專利名稱：：多能性兔胚胎干(es)細(xì)胞系及其在嵌合兔的產(chǎn)生中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的兔胚胎干(ES)細(xì)胞系及其在嵌合兔的產(chǎn)生中的應(yīng)用?；虼虬小餐ㄟ^在胚胎干(ES)細(xì)胞中同源重組〕技術(shù)允許以所需的和規(guī)定的方式操縱基因(Capecchi,1989；Robertson,1987；Bradley,1987)。簡要地說，將目的基因整合到質(zhì)粒轉(zhuǎn)移載體中，并通過用編碼可選擇標(biāo)記的外源DNA置換其部分序列(失活)或通過突變的基因序列(靶誘變)來改變。然后這些已失活或突變的基因被導(dǎo)入ES細(xì)胞(每個細(xì)胞都具有發(fā)展成完整動物的潛力)。接著在體外篩選天然基因被失活的雜合體替代的ES細(xì)胞的克隆，篩選出的這些克隆被導(dǎo)入重新植入的正常胚胎中。此過程產(chǎn)生嵌合動物，這些動物篩選出來用于失活基因的種系傳遞。經(jīng)過繁育和選擇，于是產(chǎn)生了目的基因缺失(“敲除”)的轉(zhuǎn)基因動物。利用最近發(fā)展的技術(shù)使野生型或突變ES細(xì)胞和四倍體胚胎凝聚可以產(chǎn)生ES細(xì)胞完全衍化的小鼠(Nagyetal.,1993)。選擇性地，ES細(xì)胞通過非同源重組，可以用于遺傳物質(zhì)的導(dǎo)入，允許在活著的動物中進行遺傳改變的研究。將轉(zhuǎn)基因技術(shù)和ES細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于基因功能的變化已經(jīng)提供了一些重要人類疾病的動物模型(綜述參見Wilson,1996；Rubin和Barsch,1996)。然而目前這項技術(shù)僅在小鼠中是成功的。盡管對于許多應(yīng)用，小鼠是有用的，但是有一些明顯的限制(例如大小限制和不能產(chǎn)生人類的疾病)限制了其潛在的應(yīng)用。因此檢測表型結(jié)果或功能丟失突變的較大動物模型將是非常有價值的。確認(rèn)的多潛能ES細(xì)胞已在許多其它物種中得到分離，包括倉鼠(Doetschman等，1988)，豬(Evans等，1990；Piedrahita等，1990；Notarianni等，1990；Talbot等，1993)，綿羊(Notarianni等，1990)，牛(Evans等；Saito等，1992)，水貂(Sukoyan等，1993)，兔(Graves和Moreadith,1993)，大鼠(Iannaccione等，1994)，人(Bongso等，1994)和靈長類(Thomson等，1995)。然而僅在小鼠和大鼠中已建立重新導(dǎo)入囊胚后在培養(yǎng)物中產(chǎn)生嵌合體的ES細(xì)胞，而到目前為止在兔和其它物種中的所有努力都已失敗。來自兔囊胚的新鮮的內(nèi)細(xì)胞團(ICM)細(xì)胞已表明在注入受體囊胚后允許嵌合兔的產(chǎn)生(Gardner和Munro,1974；Moustafa,1974；Babinet和Bordenave,1980)，另外Yang等，(1993)已報道從新鮮分離的ICM及體外培養(yǎng)3天的ICM細(xì)胞中產(chǎn)生嵌合兔。然而，為在ES細(xì)胞中通過同源重組允許基因打靶，能夠在培養(yǎng)中保持更長時間并且具有已證明的產(chǎn)生嵌合動物潛能的細(xì)胞系對于產(chǎn)生目的遺傳改變的后代是必需的。在本發(fā)明之前，除了小鼠和大鼠之外沒有這樣的別的動物的細(xì)胞系得到分離。確認(rèn)的多潛能的兔ES細(xì)胞的衍化以前由Grave和Moreadith報道過(1993)。在移出的胚胎連續(xù)傳代以后出現(xiàn)了兩種主要細(xì)胞類型。一種類型具有與滋養(yǎng)外胚層的初級贅疣相同的形態(tài)，細(xì)胞對胚胎的植入負(fù)責(zé)。第二種類型呈現(xiàn)典型的上皮樣，被認(rèn)為代表兔ES細(xì)胞(圖1)。盡管這些確認(rèn)的ES細(xì)胞能夠產(chǎn)生胚胎樣體(由代表外胚層，中胚層和內(nèi)胚層的多種細(xì)胞類型組成)，但是它們在把上皮樣細(xì)胞導(dǎo)入來源于新西蘭白種(NZW)的囊胚后〔Grave和Moreadith,1993；Grave和Moreadith,未發(fā)表的結(jié)果(表1)〕，或者把細(xì)胞核轉(zhuǎn)移進去核的新西蘭白受精卵后(Du等，1995)不能產(chǎn)生嵌合兔。這表明用這些ES細(xì)胞不能產(chǎn)生嵌合體可能由于種的障礙。但是表1的數(shù)據(jù)表明從四個檢測的上皮樣細(xì)胞系中沒有嵌合動物產(chǎn)生，每一個所測上皮樣細(xì)胞系來自單個內(nèi)細(xì)胞團。表1用確定的ES細(xì)胞系注射兔胚胎的結(jié)果(未發(fā)表的結(jié)果，Graves和Moreadith)</tables>Niemann和Strelchenko(1994)也試圖分離并保持多潛能兔(加利福尼亞種)ES細(xì)胞，但盡管可以觀察到確認(rèn)的ES細(xì)胞(總共保持12代)與宿主囊胚(Chinchilla,BlackRex)內(nèi)細(xì)胞團的凝聚，但是無證據(jù)證明有嵌合后代的產(chǎn)生，這些確認(rèn)的ES細(xì)胞來自交配后4天收集的兔胚胎。因此，到目前為止，所有的產(chǎn)生穩(wěn)定多潛能兔ES細(xì)胞(具有注射入受體囊胚后產(chǎn)生嵌合動物的表現(xiàn)的潛力)的努力已經(jīng)失敗。因此本發(fā)明的目標(biāo)是改進兔胚胎干(ES)細(xì)胞的衍生和保持，使之具有在注射進受體囊胚后產(chǎn)生嵌合兔的表現(xiàn)的潛能，因此能夠產(chǎn)生野生型或遺傳改變的后代(通過同源或非同源重組，使用例如基因或細(xì)胞核轉(zhuǎn)移)。目前發(fā)現(xiàn)通過分離交配后5.5天囊胚的內(nèi)細(xì)胞團并在兔ES培養(yǎng)基中把它們培養(yǎng)在飼養(yǎng)細(xì)胞上，可以得到一個兔胚胎干(ES)細(xì)胞系，它含有至少70％，優(yōu)選地80至90％未分化的細(xì)胞。依據(jù)本發(fā)明的兔ES培養(yǎng)基包括高葡萄糖Dulbecco的修改的Eagle培養(yǎng)基，4mML-谷氨酰胺，0.1mM2-巰基乙醇，148單位/ml青霉素G鈉鹽，148毫克/ml硫酸鏈霉素，4毫克/ml牛胰島素，103單位/ml小鼠白血病抑制因子，20％胎牛血清、1.5％MEM非必需氨基酸溶液。飼養(yǎng)細(xì)胞優(yōu)選小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，來自12.5天的小鼠胚胎，并以每10cm的佩特里細(xì)菌培養(yǎng)皿中3至4×106細(xì)胞密度使用。優(yōu)選使用一種改良的胰蛋白酶消化方法，它包括使用胰蛋白酶消化培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基包含1％膠原酶，1％雞血清和在磷酸鹽緩沖液中的0.03％的胰蛋白酶-EDTA。因為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞在這個培養(yǎng)基中分離更慢，所以此培養(yǎng)基允許ES細(xì)胞選擇性的傳代。根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞，由它們的下列特性識別超過10次傳代后三維克隆的形成、堿性磷酸酶陽性染色及細(xì)胞角蛋白18和波形蛋白的陰性染色。本發(fā)明進一步涉及到ES細(xì)胞系在產(chǎn)生嵌合兔中的應(yīng)用，例如接下來的注射進受體囊胚的囊胚注射或胚胎凝聚或核轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的ES細(xì)胞系也可以通過同源或非同源重組用于基因改變或通過種系傳遞用于產(chǎn)生基因改變的兔。根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞系的應(yīng)用和分化可導(dǎo)致(新)基因的研究或分離。因此，本發(fā)明導(dǎo)致了改進的多潛能ES細(xì)胞的衍生、在培養(yǎng)中超過幾次傳代的維持、以及在成功產(chǎn)生嵌合動物中的應(yīng)用。具有在注射進受體囊胚后產(chǎn)生嵌合兔的表現(xiàn)的潛力的兔ES細(xì)胞的衍生和維持，將允許在這些多潛能ES細(xì)胞中在同源或非同源重組之后產(chǎn)生能夠種系傳遞靶突變的后代。此外，兔ES細(xì)胞的多潛能將允許它們分化成特定的細(xì)胞類型，以研究或分離新基因。本發(fā)明將在下面的實施例中得到說明，而這些例子不是用來限制本發(fā)明的范圍。在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，一些改變和改進對本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見的。實施例1細(xì)胞培養(yǎng)條件從ES細(xì)胞系GM3〔依照Grave和Moreadith(1993)(圖1)所描述來自荷蘭帶種兔胚胎〕開始，形成了相對于Grave和Moreadith所描述的方法(1993)來說，穩(wěn)定了未分化ES細(xì)胞的比例的細(xì)胞培養(yǎng)條件。這樣在將ES細(xì)胞注射進新西蘭白囊胚的囊胚腔后，就有可能第一次產(chǎn)生嵌合體，這一點將在例2中證明。對細(xì)胞培養(yǎng)條件，小鼠胚胎成纖維(MEF)飼養(yǎng)細(xì)胞層的密度，用于衍化MEFS的小鼠胚胎的年齡進行一些改變，以及使用用來分離細(xì)胞以傳代的胰蛋白酶消化培養(yǎng)基。Grave和Moreadith(1993)使用的培養(yǎng)基包括高葡萄糖Dulbecco的修改的Eagle培養(yǎng)基，4mML-谷氨酰胺，0.1mM2-巰基乙醇，148單位/ml青霉素G鈉鹽，148毫克/ml硫酸鏈霉素。根據(jù)本發(fā)明，可以改變或增加下列補充物4μg/ml牛胰島素、103單位/ml小鼠白血病抑制因子、20％胎牛血清、1.5％MEM非必需氨基酸溶液。兔ES細(xì)胞(每10cm佩特里細(xì)菌培養(yǎng)皿中1.5至3×106個細(xì)胞)在用絲裂霉素停滯有絲分裂的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上長至接近亞飽和，每隔4-6天將ES細(xì)胞傳代到新鮮制備的飼養(yǎng)細(xì)胞上(每個10cm培養(yǎng)皿中3至4×106個細(xì)胞)。每天用上述改進的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)皿保存于39℃，含5％CO2的潮濕空氣中。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞來自12.5天的小鼠胚胎，并在第一代被使用。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞增加的密度〔每個10cm培養(yǎng)皿3至4×106，對比于2至3×106(Graves和Moreadith,1993)〕與使用12.5天的胚胎一起，顯著地降低了ES細(xì)胞的分化。分化的降低證明是非常關(guān)鍵的，因為只有未分化的細(xì)胞保存了整合入受體胚胎內(nèi)細(xì)胞團的能力，這是產(chǎn)生嵌合后代的前提條件。此外，使用改進的選擇性胰蛋白酶消化的方法允許將滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞(可誘導(dǎo)ES細(xì)胞的分化)從培養(yǎng)物中清除。胰蛋白酶消化培養(yǎng)基包括0.1％膠原酶，1％雞血清和存在于磷酸鹽緩沖液中的0.03％胰蛋白酶-EDTA(Gibco目錄號25200)。選擇性的胰蛋白酶消化培養(yǎng)基允許ES細(xì)胞的選擇性傳代，因為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞比ES細(xì)胞從培養(yǎng)皿上分離得更慢。實施例2嵌合體的產(chǎn)生由Graves和Moreadith(1993)從荷蘭帶種胚胎中衍化，并保存在實施例1中的培養(yǎng)條件下的GM3細(xì)胞，如以下說明用于產(chǎn)生嵌合體后代。確認(rèn)的ES細(xì)胞的上皮樣克隆的囊胚注射，在注射進兔胚胎后，以前還從未產(chǎn)生過嵌合兔(表1)。在下面說明的進一步實驗中，來源于12代的GM3細(xì)胞保存于改進的培養(yǎng)條件下，此條件穩(wěn)定了堿性磷酸酶陽性，未分化的ES細(xì)胞的比例。性成熟的新西蘭白種雌兔以12小時的間隔連續(xù)6次皮下注射豬卵泡刺激激素(FSH-0.4,0.4,0.5,0.5,0.5,0.5mg)，并在FSH的最后一次劑量后10小時靜脈內(nèi)注射75IU的人絨毛膜促性腺激素(hCG)來進行超速排卵。hCG注射后，雌兔與同種成熟雄兔交配。交配后90小時，通過用在39℃，含5％CO2的潮濕空氣中預(yù)平衡的補加了3％牛血清白蛋白(Cohn組分V)和5％抗生素/抗有絲分裂溶液(Gibco,GrandIsland,NY)的Dulbecco的磷酸鹽緩沖液沖洗子宮腔以從子宮角回收囊胚。通過注射上皮樣堿性磷酸酶陰性和三維生長的堿性磷酸酶陽性的ES細(xì)胞入新西蘭白種囊胚的囊胚腔中產(chǎn)生嵌合體(表2)。用來自GM3細(xì)胞系的20至300個細(xì)胞注射總數(shù)為287個新西蘭白種囊胚。在Zeiss倒置顯微鏡下，用差別干涉光在250x放大倍數(shù)下用GM3細(xì)胞進行囊胚注射。用日常應(yīng)用于小鼠的Narashige顯微操作器進行顯微操作。用小切口和尖玻璃吸管將用GM3細(xì)胞注射的5到10個胚胎重新植入受體新西蘭白種每個子宮角的近端部分。此受體已在供體中注射hCG14小時后接受了75IU的hCG。在用開他敏/Xylazin混合物全身麻醉的情況下，進行重新植入過程。此過程的結(jié)果是總的成活出生率為23％。因為使用的ES細(xì)胞系來自著色的荷蘭帶種，將GM3ES細(xì)胞注射進來自非著色新西蘭白種的囊胚中將在嵌合體中產(chǎn)生明顯的外皮顏色。依據(jù)外皮顏色判斷，得到具有一條或多條黑帶的(黑帶對荷蘭帶種是典型的)的三個嵌合動物。嵌合性的比例在10％至多于50％之間變化，依據(jù)荷蘭帶種著色外皮的貢獻。這些嵌合體中一個是雄性(圖2a)，一個是雌性(圖2b)，另一個可能是雌雄同體。這些結(jié)果構(gòu)成了以下原理的第一個證據(jù)，即通過將在培養(yǎng)中保持并大量傳代(15至20次)的ES細(xì)胞系進行囊胚注射可以產(chǎn)生嵌合兔?；仡櫼幌?，嵌合性看來，如以下進一步詳細(xì)說明的，歸因于三維生長的堿性磷酸酶陽性ES細(xì)胞。表2:ES細(xì)胞注射進新西蘭白種囊胚的囊胚腔后嵌合體的產(chǎn)生括號中的百分率是相對注射囊胚的數(shù)目。的確，在ES細(xì)胞注射進囊胚腔后，嵌合體形成的頻率是低的-只有4％的成活出生動物。這也許是由于下面幾個因素，包括1)由于ES細(xì)胞要導(dǎo)入的成熟囊胚中有顯著的多余空間，導(dǎo)致ES細(xì)胞不經(jīng)常整合入發(fā)育中的胚胎中，2)荷蘭帶種ES細(xì)胞系與新西蘭白種囊胚固有的不相容性，或3)細(xì)胞系多潛能的丟失。通過將ES細(xì)胞直接導(dǎo)入發(fā)育中的內(nèi)細(xì)胞團來試圖提高將ES細(xì)胞轉(zhuǎn)移到發(fā)育中內(nèi)細(xì)胞團，整合入隨后的胚胎的前提條件，的頻率，并未導(dǎo)致更高的頻率或嵌合體的形成。使用荷蘭白種囊胚(通過天然點突變起源于荷蘭帶種)做為ES細(xì)胞注射的受體，這樣去除了牽涉的物種障礙，也未產(chǎn)生嵌合體。進一步試驗揭示如Graves和Moreadith(1993)所述的在培養(yǎng)中保持的ES細(xì)胞缺乏嵌合體形成以及如實施例1所述從早期傳代的GM3細(xì)胞開始培養(yǎng)的ES細(xì)胞的低頻率，最可能是由于前者缺乏殘余的多潛能ES細(xì)胞，后者殘余的多潛能ES細(xì)胞的低百分?jǐn)?shù)。這一點可以通過堿性磷酸酶染色揭示，堿性磷酸酶在未分化的細(xì)胞中存在，一旦分化則迅速消失(Benham等，1981)。10代以后堿性磷酸酶陽性細(xì)胞在原始細(xì)胞系中的存在少于1％(圖1)，盡管此頻率在此處描述的改進培養(yǎng)條件下可以得到維持。表明原來認(rèn)為代表確認(rèn)的ES細(xì)胞(Graves和Moreadith,1993)的扁平上皮樣細(xì)胞類型(圖1)大多數(shù)是堿性磷酸酶陰性，不能整合入受體囊胚的內(nèi)細(xì)胞團，不能產(chǎn)生嵌合后代。所以按實施例3所述衍化新的ES細(xì)胞系。實施例3改進的ES細(xì)胞的衍化如以下所述的，ES細(xì)胞衍生的改進方法得到發(fā)展，它和改進的細(xì)胞培養(yǎng)條件一起，允許產(chǎn)生在經(jīng)過8至10代后包含超過80％的未分化的堿性磷酸酶陽性細(xì)胞的5個兔ES細(xì)胞系。超速排卵的荷蘭帶種雌兔與荷蘭帶種雄兔交配。在交配后5.5天(而不是交配后4或5天)從子宮角沖出囊胚，用補加3％牛血清白蛋白(Cohn組分V)和5％(v/v)抗生素/抗有絲分裂溶液的Dulbecco的磷酸鹽緩沖液洗。囊胚在兔ES培養(yǎng)基(如上所述)中，于39℃含5％CO2的培育箱中保存直至進一步操作。用酸化的磷酸鹽緩沖液(pH2.5)和存在于磷酸鹽緩沖液中的0.5％鏈霉蛋白酶除去囊胚的粘蛋白外膜和透明帶。用兩根針將內(nèi)細(xì)胞團從周圍的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞人工制備出來，逐個放入96孔培養(yǎng)皿中(與以相當(dāng)于每個10cm培養(yǎng)皿3至4×106個細(xì)胞密度的12.5天、1代的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞一起鋪盤)。移出的內(nèi)細(xì)胞團每天用如上所述的改進的兔ES細(xì)胞培養(yǎng)基(其中小鼠白血病抑制因子被人或兔白血病抑制因子所替代)重新培養(yǎng)。2天以后，通過用彎成斜角的玻璃吸管輕輕使滋養(yǎng)外胚層贅疣離開下面的飼養(yǎng)細(xì)胞層，并通過將它吸入玻璃吸管中，很容易地將內(nèi)細(xì)胞團贅疣從剩余的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中分離出來。只有以三維生長為特征的ES樣的克隆隨后在新培養(yǎng)皿中傳代，4至5天后，用如上所述的胰蛋白酶消化培養(yǎng)基選擇性消化96孔，這樣允許ES細(xì)胞，而不是滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞或小鼠胚胎成纖維細(xì)胞選擇性傳代。改進兔ES細(xì)胞典型的三維生長以前還未被注意，它明顯是這類細(xì)胞系的一個新特征。只有用改進的培養(yǎng)條件，并使用5.5天的胚胎，三維未分化的ES細(xì)胞克隆才能在培養(yǎng)中高頻率保持。為了在很高的密度下保持ES細(xì)胞，另一個防止分化和多潛能丟失的前提條件，ES細(xì)胞以4至5天的間隔逐漸地傳代至稍大的培養(yǎng)皿中。飼養(yǎng)細(xì)胞在隨后的培養(yǎng)皿上保持相每個10cm培養(yǎng)皿3至4×106個細(xì)胞的密度。通過這個過程得到的兔ES細(xì)胞系(圖3)比以前報道的任何兔ES變異體更類似于多潛能小鼠ES細(xì)胞系。主要特征是克隆三維生長，高折光率和小的核/質(zhì)比。最重要的特征是10次傳代后，ES細(xì)胞的80至90％仍保持未分化，這一點通過堿性磷酸酶陽性染色(圖3b)，和人細(xì)胞角蛋白18和小鼠波形蛋白的陰性染色(分化已知的標(biāo)記)證明，(Viebahn等，1988；Piedrahita等，1990)。這些特性形成了與以前確認(rèn)的ES細(xì)胞系(通過堿性磷酸酶陽性染色判斷，少于1％的細(xì)胞是未分化的)的主要差別(圖1)。在連續(xù)傳代的兔ES細(xì)胞中，未分化細(xì)胞比例的顯著增長(從1％至80-90％)，應(yīng)該顯著增加通過ES細(xì)胞注射進囊胚，產(chǎn)生嵌合兔的效率，并允許帶有靶遺傳改變的嵌合兔的產(chǎn)生。參考文獻-Babinetc,BordenaveGR(1980)；來自免疫外科手術(shù)制備的內(nèi)細(xì)胞團移植的嵌合兔。J.EmbryolExpMorphoi60:429-440-BenhamFJ,AndrewsFW,KnavlesBB,BronsonDL,HarrisH(1981)在人睪丸畸胎瘤細(xì)胞系中堿性磷酸酶同功酶做為分化可能標(biāo)記。DevBio88:279-287-BongsoA,FongC-Y,NgS-C,RatmanS(1994)從人囊胚中分離并培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團。HumReprod9:2110-2117-BradleyA(1987)嵌合小鼠的產(chǎn)生和分析。在畸胎瘤和胚胎干細(xì)胞中一個實用的方法(Ed.RobertsonEJ),IRI出版Ltd.,牛津，1987,PP.113-151。-CapecchiMR(1989)通過同源重組改變基因組?？茖W(xué)244:1288-1292。-DoetschmanT,WilliamsP,MaedaN(1988)建立倉鼠囊胚衍生的胚胎干(ES)細(xì)胞。DevBiol127:224-227-DuF,GilesJR,FooteRH,GravesKG,YangX,MoreadithRW(1995)確認(rèn)的兔胚胎干細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移導(dǎo)致正常囊胚的發(fā)展。JReprodFert104:219-223-EvansMJ,NotarianniE,LaurieS,MoorRM(1990)來自豬和牛囊胚的多潛能細(xì)胞系的衍生和初步特征。Theriogenology33:125-128-GardnerRL,MunroAJ(1974)嵌合兔的成功構(gòu)建。自然250:146。-GravesKH,MoreadithRW(1993)來自預(yù)先植入的兔胚胎的確認(rèn)的多潛能胚胎干細(xì)胞的衍生和特征。MolReproolDev36:424-433-IannacconePM,TabornGU,GartonRL,CapliceMD,BreninDR(1994)來自能夠產(chǎn)生嵌合體的大鼠的多潛能胚胎干細(xì)胞。DevBiol163:288-292-JohnsonLV,CalarcoPG,SiebertLS(1977)在預(yù)先植入小鼠胚胎中的堿性磷酸酶活性。J.EmbroyolexpMorph40:83-89-MoustafaL(1974)來自胚胎細(xì)胞移植的嵌合兔。ProcSocExpBiol147:485-488-NagyA,JRossant,RNagy,WAbromow-Newerly,和RoderJC(1993)來自早期代數(shù)的胚胎干細(xì)胞的完全細(xì)胞培養(yǎng)衍化小鼠的衍生。美國國家科學(xué)院院報90:8424-8428-NiemanH,StrelchenkoN(1994)分離兔胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞。Theriogenology41∶265-NotarianniE,Gallic,LaurieS,MoorRM,EvansMJ(1991)來自豬和綿羊的多潛能胚胎細(xì)胞系的衍化。JReprodFertSuppl43:255-260-NotarianniE,Lauries,MoorRM,EvansMG(1990)來自豬囊胚的多潛能胚胎細(xì)胞系在培養(yǎng)中的維持和分化。J.ReprodFert40:51-56-PiedranitaJA,AndersonGB,BonDurantRH(1990)在胚胎干細(xì)胞的分離中小鼠、豬、羊胚胎的比較行為。Theriogenology34:879-890-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