專(zhuān)利名稱(chēng):脫水的植物種子類(lèi)似物的制作方法
本申請(qǐng)是1986年1月7日申請(qǐng)的、申請(qǐng)?zhí)?6/816889的共同所有和共同待批的專(zhuān)利申請(qǐng)的繼續(xù)部分，后者又是1982年10月12日提出申請(qǐng)的、申請(qǐng)?zhí)?33688的共同所有和共同待批的專(zhuān)利申請(qǐng)的繼續(xù)部分。
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)和農(nóng)作物生產(chǎn)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，本發(fā)明是關(guān)于植物生殖單元的制造，這些植物生殖單元是基因型可以與親本相同的植物種子類(lèi)似物。
在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，傳統(tǒng)的作物改良方法包括尋求表現(xiàn)出新的和有用的特性的植物品系或者對(duì)已有的品系進(jìn)行精選和改良。這種探索已經(jīng)從僅僅選擇合乎需要的親本植株發(fā)展到各自表現(xiàn)出所希望的特性的親本之間的雜交，最終發(fā)展到純合系之間的雜交，以使在隨后的每一次雜交中產(chǎn)生相同的子一代。
傳統(tǒng)的保持遺傳同一性的方法已為人們所熟知，並且在文獻(xiàn)中已有描述。例如，參閱R.W.Allard“Principles of Pla-nt Breeding”(John Wiley and Sons，Inc.，1960)。保持純種系以及為了獲得子一代而反復(fù)地雜交既費(fèi)時(shí)又耗費(fèi)人力。
親本的有性繁殖的另一個(gè)局限性是每株植物的產(chǎn)籽率低。這常常是由稠密的近交系表現(xiàn)的低活力而引起的。最后，只有非常有限數(shù)量的純系可以被生產(chǎn)出來(lái)，而這導(dǎo)致了供選擇的遺傳特性庫(kù)減少。
一般認(rèn)為，通過(guò)親本的無(wú)性繁殖可以克服上述某些困難。見(jiàn)W.C.Anderson and J.B.Carstens，“Tissue Culture Propagation of Broccoli，Brassica oleracea(Italica Group)，for use in F1Hybrid Seed Production，”J.Amer.Soc.Hort.Sci.，102(1)，PP.69-73(1977)。這一方法通過(guò)有性繁殖避免了親本遺傳特性變化的問(wèn)題。但是，在親本中存在染色體特性分離時(shí)，產(chǎn)生子一代種子的有性雜交不能保證均勻的子一代。
曾提出可以用體細(xì)胞胚或移植到大田里生根的植物無(wú)性繁殖所希望的植物種。但這種方法需要精通組織培養(yǎng)試室工作的人員，需要移植到溫室或苗圃，並且當(dāng)充分適應(yīng)氣候時(shí)還要移植到大田里。與傳統(tǒng)的播種方法相比，這種方法成本高且費(fèi)時(shí)。
為了克服上述某些困難，已研制出射流鉆孔(fluid drilli-ng)技術(shù)。已經(jīng)對(duì)預(yù)發(fā)芽的種子使用了射流鉆孔方法，例如D.Gray，“Comparison of Fluid Drilling and Con-Ventional Establishment Techniques on Seedling Emergence and Crop Uniformity in Lettuce，”J.Hort.Science，5223-30(1978)。並且已提出射流鉆孔可適用于將體細(xì)胞胚直接移植到大田里，例如D.A.Evans and W.R.Sharp，“Application of Tissue Culture Technology in the Agricultural Industry，”in Application of Plant Cell and Tissue Culture to Agriculture and Industry，D.T.Tomes et al。eds.(University of Guelph Press，PP.212-13，1982)。但是射流鉆孔技術(shù)成本高且要求農(nóng)業(yè)團(tuán)體購(gòu)買(mǎi)機(jī)械設(shè)備以及發(fā)展新技術(shù)。因而阻礙了這種技術(shù)變更。此外，射流鉆孔方法也未考慮到種子或體細(xì)胞胚的精密種植。
為了克服射流鉆孔的缺陷，已經(jīng)提出制造人工種子，將體細(xì)胞胚單獨(dú)封裝在由3.2%凝膠和96.8%水組成的水合凝膠中(例如，K.Redenbaugh，J.Nichol，M.E.Kossler，and B.Pa-asch，“Encapsulation of Somatic Embryos for Ar-tificial Seed Production”In Vitro 20256-257，1984)。然后可以使用傳統(tǒng)的真空傳感器播種機(jī)種植包含有植物組織的水合膠囊。但是這種水合膠囊含有也被水合的封裝的植物組織，其所含水分與膠囊的水含量相等。在包膠封裝時(shí)，預(yù)先經(jīng)過(guò)脫水的分生組織、體細(xì)胞胚或組織培養(yǎng)的幼苗會(huì)吸收水分達(dá)到水合膠的含水量。
已經(jīng)提出將體細(xì)胞胚在聚環(huán)氧乙烷溶液中進(jìn)行脫水，參看S.L.Kitto and Jules Janeck，“Production of Synthe-tic Seeds by Encapsulating Asexual Embryos of Carrot”J.Amer.Soc.Hort.Sci.110(2)277-282(1985)。但是未經(jīng)涂敷的胚承受不住脫水。此外，雖然經(jīng)過(guò)涂敷的胚群經(jīng)受住脫水，但沒(méi)有產(chǎn)生完整的幼苗。
本發(fā)明認(rèn)為，將植物組織脫水至低于植物組織飽和含水量，可以為更完全的發(fā)育和成熟創(chuàng)造條件，以便產(chǎn)生更富有活力的、無(wú)性系均勻的以及完整的幼苗。此外，就水合水平而論，經(jīng)脫水的植物組織更類(lèi)似于真實(shí)的種子。因而脫水的植物組織可以按照與真空種子十分類(lèi)似的方式進(jìn)行加工、貯存和處理。
因而本發(fā)明的目的之一是，提供一種可用來(lái)將培養(yǎng)的植物組織與有害的環(huán)境隔絕的方法。
目的之二是，誘導(dǎo)分生組織、體細(xì)胞胚或組織培養(yǎng)的幼苗進(jìn)一步成熟，以使植物組織更容易、更快並且更均勻地形成完整的植物。
目的之三是，形成更茁壯並且發(fā)育更完全的分生組織、體細(xì)胞胚或組織培養(yǎng)的幼苗。
目的之四是，控制植物組織的發(fā)育進(jìn)程，從而減少或消除體細(xì)胞克隆和其他的變化。
目的之五是，減少植物組織的水分，從而減少新陳代謝、DNA合成以及細(xì)胞分裂並確保抑制發(fā)育，為經(jīng)過(guò)改良的提高了貯藏壽命的植物組織創(chuàng)造條件。
目的之六是，使植物組織脫水，以便發(fā)生DNA修復(fù)。
目的之七是，使植物組織脫水以關(guān)閉發(fā)育基因，接通萌芽和生長(zhǎng)基因。
目的之八是，使植物組織脫水，以獲得激素平衡和質(zhì)膜完整性，為更完全成熟和整個(gè)植物恢復(fù)創(chuàng)造條件。
目的之九是，提供一個(gè)供遺傳學(xué)上改良或轉(zhuǎn)化幼苗用的無(wú)性繁殖系統(tǒng)，其中被修飾基因或染色體不會(huì)穩(wěn)定地結(jié)合成植物基因組。
本發(fā)明的目的之十是，縮短由分生組織、體細(xì)胞胚或組織培養(yǎng)幼苗形成成熟的或富有活力的籽苗所需的時(shí)間。
本發(fā)明的目的之十一是，提供一種將培養(yǎng)的植物組織同促進(jìn)籽苗群叢定居的佐劑一起運(yùn)送的介質(zhì)。
本發(fā)明的目的之十二是，減少在培養(yǎng)的植物組織發(fā)育和將其在大田里種植之間的加工量。
本發(fā)明的目的之十三是，減少在培養(yǎng)的植物發(fā)育和生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)于特殊加工方法和特殊技術(shù)的需要，因而由于適合于現(xiàn)有種子栽培方法而克服引進(jìn)這一新技術(shù)的阻力。
本發(fā)明的目的之十四是，提供一種大規(guī)模地、經(jīng)濟(jì)地?zé)o性繁殖優(yōu)良植物或雜交植物的方法。
簡(jiǎn)而言之，根據(jù)本發(fā)明，將全能分生組織封裝在凝膠或聚合物中並通過(guò)緩慢或快速干燥除去部分水分，以使植物組織不再飽含水分，創(chuàng)造出脫水植物種子類(lèi)似物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)觀點(diǎn)，通過(guò)緩慢或快速處理對(duì)全能分生組織進(jìn)行脫水，使植物組織不再飽含水分。經(jīng)過(guò)這樣脫水的分生組織隨后經(jīng)涂敷或不經(jīng)涂敷直接種植。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)觀點(diǎn)，通過(guò)誘發(fā)形成體細(xì)胞胚將分生組織分離。然后將這些胚封裝到一種凝膠或聚合物中並脫水除去部分水分，以使植物組織不再飽含水分。在干燥處理過(guò)程中胚可以繼續(xù)發(fā)育。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)觀點(diǎn)，將分生組織與體細(xì)胞源分離並將分生組織包封起來(lái)，由于分生組織有潛在能力分化產(chǎn)生完整的植物體，因而不需誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)觀點(diǎn)，使分生組織與合子源或種系源分離，將其從種皮中取出並包封在經(jīng)過(guò)脫水除去部分水分的凝膠或聚合物中。
根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)觀點(diǎn)，通過(guò)誘發(fā)形成體細(xì)胞胚將分生組織隔離。然后在胚發(fā)育過(guò)程中或在胚發(fā)育結(jié)束時(shí)將這些胚脫水至低于組織完全飽和度。
本發(fā)明特別有利于產(chǎn)生用傳統(tǒng)種植方法加速優(yōu)良的無(wú)性系或雜化物向大田里轉(zhuǎn)移的脫水植物種子類(lèi)似物。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式植物分生組織是機(jī)體的單元。某些分生組織有能力產(chǎn)生完整的植物體，另一些分生組只產(chǎn)生選擇組織。那些產(chǎn)生完整植物體的分生組織叫做全能組織。重演個(gè)體發(fā)育是胚的一個(gè)固有性能。這種能力歸于分生組織，而種子胚中的其他結(jié)構(gòu)附屬于這種分生組織。
按照本發(fā)明可以將除去種皮的合子胚用膠囊包封起來(lái)，以提供必要的分生組織。還可以將分生組織(也叫全能組織)同許多源隔離開(kāi)，包括由植物的體細(xì)胞組織誘導(dǎo)形成這樣的組織。
通常與分生組織包含在一起的附屬結(jié)構(gòu)和化合物可以用各種佐劑來(lái)代替或加以補(bǔ)充，這些佐劑包括將改變植物或其環(huán)境，能使該組織茁壯生長(zhǎng)並更有效地爭(zhēng)奪資源的微生物和生物活性化合物?？梢詫⑦@些不同的佐劑一起混合在均勻的溶液中，然后形成膠體。作為一種供選擇的方案，可以將這些分生組織注射到預(yù)制的凝膠中，或者層積在一個(gè)核心(例如含有分生組織)上構(gòu)成一個(gè)各組分按供給和釋放的特定順序排列的多層被囊。作為另一個(gè)可供選擇的方案，可以將被囊的各組分制成微膠囊，或者進(jìn)行相反處理，以阻止或控制被囊內(nèi)的其他佐劑或材料。再有一個(gè)可供選擇的方案，可以在凝膠進(jìn)行脫水時(shí)將這些組分加到凝膠中。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)觀點(diǎn)，通過(guò)將這些組分包封在凝膠或聚合物中並干燥除去部分水分，把分生組織和佐劑結(jié)合在一起以便運(yùn)送。凝膠和聚合物可以控制分生組織的萌芽和發(fā)育以及佐劑的釋放及其作用。此外，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)觀點(diǎn)，在組織脫水的過(guò)程中將分生組織和佐劑結(jié)合以便于運(yùn)送。
分生組織的選擇植物種子是一個(gè)機(jī)構(gòu)，它逐漸演化使植物的子一代能夠轉(zhuǎn)移到適于發(fā)育和生長(zhǎng)的地點(diǎn)。植物種子的基本組成部分是分化產(chǎn)生完整植物體的分生組織。
從大多數(shù)植物和作物中可以很容易得到植物種子。種子生產(chǎn)方法對(duì)于這一產(chǎn)業(yè)來(lái)說(shuō)是人們所熟知的。例如，見(jiàn)J.Janick，R.W.Schery，F(xiàn).W.Woods，V.W.Ruttan，“Plant Science”(W.H.Freeman，San Francisco，1974);以及H.T.Hartmann and D.E.Kester，“Plant Propagation”(Prentice-Hall，Englewood Cliffs，N.J.，1975)。因此，按照本發(fā)明，意圖在于將任何可以得到的植物種子除去皮后膠囊包封起來(lái)。
可以將培養(yǎng)的植物組織從許多源分離出，包括體細(xì)胞組織、合子組織或種系組織。不管其來(lái)源如何，這種組織必須經(jīng)過(guò)分生組織階段，以便進(jìn)行器官發(fā)生並發(fā)育成新生的植物體。
通常與繁殖無(wú)關(guān)的體細(xì)胞組織源，在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)情況下可以產(chǎn)生分生組織。
作為制備包封的體細(xì)胞胚的第一步，必須選擇能夠體細(xì)胞胚胎發(fā)生的作物品系。關(guān)于一份有代表性的這類(lèi)植物種的目錄，請(qǐng)參看D.A.Evans and D.R.Sharp，“Application of Tissue Culture Technology in the Agricultural Indust-ry”in Application and Plant Cell and Tissue Culture to Agriculture and Industry，D.T，Tomes et al.，editors，(University of Guelph Press，Page 214，1982)。隨著進(jìn)一步的試驗(yàn)和技術(shù)的精細(xì)還可能出現(xiàn)更多的能夠體細(xì)胞胚胎發(fā)生的植物種。
一旦選定了合適的作物品系，就可以采用任何已知技術(shù)進(jìn)行體細(xì)胞胚的制備。例如苜蓿，見(jiàn)K.A.Walker and S.J.Sato，“Morphogenesis in Callus Tissue of Medicago Sativathe Role of Ammonium Ion in Somatic Em-bryogenesis，”P(pán)lant Cell Tiss.Org.Cult.1109-121(1981)。關(guān)于這一領(lǐng)域的其他已知技術(shù)，例如，見(jiàn)Street，H.E.，ed.，“Plant Tissue and Cell Culture”University of Califonia Press(1977)。
某些其他植物種的體細(xì)胞組織不經(jīng)過(guò)形成體細(xì)胞胚的中間體就能進(jìn)行枝條器官發(fā)生。見(jiàn)T.Murashige，“Plant Propagation Through Tissue Culture”Ann.Rev.Plant Physiol。25135-146(1974)。從這些植物得到的組織可以不經(jīng)過(guò)予先胚胎發(fā)生階段用膠囊包封起來(lái)，而后從這些組織長(zhǎng)出成熟的植物。
作為一個(gè)供選擇的方案，例如當(dāng)植物種不能體細(xì)胞胚胎發(fā)生時(shí)，可以使用合子胚。這些合子胚可以在培養(yǎng)物或懸浮液中生長(zhǎng)，然后在不帶天然種皮的情況下用膠囊包封起來(lái)。
在某些遠(yuǎn)緣雜交中，形成了能育胚，但胚乳不能發(fā)育，于是胚死亡。因此這種雜交看來(lái)似乎是不育的，但是，把上述胚從出了故障的胚珠分離后，可以得到有生存力的子一代?？梢詫⒑献优咄浞N皮分離，然后同促進(jìn)其生長(zhǎng)並增強(qiáng)其生存能力的佐劑一起用膠囊包封起來(lái)。例如，見(jiàn)M.Monnier，“Cultnre of Zygotic Embryos，”Frontiers of Plant Tissue Culture，T.A.Thorpe，ed.(The International Association for Plant Tissue Culture，University of Calgary，Alberta，Canada，P.277-280，1978)。
包封介質(zhì)凝膠一般認(rèn)為，對(duì)種子涂敷各種物質(zhì)可以促進(jìn)其萌芽和發(fā)育。例如，曾報(bào)導(dǎo)，對(duì)種子涂敷Super Slurper(USDA)會(huì)形成有吸水能力的儲(chǔ)液空間，它提高了在干旱環(huán)境中的發(fā)芽率。
有人提出，易腐敗的食物可以通過(guò)涂敷配合的碳水化合物進(jìn)行保存，例如Earle的美國(guó)專(zhuān)利No.3395024。還有一些對(duì)種子涂敷脫水材料的報(bào)導(dǎo)，例如用藻酸鹽作粘結(jié)化合物，見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.3545129和3698133;Dexter，S.T.and T.Miy-amota，Agron J.，51338(1959)。
根據(jù)本發(fā)明，可以將分生組織包封在提供適宜的膠封基質(zhì)(下文中稱(chēng)為“凝膠”)的任何介質(zhì)或聚合物中。一般地，允許氣體擴(kuò)散而使分生組織或胚能進(jìn)行呼吸。凝膠應(yīng)提供一個(gè)其強(qiáng)度足以抗外部磨損和有害作用力且其柔韌性足以允許胚生長(zhǎng)及其在適當(dāng)時(shí)候萌發(fā)的膠囊。
在本發(fā)明中使用的凝膠，最好是，但不僅僅是水凝膠或聚合物。它們?cè)谀z基質(zhì)區(qū)域內(nèi)含水，但可以隨著植物組織脫水而被脫水或者可以以干燥形式置于脫水的胚周?chē)?。最好是將各種凝膠作為混合物或以層疊的形式結(jié)合起來(lái)使用，以獲得所要求的結(jié)果。當(dāng)凝膠本身干燥時(shí)可以作為植物組織的防護(hù)劑。
已發(fā)現(xiàn)可用于包封脫水形式的分生組織的凝膠有藻酸鈉、TullanoxTM(煙化的二氧化硅、Tulco
，Inc.，Ayer，Mass.，01432)以及Terra-SorbTM(一種膠化的淀粉水解聚丙烯腈接枝共聚物，Industrial Services Interna-tional，Inc.)。其他適用的聚合物包括，但不限于
表1 凝膠劑Ⅰ.天然聚合物A.離子鍵(要求配位劑)帶有明膠的藻酸鹽果膠酸鹽帚叉藻聚糖果膠沙菜聚糖(Hypnean)葡聚糖羅望子膠(Tamarind)果阿膠B.疏水相互作用直鏈淀粉瓊脂瓊脂糖帶明膠的瓊脂明膠淀粉支鏈淀粉玉米皮膠(Cornhull Gum)淀粉阿拉伯半乳聚糖達(dá)瓦樹(shù)膠Gum KaraganTi Gum
黃蓍膠小麥膠(Wheat Gum)幾丁質(zhì)糊精Ⅱ.化學(xué)改性的天然聚合物A.離子鍵(要求配位劑)琥珀酸纖維素乙酯(Ethyl Succinylated Cellulosé)琥珀酸玉米醇溶蛋白酯(Succinylated Zein)羧甲基纖維素B.疏水相互作用甲基纖維素羥乙基纖維素C.共價(jià)鍵帶戊二醛的明膠Ⅲ.合成聚合物A.共價(jià)鍵聚丙烯酰胺B.疏水相互作用聚乙二醇聚乙烯吡咯烷酮聚氧乙烯親水的氨基甲酸乙酯聚醋酸乙烯酯乙烯基樹(shù)脂海昌(羥乙基異丁烯酸酯)2-甲基-5-乙烯基吡啶-異丁烯酸鹽-異丁烯酸C.離子鍵帶有聚(乙烯基甲基吡啶鎓)氯化物的聚(苯乙烯磺酸)鈉帶有聚(乙烯基芐基三甲基銨)氯化物的聚(苯乙烯磺酸)鈉帶有強(qiáng)堿聚陰離子的強(qiáng)酸聚陰離子Bordon Poly Co.2113
(乙烯基乙酸酯均聚物)(Borden Co.)Gelvatol
(聚乙烯醇樹(shù)脂)(Monsanto)Ⅳ.穩(wěn)定化合物A.商品名Super Sluper
(USDA，SEA-AR，Nor，Reg.Res.Lab)Viterra
(Union Carbide)Laponite
(Laporte(United States)Inc.)Gelrite
(Kelco)Seakem
(FMC Corporation)Seaplaque
(FMC Corporation)Seaprep
(FMC Corporation)IsoGel
(FMC Corporation)B.有機(jī)化合物Methylan Clear Wallpaper Paste乳糖蠟蛋白質(zhì)膠體
C.無(wú)機(jī)化合物1.粘土2.用水溶性塑料例如甲基賽璐珞片(methylcel)粘合的化合物飄塵長(zhǎng)石Celrite斑脫巖蛭石硅藻土石灰碳酸鈣3.其他氧化鈣碳酸鎂碳酸氫鈉尿素選擇最適宜的凝膠選擇用于包封的凝膠通常應(yīng)具有下列特性(盡管本發(fā)明可以以其他方式實(shí)施)1.適于保護(hù)分生組織和使其減少震動(dòng)的柔軟性;
2.內(nèi)部材料應(yīng)具有可溶性或形成乳濁液的特性，以使它可以接受和含有佐劑，包括但不限于含水物質(zhì)或疏水物質(zhì);
3.提供防護(hù)機(jī)械應(yīng)力屏障的外表面，便于加工并維持分生組織生存;
4.足夠的膠凝強(qiáng)度，以保持被囊完整，但在萌芽時(shí)還應(yīng)使分生組織能夠突破以及釋放佐劑。
5.不損傷被包封的分生組織而脫水至低于飽和點(diǎn)的性能。
佐劑的選擇已公認(rèn)，向土壤中、植物的根圍以及植物表面加佐劑可以促進(jìn)植物定居、生長(zhǎng)和發(fā)育。業(yè)已證實(shí)，有控制地釋放佐劑可以對(duì)植物生長(zhǎng)提供額外的促進(jìn)作用。見(jiàn)T.J.Roseman and S.Z.Mansd-orf“Controlled Release Delivery Systems”(Marcel Dekker，Inc.，N.Y.，1983)。此外，已公認(rèn)，為了低溫貯藏進(jìn)行冷凍的植物組織需要防護(hù)劑，見(jiàn)K.K.Kartha，“Cryopreservation of Plant Cells and Organs”(Newsletter International Association for Plant Tissue Culture，No.45，P.2-15，1985)。
已發(fā)現(xiàn)用于包封和涂敷脫水至低于飽和的分生組織的佐劑包括二甲亞砜和葡聚糖。
其他適用的佐劑包括，但不限于表2 佐劑Ⅰ.防護(hù)劑A.滲透化合物1.蔗糖2.葡萄糖3.氯化鈣4.氯化鉀
5.海藻糖6.甘油7.脯氨酸B.非滲透化合物1.聚乙烯吡咯烷酮2.羥乙基淀粉3.甘露醇4.山梨醇5.聚乙二醇6.低聚糖7.聚胺8.α-生育酚(維生素E)Ⅱ.農(nóng)藥A.除草劑1.苯氧基化合物2，4-滴2甲4氯丁酸2，4，5-涕治草醚2.苯甲酸、乙酸及苯二甲酸化合物草滅平麥草畏溴苯腈草克樂(lè)
3.二硝基苯胺、亞硝酸鹽、酰胺、乙酰胺和?；桨贩鷺?lè)靈氟草胺黃草消4.氨基甲酸酯蘇達(dá)滅黃草靈Thiobencard5.雜環(huán)氮衍生物毒草定殺草強(qiáng)百草枯(Paraquate)西瑪三嗪6.尿素化合物敵草隆除草定殺草定異丙隆7.金屬有機(jī)物和無(wú)機(jī)物甲胂二鈉8.其他除草劑礦油石油芳香烴乙氧氟甲草醚(Oxyfluorfen)
噻草平Fluridome地散磷撲草滅賽克津克草猛撲草凈拿草特氯苯胺靈草不緣B.殺蟲(chóng)劑1.環(huán)狀化合物內(nèi)氯甲橋萘七氯林丹滅蟻靈三嗪農(nóng)2.氨基甲酸酯蟲(chóng)螨威滅撲威3.動(dòng)植物衍生及無(wú)機(jī)化合物魚(yú)藤酮Thiocyclam4.二苯基化合物滴滴涕甲氧滴滴涕敵蚊隆胺三氮螨5.有機(jī)磷酸酯百治磷硝苯硫酸酯馬拉硫磷甲拌磷亞胺硫磷Penncap M
(Pennwalt Corp.)Knoxout 2FM
(Pennwalt Corp.)C.殺菌劑1.無(wú)機(jī)物硫酸銅2.金屬有機(jī)物丁二酸鎘(Mallinckrodt Chemical Works)3.抗菌素和細(xì)菌素鏈霉素環(huán)己酰亞胺Piomy4.氨基甲酸酯福美鐵福美鋅福美雙5.有機(jī)殺菌劑萎銹靈克菌丹地茂散苯菌靈MetalaxylD.熏蒸劑、驅(qū)蟲(chóng)劑和殺鼠劑1.熏蒸劑溴甲烷二硫化碳二氯丙烯威百畝2.驅(qū)蟲(chóng)劑福美雙萘二甲酐3.殺鼠劑殺鼠靈內(nèi)氯甲橋萘Ⅱ.肥料和營(yíng)養(yǎng)素過(guò)磷酸鈣磷酸鈣磷酸鉀硝酸鉀硝酸鈣硝酸銨氮磷酸鹽鉀硫鈣鎂氨基酸Ⅳ.能源糖碳水化合物腺苷三磷酸Ⅴ.微生物大腸桿菌(Eschericia coli)Azospirillum species假單胞菌屬(Pseudomonas species)固氮菌屬(Azotobacter)氰細(xì)菌(Cyanobacteria)Bacillum thuringiensis菌根真菌(Mycorrhizal fungi)根瘤菌類(lèi)(Rhizobia species)枯草捍菌(Bacillus subtilis)Bacterioides ruminicola
Lachnospira multiparusAspergillus fumigatesFusarium oxysporumPaecilomyces species黃桿菌屬(Flavobacterium species)無(wú)色桿菌屬(Achromobacter species)曲霉屬(Aspergillus species)Arthobacter species放線菌類(lèi)(Actinomycete species)含鹽基質(zhì)上生的細(xì)菌(Halophytic bacteria)亞硝化胞菌屬(Nitrosomonas species)硝化細(xì)菌(Nitrobacter species)硫礦化細(xì)菌(Sulfur mineralizng bacteria)Baculovirum speciesHeliothis zea NPVAutographa Californica NPVⅥ.生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和激素赤霉酸細(xì)胞分裂素類(lèi)促長(zhǎng)啉萘乙酸吲哚丁酸對(duì)氯苯氧乙酸乙烯吲哚基醋酸
Ⅶ.其他生物活性組分脫氮作用抑制劑鐵螯合劑信息素酶殺蟲(chóng)劑的解毒劑和安全劑Ⅷ.其他惰性組分土壤和水分調(diào)節(jié)分散劑潤(rùn)濕劑改變pH值的化合物吸水化合物用選定的凝膠包封一旦凝膠已經(jīng)選定，就有許多影響前面所述那些特性的參數(shù)。
例如，當(dāng)添加配位劑時(shí)藻酸鈉溶液會(huì)形成凝膠。通常使用氯化鈣(CaCl2)，但氯化鑭、氯化鐵、氯化鈷、硝酸鈣、氫氧化鈣、過(guò)磷酸鹽肥料以及許多農(nóng)藥，如氟草胺、草不緣和氯苯胺靈，象其他通常帶有多價(jià)陽(yáng)離子的化合物一樣也是可采納的。
在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，選定的凝膠有一個(gè)可以使用的濃度范圍。所選擇的濃度應(yīng)易于操作，膠凝時(shí)間、凝膠強(qiáng)度及包圍分生組織的涂層厚度均達(dá)到最優(yōu)。如果凝膠太稀，在凝膠形成過(guò)程中組織可能會(huì)沉淀，因而產(chǎn)生不均勻的包封。舉例說(shuō)，可以以0.01～10%重量(克)/體積(毫升)的濃度制備藻酸鈉水溶液，其中以0.5～5%為最佳。
然后以每毫升1至50分生組織的濃度將要進(jìn)行包封的分生組織加到藻酸鈉溶液中，經(jīng)常使用的濃度是每毫升5至20分生組織。由于分生組織的合適尺寸隨植物種、源和發(fā)育階段而改變，因而這一濃度也會(huì)變化。
隨后可以以特定佐劑使用率的特定濃度向藻酸鈉和分生組織溶液中加入要包封的特定佐劑。舉例來(lái)說(shuō)，農(nóng)藥可以以每毫升藻酸鈉溶液0.0002至2.0000毫升按配方制造的農(nóng)藥(2×10-6至2克活性組分)的濃度添加，常用的濃度是每毫升0.002至10.200毫升按配方制造的農(nóng)藥(2×10-4至0.18克活性組分);例如，肥料可以以每毫升藻酸鈉溶液0.1至200毫克的濃度添加;例如，微生物可以以每毫升藻酸鈉溶液1至1012微生物的濃度添加，常用的濃度是每毫升104至1010微生物。碳源可以以每毫升藻酸鈉溶液1至500毫克的濃度加入，常用的濃度是每毫升5至100毫克。防護(hù)劑可以以每毫升藻酸鈉溶液1至1000毫克的濃度加入，常用的濃度是每毫升10至500毫克。
在此之后，可以將分散有佐劑和分生組織的凝膠溶液一滴一滴地加到配位劑中。作為一個(gè)供選擇的方案，可以采用這一技術(shù)領(lǐng)域：
中的任何已知方法將凝膠溶液和配位劑混合。這些方法可以包括，通過(guò)一個(gè)從一個(gè)源噴出凝膠微滴，而從另一個(gè)源對(duì)微滴涂以配位劑的振動(dòng)噴嘴，一步法形成微滴並添加配位劑。作為進(jìn)一步可供選擇的方案，可以不添加配位劑，將帶有植物組織的凝膠溶液脫水至低于完全飽和，達(dá)到0.1%至99.9%飽和度，一般情況下是1%至80%。
氯化鈣(或其他配位劑)可以以1至1000毫摩爾的濃度配制成溶液，常用濃度是20至500毫摩爾，最理想的濃度是50至300毫摩爾。其他的配位劑具有不同的優(yōu)選濃度范圍。
對(duì)于選定的凝膠濃度和配位劑濃度，凝膠形成時(shí)間和凝膠溶液的溫度是相關(guān)參數(shù)。溫度的選擇應(yīng)避免損傷分生組織，通常應(yīng)在1至50℃范圍內(nèi)，常用范圍是10-40℃，最佳范圍是20-40℃。
在允許的溫度范圍內(nèi)，可以選擇一個(gè)達(dá)到符合完全形成凝膠的最短膠凝時(shí)間的具體數(shù)值。一般凝膠會(huì)立刻形成，而配位所需時(shí)間則長(zhǎng)得多。對(duì)于濃度為每100毫升3.2克水的藻酸鈉溶液、濃度為50毫摩爾的氯化鈣溶液及25℃的反應(yīng)溫度，在5至120分鐘內(nèi)達(dá)到充分膠凝，通常是10-90分鐘，一般在20-60分鐘內(nèi)膠凝充分完成。作為一個(gè)供選擇的方案，如果以300毫摩爾氯化鈣代替50毫摩爾氯化鈣，膠凝的時(shí)間縮短至2-5分鐘。
作為一個(gè)進(jìn)一步可供選擇的方案，隨后可將已配位的凝膠及植物組織脫水至0.1-99.9%的飽和度，常用的是1-80%。
脫水過(guò)程可以是快的，1分鐘至5天內(nèi)發(fā)生，通常是30分鐘至1天?；蛘叻催^(guò)來(lái)，脫水過(guò)程也可以是慢的，5天至3個(gè)月內(nèi)發(fā)生，通常是7至28天。
上述凝膠特性對(duì)于每一種凝膠是可以調(diào)整的，但一般由凝膠的濃度參數(shù)和化學(xué)性質(zhì)所決定。
被囊硬化在包封之后，需要通過(guò)多種已知技術(shù)提高凝膠基質(zhì)外表面的剛度。這樣，可以將較軟的凝膠用于包封和包含適宜的添加劑，並且在外表面上可以提高抗磨損和滲透能力，同時(shí)又不損失分生組織的生存能力。
可以對(duì)被包封的分生組織進(jìn)行不完全脫水，這將導(dǎo)致產(chǎn)生剛度較高的外表面。
作為一個(gè)供選擇的方案，可以對(duì)由選定的凝膠包封的分生組織再涂敷一層薄的、剛度較高的凝膠，或者可以將其嵌入一個(gè)可以通過(guò)商業(yè)途徑買(mǎi)到的明膠囊中。
此外，還可以用各種本技術(shù)領(lǐng)域：
已知的化學(xué)試劑硬化處理該表面，來(lái)提高凝膠表面破裂抗力。
這些技術(shù)包括(不是全部)表3 被囊涂料化合物Ⅰ.凝聚明膠和阿拉伯樹(shù)膠帶有硝酸纖維素的卵磷脂和腦磷脂帶有硝酸纖維素的石蠟油Ⅱ.界面聚合帶有己二胺的癸二酰氯化物Ⅲ.丹寧酸柿子丹寧中國(guó)棓?shù)帰?聚氨基酸聚烏氨酸聚賴氨酸聚瓜氨酸聚精氨酸聚組氨酸聚谷氨酰胺聚亮氨酸氨基酸組合(Combination of Poly-L-Amino acids)
Ⅴ.戊二醛帶明膠的戊二醛Ⅵ.明膠膠囊Ⅶ.腸涂料(Enteric Coating)甲基乙烯基醚/馬來(lái)酐苯乙烯馬來(lái)酸共聚物苯乙烯馬來(lái)酐共聚物乙烯/馬來(lái)酐共聚物Ⅷ.疏水聚合物乙基纖維素異丙基肉豆蔻酸酯聚乙酸乙酸酯酞酸酯淀粉乙酸酯酞酸酯纖維素乙酸酯酞酸酯薩冉樹(shù)脂丁基橡膠Ⅸ.其他化合物角蛋白蟲(chóng)膠加拿巴蠟石蠟蠟脂肪類(lèi)脂甘油三酸酯乙烯乙烯基乙酸酯共聚物芐基纖維素礦脂Elvax 4260
(乙烯乙烯基乙酸酯丙烯酸三元共聚物，Dupont，Wilmington，DE)鯨蠟代用品(J.B.Ross co.，Jersey City，N.J.)Elvax 310
(乙烯乙烯基乙酸酯共聚物，Dupont)Gantrez ES-435
(GAF Corporation)在利用使膠囊外表面硬化的方法時(shí)，必須小心謹(jǐn)慎，以避免損傷分生組織。例如，用戊二醛交聯(lián)凝膠基質(zhì)將提供表面強(qiáng)度，但如果施加戊二醛的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，它將完全穿透凝膠，損傷分生組織。施加戊二醛的時(shí)間隨凝膠材料、凝膠涂層厚度及溶液的溫度不同而改變。
已經(jīng)指出，上述某些處理，例如聚賴氨酸將會(huì)改變凝膠的貯水特性，但是不改變破裂強(qiáng)度。因此，通過(guò)多種處理的適當(dāng)組合可以將大部分凝膠特性調(diào)整到所需要的值。
進(jìn)一步改性在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，一般地說(shuō)收獲最好是在適當(dāng)?shù)募竟?jié)進(jìn)行並且最好在短時(shí)間內(nèi)完成。因此，在凝膠處理之前或在凝膠處理過(guò)程中，最好是通過(guò)對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域：
已知的方法，例如使用有絲分裂阻抑劑或通過(guò)篩子篩分使分生組織或胚的萌發(fā)同步進(jìn)行，這樣，任何已定的一批包封的分生組織、體細(xì)胞胚或不帶種皮的種子將在大體相同的時(shí)間萌芽。可以使用各種鹽控制和阻止分生組織萌芽，特別是滲透活性的一價(jià)鹽。
高的滲透勢(shì)也將控制分生組織萌芽。例如，以每升水中的重量(克)計(jì)濃度為6-20%(一般是8-15%，最好是10-14%)的蔗糖，當(dāng)包封在藻酸鈣被囊中時(shí)可以控制從種皮分離的蕓苔屬植物合子胚的萌芽。當(dāng)將包封的蕓苔屬植物合子胚和蔗糖貯存在一個(gè)密封的容器中，這種萌芽控制至少持續(xù)一個(gè)月有效。當(dāng)放置在Schenk and Hildebrandt介質(zhì)(SH)(Can.J.Bot.50199-204，1972)上時(shí)，這些胚以與對(duì)照物相等的比率迅速而均勻地萌芽了。
作為鹽或蔗糖的替代物，脫落酸也影響合子胚萌芽。例如，濃度為10-3-10-6摩爾的脫落酸，通常為10-4至10-5摩爾，可以同樣地控制分離的蕓苔屬植物胚萌發(fā)。
作為另一個(gè)可供選擇的方案，在0-10℃低溫下(一般為2-8℃)貯存包封的種子或胚同時(shí)配合使用任何鹽、蔗糖或脫落酸也可以控制分離的胚萌發(fā)。
在包封或種植之后，可能需要對(duì)包封的分生組織進(jìn)行貯藏，將其移植至大田、溫室或苗圃中，以及按照與植物種子一致的方式對(duì)其進(jìn)行處理?？梢詫⑦@些包封的分生組織種植在苗圃里或溫室中，因?yàn)樽魑锓N不經(jīng)過(guò)適應(yīng)某些氣候階段就不能承受外界氣候條件。另一方面，對(duì)于比較耐寒的作物種，可以通過(guò)在植物種子技術(shù)領(lǐng)域：
中所使用的多種方法將包封的分生組織直接種植到大田里。
實(shí)驗(yàn)為了說(shuō)明本發(fā)明，用各種分生材料、凝膠介質(zhì)和佐劑進(jìn)行了下述實(shí)驗(yàn)。所有標(biāo)示百分比(%)的量，除非另有說(shuō)明都是每100毫升克。
實(shí)施例A(紫苜蓿體細(xì)胞胚)1.沒(méi)有介質(zhì)脫水的裸露紫苜蓿體細(xì)胞胚將紫苜蓿(Medicago sativa L.strain RA-3)的愈傷組織在補(bǔ)充有50微摩爾2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-滴)和5微摩爾激動(dòng)素的Shenk and Hildebrandt介質(zhì)(Medium and Techniques for Induction and Growth of Monocotyledenous and Dicotyledenous Cell Cul-ture Can.J.Bot.50199-204，1972)中暴露至3-4天，誘發(fā)其形成體細(xì)胞胚。然后將組織轉(zhuǎn)移到?jīng)]有2，4-滴和激動(dòng)素的SH再生介質(zhì)中。這一處置方法在下列文獻(xiàn)中有詳細(xì)說(shuō)明K.A.Walker，et al.“The Hormonal Control of Organ Formation in Callus of Medicago sativa L.Cultured In Vitro，”Am.J.Bot.65654-659(1978);K.A.Walker，et al.，“Organog-enesis in Callus Tissue of Medicago Sativa，The Temporal Separation of Induction Process from Differentiation Processes，”P(pán)lant Sci.Lett.1623-30(1979);及D.Stuart and S.Strickland，“Somatic Embryogenesis from Cell Cultures of Medicago Sativa L.，”P(pán)lant Sci.Lett.34134-181，1984，正如本文其他部分引證這些文獻(xiàn)一樣，在這里引入上述文獻(xiàn)以供參考。
沒(méi)有介質(zhì)在相對(duì)濕度10-20%的無(wú)菌氣氛條件下于25℃將紫苜蓿體細(xì)胞胚風(fēng)干15至25分鐘。將體細(xì)胞胚置于補(bǔ)充有1.5%(重量/體積)麥芽糖和25μM赤霉酸而不是1.5%蔗糖的半濃度的Shenk and Hildebrandt介質(zhì)上，以確定成活率。
20分鐘后體細(xì)胞胚被干燥至完全飽和的體細(xì)胞胚鮮重的8%。成活的體細(xì)胞胚是體細(xì)胞胚總數(shù)的43%。經(jīng)過(guò)脫水的體細(xì)胞胚有43%萌芽，而未經(jīng)脫水的對(duì)照物萌芽率為30%。
1a.作為一個(gè)可供選擇的脫水持續(xù)時(shí)間，將體細(xì)胞胚脫水15分鐘，成活率是88%。
1b.作為一個(gè)可供選擇的干重，將體細(xì)胞胚脫水至其鮮重的64%，成活率為80%。
2.用介質(zhì)脫水的裸露紫苜蓿體細(xì)胞胚重復(fù)A.1的實(shí)驗(yàn)程序，但附加一條，即體細(xì)胞胚是在一個(gè)懸浮在補(bǔ)充有1.5%(重量/體積)麥芽糖而不是1.5%(重量/體積)蔗糖的半濃度Shenk and Hildebrandt液體介質(zhì)中的濾紙筏上進(jìn)行風(fēng)干。將一張濾紙折疊，然后插入一個(gè)Magenta Box(Magenta Corporation Cnicago IL)中，使濾紙的邊緣處在液體介質(zhì)中，而其中心的平展區(qū)在介質(zhì)的上面。在風(fēng)干開(kāi)始時(shí)，帶有胚的筏懸浮于80毫升的介質(zhì)中。20天后介質(zhì)已蒸發(fā)至68毫升。這些體細(xì)胞胚以30%的比率產(chǎn)生幼苗，相比之下未經(jīng)風(fēng)干的體細(xì)胞胚(對(duì)照物)為21%。
2a.作為供選用的介質(zhì)體積，使用60毫升的介質(zhì)。20天后介質(zhì)已蒸發(fā)至48毫升。體細(xì)胞胚以41%的比率產(chǎn)生幼苗，相比之下對(duì)照物為21%。
2b.作為供選用的介質(zhì)體積，使用40毫升的介質(zhì)。20天后介質(zhì)蒸發(fā)至25毫升。體細(xì)胞胚以32%的比率產(chǎn)生幼苗，相比之下對(duì)照物為21%。
2c.作為供選用的介質(zhì)體積，使用20毫升介質(zhì)。20天后介質(zhì)蒸發(fā)至7毫升。體細(xì)胞胚以33%的比率產(chǎn)生幼苗，而對(duì)照物為21%。
3.包封經(jīng)過(guò)脫水的紫苜蓿體細(xì)胞胚重復(fù)實(shí)施例A，1的實(shí)驗(yàn)程序，但在體細(xì)胞胚脫水之后增加一最后步驟，即將經(jīng)過(guò)脫水的體細(xì)胞胚懸浮于2%(重量/體積)藻酸鈉混合物中并在100毫摩爾的氯化鈣溶液中配位形成藻酸鈣珠粒。體細(xì)胞胚萌芽為總數(shù)的57%。
3a.作為一種供選用的包封介質(zhì)，使用一種TullanoxTM(Tulco
，Inc.)(煙化的二氧化硅)涂敷脫水的體細(xì)胞胚。涂敷方法是使體細(xì)胞胚在TullanoxTM粉末中滾動(dòng)。體細(xì)胞胚的成活率為42%。
4.使經(jīng)過(guò)包封的紫苜蓿體細(xì)胞胚脫水重復(fù)實(shí)施例A，1的實(shí)驗(yàn)程序，但有一點(diǎn)不同，在脫水之前將體細(xì)胞胚包封在用100毫摩爾氯化鈣配位的2%藻酸鹽溶液中。體細(xì)胞胚的成活率為總數(shù)的90%。
4a.作為一種供選用的包封基質(zhì)，在脫水之前用2%(重量/體積)藻酸鈉涂敷體細(xì)胞胚。成活率為80%。
4b.作為一種供選用的包封基質(zhì)，在脫水之前用2%(重量/體積)的Terra-Sorb
(Industrial Services International Inc.)涂敷體細(xì)胞胚。成活率為80%。
5.防護(hù)劑重復(fù)實(shí)施例A，4a的實(shí)驗(yàn)程序，不同的是向藻酸鈉混合物中加入5%(重量/體積)二甲亞砜。體細(xì)胞胚的成活率為90%。
5a.作為一種供選用的防護(hù)劑，使用10%(重量/體積)葡聚糖。體細(xì)胞成活率為50%。
6.長(zhǎng)時(shí)間脫水重復(fù)實(shí)施例A，1的實(shí)驗(yàn)程序，不同的是，將體細(xì)胞胚在一個(gè)密封的陪氏培養(yǎng)皿中，于4℃緩慢脫水110天，該培養(yǎng)皿中有含3%(重量/體積)蔗糖、10毫摩爾銨和30毫摩爾L-脯氨酸的Shenk and Hildebrandt介質(zhì)。110天后介質(zhì)完全干透。體細(xì)胞胚成活率為27%。
7.體細(xì)胞胚成熟重復(fù)實(shí)施例A，1的實(shí)驗(yàn)程序，不同的是，將再生后的體細(xì)胞胚放在含3%(重量/體積)蔗糖和10微摩爾脫落酸的Shenk and Hildebrandt介質(zhì)上，以進(jìn)行14天的成熟。隨后將胚在一個(gè)沒(méi)有介質(zhì)的敞口陪氏培養(yǎng)皿中脫水60分鐘。然后將胚放置在含1.5%(重量/體積)蔗糖的半濃度Shenk and Hildebrandt介質(zhì)上，以使其萌芽。這些胚以85%的比率萌芽，而沒(méi)有經(jīng)過(guò)脫落酸成熟處理的胚發(fā)芽率為0%。
實(shí)施例B(旱芹體細(xì)胞胚)1.裸露的體細(xì)胞胚由放在含0.5-25微摩爾激動(dòng)素的Shenk and Hilde-brandt介質(zhì)上的、生長(zhǎng)了2星期的幼苗的下胚軸和子葉誘發(fā)旱芹(Apium graveolens L.Strain Calmario)愈創(chuàng)組織。在轉(zhuǎn)移至含25毫摩爾硝酸銨的Shenk and Hildebrandt介質(zhì)后一到三個(gè)月形成了體細(xì)胞胚。為了固定和保持胚，使體細(xì)胞胚在含12%蔗糖的Shenk and Hildebrandt介質(zhì)上成熟。蔗糖滲透劑抑制了胚萌芽。在除去滲透劑后胚萌發(fā)了，其發(fā)芽率與未受抑制的胚相同。
1a.作為一種可供選用的脫水劑，用12%的麥芽糖代替蔗糖。麥芽糖抑制了萌芽。在除去滲透劑后，受到抑制的胚發(fā)芽了，其發(fā)芽率與未經(jīng)抑制的胚相同。
1b.作為一種可供選用的脫水劑，用10-4至10-7毫摩爾脫落酸代替蔗糖。脫落酸抑制了萌芽。在滲透劑被除去后，受抑制的胚以與未受抑制的對(duì)照物相等的發(fā)芽率萌芽。
1c.作為一種可供選用的脫水劑，用0.26至0.44毫摩爾的氯化鈉代替蔗糖。氯化鈉抑制了萌芽。在滲透劑被除去后，受抑制的胚以與未受抑制的對(duì)照物相等的發(fā)芽率萌芽。
1d.作為一種可供選用的脫水劑，用0.04至0.4摩爾甘露醇代替蔗糖。甘露醇抑制了萌芽。在除去該滲透劑后，受抑制的胚發(fā)芽了，其發(fā)芽率與未受抑制的對(duì)照物相等。
實(shí)施例C(野生芥子合子胚)1.裸露的合子胚在授粉后2或4周，從野地里生長(zhǎng)的Brassica campestris L.植物上去掉花卵囊。從包含在花卵囊內(nèi)的胚珠上切下合子胚，將其放在20毫升瓊脂固化的Monnier的12%(重量/體積)蔗糖介質(zhì)(M.Monnier，“Culture of Zygotic Embryos”Frontiers of Plant Tissus Culture，T.A.Thorpe，Ed.，International Association for Plant Tissue Culture，University of Calgary，Alberta，Canada，PP.277-280，1980)上，然后在盛有150毫升Drierite的密封容器中將其放置2星期。在這樣的干燥條件下胚沒(méi)有發(fā)芽而是繼續(xù)成熟。當(dāng)轉(zhuǎn)移至Monnier的2%蔗糖介質(zhì)中時(shí)，胚以100%的發(fā)芽率萌芽，相比之下未經(jīng)干燥的胚發(fā)芽率是90%。
1a.作為一種可供選用的干燥劑，將100毫升3.43摩爾的硫酸溶液放入裝有分離的合子胚的密封容器中。在干燥后將胚轉(zhuǎn)移至Monnier的蔗糖介質(zhì)時(shí)，胚以與未經(jīng)脫水的胚相等的發(fā)芽率萌芽。
2.包封的合子胚重復(fù)實(shí)施例C，1的實(shí)驗(yàn)程序，但增加將合子胚包封在用100毫摩爾藻酸鈣配位的2%(重量/體積)藻酸鈉溶液中的步驟。將經(jīng)過(guò)包封的合子胚在盛有含12%(重量/體積)蔗糖的藻酸鈉混合物的密封容器中貯存2星期。當(dāng)放置在帶有2%(重量/體積)蔗糖的Shenk and Hildebrandt介質(zhì)上時(shí)，經(jīng)過(guò)包封的合子胚很快以75%的發(fā)芽率萌發(fā)，相比之下對(duì)照物發(fā)芽率為60%。
2a.作為一種供選用的發(fā)芽抑制劑，用10-6摩爾的脫落酸代替蔗糖。萌芽被完全抑制達(dá)2星期之久。當(dāng)將胚轉(zhuǎn)移至Monnier的2%介質(zhì)時(shí)，胚以20%的發(fā)芽率萌芽。
3.在被囊中脫水按實(shí)施例c，2的實(shí)驗(yàn)程序，將Brassica Campestris L.合子胚包封起來(lái)。使被囊在硫酸溶液上方干燥一星期。這時(shí)，胚周?chē)脑逅猁}已經(jīng)干燥，其破裂強(qiáng)度大于60公斤/厘米2(新包封的胚破裂強(qiáng)度為7-15公斤/厘米2)。將經(jīng)過(guò)干燥的被囊放置在含有2%(重量/體積)蔗糖的介質(zhì)(見(jiàn)實(shí)施例c，1)中，胚開(kāi)始發(fā)芽，幼苗以45%的比率再生，相比之下對(duì)照物的萌芽率為60%。
為了清楚理解起見(jiàn)，對(duì)上述發(fā)明已進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，但應(yīng)意識(shí)到，在不超出所附權(quán)利要求
的精神和范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.一種用于產(chǎn)生天然植物種子的類(lèi)似物的方法，該方法包括分離有潛力分化產(chǎn)生完整植物體的全能分生組織。對(duì)上述的分生組織進(jìn)行脫水，以使該組織的飽和水含量低于99.9%。
2.按照權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述的分生組織基本上不含植物附屬結(jié)構(gòu)。
3.按照權(quán)利要求
2所述的方法，其中分生組織來(lái)自體細(xì)胞組織。
4.按照權(quán)利要求
3所述的方法，其中體細(xì)胞組織是由Medic-ago Sativa L.、Apium graveolens L.和Brassica campestris L構(gòu)成的組中選出的一種植物。
5.按照權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述的分生組織來(lái)自合子組織。
6.按照權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述的分生組織來(lái)自種系組織。
7.按照權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述的分生組織是已被誘發(fā)形成發(fā)芽分生組織的組織。
8.按照權(quán)利要求
3所述的方法，其中，通過(guò)提高發(fā)芽率和植物再生率進(jìn)一步誘導(dǎo)體細(xì)胞胚成熟。
9.按照權(quán)利要求
3所述的方法，其中對(duì)體細(xì)胞胚進(jìn)行緩慢脫水。
10.按照權(quán)利要求
8所述的方法，其中，在脫水之前使體細(xì)胞胚在脫落酸介質(zhì)上成熟。
11.按照權(quán)利要求
8所述的方法，其中，通過(guò)使用從含有蔗糖、麥芽糖、脫落酸、氯化鈉和甘露醇的組中選出的一種控制化學(xué)制劑抑制發(fā)芽，使體細(xì)胞胚進(jìn)一步成熟。
12.一種用于產(chǎn)生天然植物種子的類(lèi)似物的方法，該方法包括分離有潛力分化產(chǎn)生完整植物的全能組織;將上述經(jīng)過(guò)分離的分生組織包封在允許所述植物體發(fā)育的水合膠囊中;以及對(duì)該膠囊進(jìn)行脫水，直至分生組織的飽和含量低于99.9%。
13.按照權(quán)利要求
12所述的方法，其中包封所述的分生組織，基本上不含有植物的附屬結(jié)構(gòu)。
14.按照權(quán)利要求
13所述的方法，其中分生組織取自體細(xì)胞胚。
15.按照權(quán)利要求
14所述的方法，其中體細(xì)胞組織是由Med-icago Sativa L.，Apium graveolens L.和Brassica Campestris L.構(gòu)成的組中選出的一種植物。
16.按照權(quán)利要求
12所述的方法，其中所述的分生組織取自合子組織。
17.按照權(quán)利要求
12所述的方法，其中所述的分生組織取自種系組織。
18.按照權(quán)利要求
12所述的方法，其中所述的分生組織是已被誘發(fā)形成發(fā)芽分生組織的組織。
19.按照權(quán)利要求
12所述的方法，其中所述的凝膠包含一種或多種性質(zhì)不同的凝膠劑。
20.按照權(quán)利要求
12所述的方法，其中所述凝膠還包含對(duì)生物起作用濃度的生物活性佐劑。
21.按照權(quán)利要求
12所述的方法，其中凝膠選自由藻酸鈉、用鈣鹽配位的藻酸鈉以及Terra-Sorb
組成的組。
22.按照權(quán)利要求
21所述的方法，其中向凝膠中加入一種防護(hù)劑，該防護(hù)劑選自二甲亞砜和葡聚糖。
23.一種用于產(chǎn)生天然植物種子的類(lèi)似物的方法，該方法包括分離有潛力分化產(chǎn)生完整植物體的全能分生組織;將所述的分生組織脫水，以使該組織的飽和含量低于99.9%;以及將上述經(jīng)過(guò)分離、脫水的分生組織包封在允許所述植物體發(fā)育的水合凝膠囊中。
24.按照權(quán)利要求
23所述的方法，它還包括對(duì)含有脫水分生組織的上述水合凝膠囊進(jìn)行脫水，以使該凝膠的飽和含量低于99.9%。
25.按照權(quán)利要求
23所述的方法，其中包封所述的分生組織，基本上不含有植物的附屬結(jié)構(gòu)。
26.按照權(quán)利要求
23所述的方法，其中分生組織取自體細(xì)胞組織。
27.按照權(quán)利要求
23所述的方法，其中體細(xì)胞組織是由Med-icago sativa L.，Apium graveolens L.和Brassica campestris L.構(gòu)成的組中選出的一種植物。
28.按照權(quán)利要求
23所述的方法，其中所述的分生組織取自合子組織。
29.按照權(quán)利要求
23所述的方法，其中所述的分生組織取自種系組織。
30.按照權(quán)利要求
23所述的方法，其中所述的分生組織是已被誘發(fā)形成發(fā)芽分生組織的組織。
31.按照權(quán)利要求
23所述的方法，其中所述的凝膠包含一種或多種性質(zhì)不同的凝膠劑。
32.按照權(quán)利要求
23所述的方法，其中所述的凝膠還含有對(duì)生物起作用濃度的生物活性佐劑。
33.按照權(quán)利要求
23所述的方法，其中凝膠是用鈣鹽配位的藻酸鈉。
34.按照權(quán)利要求
23所述的方法，其中凝膠是煙化的二氧化硅。
35.一種天然植物種子的類(lèi)似物，它包括具有潛力分化形成完整植物體的分生組織，該組織被脫水，以致飽和含量低于99.9%。
36.一種天然植物種子的類(lèi)似物，它包括具有潛力分化形成完整植物體的分生組織，該分生組織被包封在允許所述植物體發(fā)育的水合凝膠囊中，該膠囊隨后被脫水，以使分生組織的飽和含量低于99.9%。
37.一種天然植物種子的類(lèi)似物，它包括具有潛力分化形成完整植物體的分生組織，該組織被脫水，以使飽和含量低于99.9%，隨后將該組織包封在允許所述植物體發(fā)育的水合膠囊中。
38.按照權(quán)利要求
35所述的類(lèi)似物，其中所述的分生組織是組織，它選自由體細(xì)胞組織、合子組織和種系組織構(gòu)成的組。
39.按照權(quán)利要求
36所述的類(lèi)似物，其中所述的分生組織是組織，它選自由體細(xì)胞組織、合子組織和種系組織構(gòu)成的組。
40.按照權(quán)利要求
36所述的類(lèi)似物，其中所述的凝膠包含一種或多種性質(zhì)不同的凝膠劑。
41.按照權(quán)利要求
36所述的類(lèi)似物，其中所述的凝膠還包含對(duì)生物起作用濃度的生物活性佐劑。
42.按照權(quán)利要求
36所述的類(lèi)似物，其中所述的凝膠是由藻酸鈉、用鈣鹽配位的藻酸鈉以及Terra-Sorb
構(gòu)成的組中選出的。
43.按照權(quán)利要求
37所述的類(lèi)似物，其中所述的分生組織是組織，它選自含有體細(xì)胞的組織、合子組織和種系組織的組。
44.按照權(quán)利要求
37所述的類(lèi)似物，其中所述的凝膠包含一種或多種性質(zhì)不同的凝膠劑。
45.按照權(quán)利要求
37所述的類(lèi)似物，其中所述的凝膠還含有對(duì)生物起作用濃度的生物活性佐劑。
46.按照權(quán)利要求
37所述的類(lèi)似物，其中所述的凝膠選自含有用鈣鹽配位的藻酸鈉以及煙化的二氧化硅的組。
專(zhuān)利摘要
提供了用于形成脫水的植物種子類(lèi)似物的方法和材料，通過(guò)緩慢或快速干燥除去部分水分使植物組織不再飽含水分，從而形成了脫水的植物種子的類(lèi)似物。在第二個(gè)實(shí)施方案中，分生組織被包封在凝膠或聚合物中后進(jìn)行脫水。在另一實(shí)施方案中，在包封到凝膠中之前對(duì)分生組織進(jìn)行脫水。在凝膠囊中可以摻入防護(hù)劑。分生組織可以從例如體細(xì)胞胚、合子和種系源分離出。
文檔編號(hào)A01N37/42GK87100861SQ87100861
公開(kāi)日1987年11月4日 申請(qǐng)日期1987年1月7日
發(fā)明者M·基恩·雷登鮑, 戴維·斯萊德, 喬安·藤井 申請(qǐng)人:植物遺傳學(xué)公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan