟲食物栓(Plugs)接種大約5000PIBs。在開始本生物方法前，先將幼蟲饑餓12小時，然后讓其取食這種食物24小時。將幼蟲轉(zhuǎn)至-取食盤的不同的孔中并每天觀測其癥狀及死亡。這種初始的生物方法顯示了取食含有AcLqhIT2和AcAaIT病毒的食物后誘發(fā)的癱瘓。令人吃驚地，AcLqhIT2顯示出比野生型AcNPV或AcAaIT病毒快得多的殺死幼蟲的現(xiàn)象。選取三個經(jīng)檢測的AcLqhIT2分離物及最好的AcAaIT病毒以做下一步測試。又一次地，結(jié)果顯示出AcLqhIT2病毒可導(dǎo)致比任一種對照病毒快得多的死亡。已著手進(jìn)行該重組病毒的殺蟲效果的總體評價。早期觀察顯示AcNPV表達(dá)的LqhIT2在昆蟲細(xì)胞中可產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。進(jìn)而，由于細(xì)胞毒作用，同野生型AcNPV及AcAaIT相比，AcLqhIT2使每細(xì)胞產(chǎn)生的PIBs大大減少。事實上，用AcLqhIT2感染后的細(xì)胞培養(yǎng)物PIB的平均生成量為5.03×107/100ml的細(xì)胞培養(yǎng)基，而AcAaIT及野生型AcNPV的每100ml細(xì)胞培養(yǎng)基中PIB的量為大于1.9×109。為了制備更大量的AcLqhIT2重組PIBs，將病毒于體內(nèi)增殖。為得到體內(nèi)產(chǎn)生的AcLqhIT2，AcAaIT和野生型AcNPV的PIBs，將從初始生物方法中得到的昆蟲死尸在去離子水中勻漿，然后用探頭超聲并過濾以去除細(xì)胞碎片。然后，PIBs用標(biāo)準(zhǔn)的血球計數(shù)器計數(shù)。用一些實驗來整體分析病毒誘導(dǎo)的昆蟲的死亡，其中煙芽夜蛾的三齡幼蟲用受試病毒及對照病毒感染，然后觀察死亡的發(fā)生。概率單位分析方案(48)用于獲得時間-死亡和劑量-死亡曲線(表2)，并且用于測試重組于(AcLqhIT2和AcAaIT)和野生型AcNPVs的重要生物活性差異。致死時間(LTs)是通過讓饑餓昆蟲于接種有2500PIBs/栓的食物栓上取食24小時而得到。這些昆蟲然后將移至單獨的食物孔中并進(jìn)行常規(guī)監(jiān)測(至少一天二次)其死亡和/或癱瘓。AcLqhIT2、AcAaIT和野生型AcPNV的大致的LT50(殺死暴露于病毒的昆蟲的50％的時間；8次重復(fù)，每次重復(fù)16個幼蟲，n＝128昆蟲/每次處理)分別為感染后82.7，97.9和118小時。相似率測驗(相等的斜率和截距，C.I.＝0.95)表明在各種處理間有很大的差異用重組病毒，AcLqhIT2和AcAaIT處理的，同感染野生型AcNPV相比，有低得多的LT值。進(jìn)一步，重組病毒AcLqhIT2和AcAaIT的斜率和截距的直接比較證明AcLqhIT2的LT50值要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于AcAaIT的LT50值。在第二組實驗中，確定了致死量(LDs)。煙芽夜蛾的三齡幼蟲用接種了AcLqhIT2，AcAaIT，野生型AcNPV和共接種的食物飼喂。制備的融化食物中含有不同劑量的病毒以在樣品群中建立一劑量曲線。食物栓中的PIB濃度范圍為每mL食物中對數(shù)劑量從1×102到1×104PIB。喂食后94到160小時間，監(jiān)測試驗中的死亡。AcLqhIT2，AcAaIT和野生型AcNPV大致的LD50S(殺死50％的暴露于病毒的昆蟲所需的PIBs數(shù)量；4次重復(fù)，25個幼蟲每次重復(fù)，n＝100昆蟲/每次處理)分別為8.29×l02、9.15×102和1.19×103PIB/mL。相似率測試(同樣的斜率和距，C.I.＝0.95)顯示這三種病毒處理的效力沒有明顯的差異(表2)。表2重組病毒對煙草夜蛾三齡幼蟲的致死劑量和致死時間</tables>a，b，c同其它處理有重要區(qū)別-POLO概率單位分析程序(C.I.0.95)PIBs＝多角包含體LD＝致死劑量LT＝致死時間進(jìn)一步的病毒效率的評估是在二周的大豆(Williams)植株上做的，植株植于盛有METROMIX350生長培養(yǎng)基(Grace-Sierra，Milpitas，CA)的4平方寸盆中。這些植株生長于26℃的溫室中。煙芽夜蛾的二齡幼蟲暴露于病毒處理24小時，即將病毒以已經(jīng)計算的，可導(dǎo)至超過99％的被處理昆蟲產(chǎn)生致命感染的濃度滲入到食物中。暴露期后，感染后的昆蟲被轉(zhuǎn)至植株上。植株檢測單位的結(jié)構(gòu)中包含一包在一頂部開放的透明塑料管中的大豆植株。一層白色石英砂撒在培養(yǎng)基上以便能很容易地辨別出落于其上的昆蟲。向植株上放三只處理過的昆蟲并蓋上塑料管上的蓋，每次處理用十株植株。檢測單位放于一房間中，房中按16小時照光和8小時黑暗循環(huán)，并且供以需要的水分。實驗的最后(所有處理過的昆蟲均死亡)，拆下檢測單位并且用Li-Cor葉子面積計(Li-Cor，Lincoln，NE)稱量植株的物質(zhì)。對于野生型AcNPV，AcAaIT和AcLqhIT2殘留的平均植株面積分別為154，199，223cm2，同時，未經(jīng)處理的植株(對照)的物質(zhì)的平均量為243cm2。這些數(shù)據(jù)顯示了相對于未感染植株而言，野生型AcNPV，AcAaIT和AcLqhIT2的植株保護(hù)百分比分別為63.6，82.2和92.1(圖7)。很明顯，表達(dá)毒素的重組病毒可提供更強(qiáng)的保護(hù)，并且AcLqhIT提供的保護(hù)以遠(yuǎn)強(qiáng)于AcAaIT提供的。實施例3含有合成的，處于桿狀病毒早期啟動子轉(zhuǎn)錄控制下的AcLqhIT2結(jié)構(gòu)基因的重組AcNPV的構(gòu)建和測試用實施例2中所述的辦法，將實施例1中的純化的AcLqhIT2結(jié)構(gòu)基因片段插入到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體PAcP+IE1TV3(由DonaldJarvis博士提供，德克薩斯農(nóng)業(yè)實驗站，德克薩斯A&amp;M大學(xué)，學(xué)院站，德州)的BglI克隆位點上。該轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒是描述于美國專利第5,162,222號中的桿狀病毒早期啟動子轉(zhuǎn)移載體的一個衍生物，此專利引入這里作為參考。這一構(gòu)建物使得編碼AcLqhIT2毒素的合成的結(jié)構(gòu)基因插入到桿狀病毒早期IE1啟動子和hr5增強(qiáng)子區(qū)域下游連接后，將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLlBlue(Stratagene)。連接的結(jié)果使得BalII和BamHI位點均被破壞，得到的轉(zhuǎn)化子因含有一位于AcLqhIT2基因3′末端的包含獨特的非對稱的SphI位點的質(zhì)粒而得到篩選。從24個轉(zhuǎn)化子分離的質(zhì)粒DNA經(jīng)電泳分析，鑒定出23個SphI陽性克隆。通過同時用SphI(切割A(yù)cLqhIT2基因3′末端)和StuI(切割位于BglII克隆位點下游的轉(zhuǎn)移載體的多克隆位點的編碼序列內(nèi)部)消化質(zhì)粒而證明插入的方向。分析了8個克隆，相對于從早期IE1啟動子/hr5增強(qiáng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄的方向而言，其中的四個克隆含有方向正確的AcLqhIT2基因。從其中的一個克隆即CG201-3，分離得到的DNA通過共轉(zhuǎn)染用來創(chuàng)建重組桿狀病毒表達(dá)載體，基本上按照實施例2中描述的方案進(jìn)行。分離噬斑并用組織培養(yǎng)擴(kuò)增，并用實施例2中描述的方案，用生物方法確定其殺昆蟲活力。用受試和對照病毒感染煙草夜蛾的新生幼蟲并觀察死亡的產(chǎn)生。在這套生物學(xué)方法中，病毒在1.0×104PIBs/ml的濃度滲入到昆蟲食物中。概率單位分析方法(98)用來獲得時間-死亡曲線并用于檢測重組病毒(CG201-3-1和AcLqhIT)和野生型AcNPV的生物活性的重要的差異。CG201-3-1，AcLqhIT和野生型AcNPV的大致的LT50(50％被處理昆蟲死亡的時間)分別為44.4，61.5和91.0(4次重復(fù)，每次重復(fù)用25個幼蟲，每次處理n＝100昆蟲；表3)。相似率測試(C.I.＝0.95)表明處理間存在顯著差異，揭示了使用任一種重組病毒均可導(dǎo)至比用野生型AcNPV更快的死亡。更具體地說，CG201-3-1的LT值較AcLqhIT要低得多，表明這種重組病毒可更快地殺死被處理的昆蟲。這些數(shù)據(jù)顯示了運用早期啟動子來驅(qū)動一個密碼子偏倚性的，合成的編碼昆蟲毒素的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)可以減少所需死亡時間27.8％。這是同運用晚期啟動子控制的表達(dá)相同的結(jié)構(gòu)基因的病毒相比而得出的值。進(jìn)一步，這些數(shù)據(jù)顯示了同用非重組的，野生型AcNPV處理的對照相比，用表達(dá)-受到早期啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的合成的毒素基因的病毒可使受處理的昆蟲幼蟲的死亡時間縮短50％以上。表3重組病毒對煙芽夜蛾1齡幼蟲的致死時間病毒LT(小時)105090CG201-3-132.7a44.4a60.3aAcLqhIT47.4b61.5b79.6b野生型AcNPV75.9c91.0c109ca，b，c同其它處理有重要區(qū)別-POLO概率單位分析程序(C.I.0.95)LT＝致死時間實施例4包含合成的AcLqhIT2結(jié)構(gòu)基因的重組AcNPV的構(gòu)建和檢測，該基因是基于分離自蝎子Leurusquinquestriatushebraeus的LqhIT2基因的互補(bǔ)DNA為了評估由NPV-密碼子傾向的AcLqhIT2基因提供的較其cDNA形式所增加的有效性，合成了cDNA基因并用類似于實施例1，2和3中所描述的方法將其插入到AcNPV病毒基因組中。合成的cDNAAcLqhIT2基因的生成，分離，亞克隆和檢測按照實施例1中描述的類似于密碼子偏倚性的AcLqhIT2基因的方式進(jìn)行。為了制備AcLqhIT2基因的cDNA，設(shè)計并用常規(guī)的磷酰亞胺化學(xué)法合成了10個寡核苷酸。這些寡核苷酸按照圖3中描述的流程用Gibco/BRL(Gaithersburg，MD)的激酶磷酸化，退火結(jié)合并用Gibco/BRL的連接酶連接，用的方法是廠商所推薦的方法。連接后的片段用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，用的酶是Perkin-ElmerCetus的AmpliTaq聚合酶(Norwalk，CT)，擴(kuò)增方案是廠商提供的方案并作了下述的一些修改。PCR擴(kuò)增后，按照OrigimalTA克隆試劑盒(Invitrogen圣地亞哥，加州)中所提供的辦法將基因產(chǎn)物克隆到PCRTMII載體上。連接后，轉(zhuǎn)化并作限性酶圖譜分析，對幾個克隆測序并且有一個克隆被證明是編碼家蠶素信號序列和AcLqhIT2基因的cDNA。將此基因插入到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcP+IE1TV3的SacI/NotI克隆位點上。按照實施例2中詳述的方案構(gòu)建重組AcNPVs。5個編碼AcLqhIT2基因cDNA(IC735)的重組病毒候選者經(jīng)增殖后，檢測病毒的效應(yīng)，按照致死時間值選出最好的病毒分離物，密碼子偏倚性AcLqhIT2(CG201-3-1)，AcLqhIT2(IC735-1)的CDNA及野生型AcNPV(IC200-27)的致死時間特性通過進(jìn)行對煙芽夜蛾新生幼蟲和三齡，四齡幼蟲的感染實驗而得知，并確定任何的在致死時間上的重要差異(表4)。對于三齡和四齡幼蟲，用食物藥丸法來確定其LT50值。存貯的病毒制備物用Reichert-Jung明線血球計數(shù)計來量化。用去離子水將病毒懸液配成終濃度為1000～2000PIBs/ml。向十六孔聚苯乙烯板的每孔中均放50μl食物藥丸。50000OBs的劑量施用于每個50μl食物藥丸的表面使該病毒處理干燥。每孔中放入一幼蟲；將孔封閉并于28℃溫育。完全吃光一個食物藥丸后(約24hrs)，將幼蟲轉(zhuǎn)入未經(jīng)處理的昆蟲培養(yǎng)基并且每日三次定值其死亡。對于新生幼蟲，用食物摻入法來確定LT50值。存貯的病毒制備物用Reichert-Jung明線血球計數(shù)計量化并用去離子水稀釋成1.0×105PIBs/ml的濃度。最終，1∶10稀釋液用于昆蟲培養(yǎng)基中。這一含病毒的培養(yǎng)基混勻30秒以保證濃度為1.0×104PIBs/ml的病毒包含體懸液形成均一懸液。將此培養(yǎng)基倒入聚苯乙烯板的孔中，每板含25孔。每孔中約加入了2ml的食物。接種培養(yǎng)基固化后，向每孔中放入一煙草夜蛾新生幼蟲。封閉孔并于28℃溫育。每天二次定值幼蟲的死亡。這些實驗中所得數(shù)據(jù)用Vistat統(tǒng)計分析包(50)來分析。對于所有受試的三個階段的幼蟲，編碼密碼子偏倚性AcLqhIT2基因的CG201-3-1殺死昆蟲幼蟲要比IC73501(LqhIT2的cDNA)以及IC200-27(野生型AcNPV)快得多。同IC735-1相比，密碼子優(yōu)化的CG201-3-1的LT50值的減少在統(tǒng)計學(xué)上是重要的，對于三齡和四齡的煙芽夜蛾幼蟲而講，致死時間分別減少22％和9％(表4)。對于新生幼蟲和三齡幼蟲，LT90S的差異則更加明顯，用密碼子優(yōu)化的構(gòu)建物，CG201-3-1(48)可使死亡時間分別減少約15％和32％。表4重組或野生型病毒對煙芽夜新生及各齡幼蟲的致死時間(LT50)病毒LT50(小時)新生三齡四齡CG201-3-161.762.969.3IC735-165.081.076.1野生型AcNPV102113111參考文獻(xiàn)(1)Granados，R.R.，Lawler，K.A.病毒學(xué)(1981)，108，297-308。(2)Vlak，J.M.，Rohrmann，G.F.生物控制中的病毒殺蟲劑Maramorosch，K.，Sherman，K.E.，Eds.，AcademicPress，NewYork，NY.(1985)，489-542。(3)Carbonell，L.F.，Klowden，M.J；Miller，L.K.病毒學(xué)雜志(1985)，56，153-160。(4)Carbonell，L.F，Miller，L.K.應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)(1987)，53，1412-1417。(5)Brusca，J.，Summers，M.，Couch，J.，Courtney，L.國際病毒學(xué)(1986)，26，207-222。(6)O’Reilly，D，R.，Miller，L.K.，Luckow，V.A.(1992)，桿狀病毒表達(dá)載體實驗手冊，W.H.FreemanandCompany，NewYork。(7)King，L.A.，Possee，R.D.(1992)，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，ChapmanandHall，London。(8)O’Reilly，D.R.Miller，L.K.病毒學(xué)雜志(1990)，64，1321-1328。(9)O’Reilly，D.R.Miller，L.K.科學(xué)(1989)，245，1110-1112。(10)O’Reilly，D.R.Miller，L.K.生物技術(shù)(1991)，9，1086-1089。(11)Carbonell，L.E.，Hodge，M.R.，TomalskiM.D.，Miller，L.K.，基因(1988)，73，409-418。(12)Merryweather，A.T.，Weyer，U.，Harris，M.P.G.，Hirst，M.，Booth，T.，andPossee，R.D普通病毒學(xué)雜志(1990)，71，1535-1544。(13)Martens，J.W.M.，Honee，G.，Zuidema，D.，VanLent，J.W.M.，Visser，B，Vlak，J.M.應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)(1990)，56，2764-2770。(14)Tomalski，M.D.，Miller，L.K.自然(1991)，352，82-85。(15)Tomalski，M.D.，Miller，L.K.生物技術(shù)(1992)，10，545-549。(16)Maeda，S.，Volrath，S.L.，Hanzlik，T.N.，Harper，S.A.，Maddox，D.W.，Hammock，B.D.，F(xiàn)owler，E.病毒學(xué)(1991)，184，777-780。(17)Stewart，L.M.D.，Hirst，M.，F(xiàn)erbet，M.L.，Merryweather，A.T.，Cayley，P.J.，Possee，R.D.自然(1991)，352，85-88。(18)McCutchen，B.F.，Choudary，P.V.，Crenshaw，R.，Maddox，D.，Kamita，S.G.，Palekar，N.，Volrath，S.，F(xiàn)owler，E.，Hammock，B.D.，Maeda，S.生物技術(shù)(1991)，9，848-852。(19)Zlotkin，E.，Eitan，M.，Bindokas，V.P.，Adams，M.E.，Moyer，M.，Burkhart，W.，F(xiàn)owler，生物化學(xué)(1991)，30，4814-4821。(20)Zilberberg，N.，Zlotkin，E.，Gurevitz，M.昆蟲生化及分子生物學(xué)(1992)，22，199203(21)Caruthers，M.，DNA和RNA序列分析方法寄生植物學(xué)(1983)，Weissman(編)，PraegerPublishers，NewYork，Chapte1.(22)Zlotkin，E.寄生植物學(xué)(1991)，19，177-182。(23)Walther，D.，Zlotkin，E.，Rathmayer，E.昆蟲生理學(xué)(1976)，22，1187-1194。(24)Zlotkin，E.神經(jīng)藥理學(xué)和殺蟲劑作用(1986)，F(xiàn)ord，Lunt，Raey&amp;Usherwood(eds.)，EllisHorwood，England，352-383。(25)Zlotkin，E.，F(xiàn)ishman，L.，Gordon，D.神經(jīng)毒素’88藥物和殺蟲劑作用的分子基礎(chǔ)(1988)，Lunt(ed.)35-47。(26)Zlotkin，E.，Rochat，H.，Kupeyan，C.；Miranda，F(xiàn).；Lissitzky，生物化學(xué)(巴黎)(1971)，53，1073-1078。(27)Lester，D.，Lazarovici，P.；Pelhate，M，Zlotkin，E.生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(1982)，701，370-381。(28)Zlotkin，E，Kaduri，D，Gordon，D.，Pelhate，M.，Martin，M.，Rochat，H.生物化學(xué)和生物物理文獻(xiàn)(1985)，240，877-887。(29)Zoltkin，E.，Gurevitz，M.，F(xiàn)owler，E.，Adams，昆蟲生化和生理學(xué)文獻(xiàn)(1993)，22，55-73。(30)美國專利，專利號4,745,051。(31)Ernst，W.，Grabherr，R.，Katinget，H.核酸研究(1994)，22，2855-2856。(32)專利合作條約，出版號WO94/28114。(33)Jarvis，D.，F(xiàn)leming，J.，Kovacs，G.，Summers，M.，Guarino，L.生物技術(shù)(1990)，8，950-955。(34)O’Reilly，D.，Passarelli，L.，Goldman，I.，Miller，L.普通病毒學(xué)雜志(199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)毒素的基因。更具體地說,本發(fā)明涉及一分離自蝎子Leiurusquinquestriatushebraeus編碼蝎毒素LqhIT2的核酸序列,其中所述的序列經(jīng)優(yōu)化后適合于在核多角體病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)基因。本發(fā)明還涉及包括一密碼子經(jīng)優(yōu)化的LqhIT2核酸序列的嵌合基因,以及包括表達(dá)一密碼子經(jīng)優(yōu)化的重組桿狀病毒,昆蟲選擇性神經(jīng)毒素(比如,LqhIT2毒素基因)的桿狀病毒的殺蟲組合物。本發(fā)明也涉及在農(nóng)學(xué)的和非農(nóng)學(xué)的環(huán)境下控制昆蟲的方法,其中也包括使用含有密碼子經(jīng)優(yōu)化的,編碼昆蟲選擇性神經(jīng)毒素如LqhIT2毒素的核酸序列的昆蟲桿狀病毒。文檔編號A01N63/00GK1184504SQ96193967公開日1998年6月10日申請日期1996年5月16日優(yōu)先權(quán)日1995年5月17日發(fā)明者B·F·麥卡琴申請人:納幕爾杜邦公司