專利名稱：天然抑芽劑的制備方法及其在烤煙腋芽抑制上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然抑芽劑的制備方法及其在烤煙腋芽抑制上的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。尤其是天然脫落酸S-(+)-ABA，簡(jiǎn)稱ABA，5-(1-羥基-2，-6，6-三甲基-4-氧代-2-環(huán)己烯-1-基)-3-甲基-2-順-4-反-戊二烯酸，及Botcinolide，即4-羥基-2-辛炔酸，兩種產(chǎn)品均是Botrytis cinerea PersrCGMCC NO.0357-1、NO.0357-2真菌的代謝產(chǎn)物(保藏日為1998年9月3日)。
煙葉在我國(guó)許多省份種植面積大、經(jīng)濟(jì)效益明顯。但每年田間管理中的封頂打杈，極其勞累費(fèi)力，且摘除后不長(zhǎng)時(shí)間，又會(huì)長(zhǎng)出新的杈芽。為了提高煙葉產(chǎn)品產(chǎn)量、質(zhì)量及減少勞力，國(guó)家先后從國(guó)外購(gòu)入抑芽用的Flumetralin(抑芽敏)、Maleichydrazide(抑芽丹、芽敵)、除芽通等，這些藥品用于田間管理，抑芽效果各有特色，但價(jià)格較高(13元/畝)，而且它們都是有機(jī)合成制劑，對(duì)烤煙品質(zhì)的影響及殘留毒性、環(huán)境污染等問(wèn)題尚未得到解決。
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足及弊端，提供一種安全無(wú)毒、無(wú)副作用、不污染環(huán)境、無(wú)殘毒顧慮、效高價(jià)廉的新型抑芽劑。
上述目的是這樣實(shí)現(xiàn)的從植物中廣泛采集Botrytis Cinerea Persr的真菌病害標(biāo)本，選擇新鮮癥狀典型的標(biāo)本，進(jìn)行表面消毒，用滅菌水沖洗，再用組織分離或直接孢子振落法，進(jìn)行單孢分離、純化培養(yǎng)，然后按照室內(nèi)菌株篩選及生產(chǎn)工藝流程方法，選拔生物活性強(qiáng)，產(chǎn)率高的株系(產(chǎn)率在0.8‰以上，小麥抑芽快速檢測(cè)試驗(yàn)，抽提物稀釋至1500倍仍然有效的菌株)，再反復(fù)比較篩選出高產(chǎn)菌株，產(chǎn)率0.9‰～1.5‰，最后依序編號(hào)，正式將菌種接入煮至半熟滅菌大麥粒上，放入-40℃～-60℃冰箱保存?zhèn)溆?。培養(yǎng)基為PDA、PLD、PDA+柑桔皮粉，在25℃培養(yǎng)7天，然后加入溶劑萃取、過(guò)濾、濃縮干燥得天然ABA粗抽品，放在-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。將所得產(chǎn)物采用抑制小麥胚芽鞘生長(zhǎng)法，進(jìn)行快速生測(cè)篩選，將預(yù)先提取待測(cè)粗抽品稀釋10倍、50倍、100倍……系列濃度5ml分別移入放有處理過(guò)的小麥種子的燒杯中，以剛好浸沒(méi)種子為宜，對(duì)照用清水，每一濃度重復(fù)3次，置26℃溫箱中培養(yǎng)5～7天，篩選出活性強(qiáng)，產(chǎn)率高的菌株，培養(yǎng)所得粗品天然脫落酸(ABA)。再用柱層析和TLC法純化、HPLC分析，應(yīng)用IRV、UV、MS，結(jié)合HNMR儀器解析，確定分子量和結(jié)構(gòu)式，天然脫落酸的分子量是264.3，分子式C15H20O4，結(jié)構(gòu)式為
為了避免原料浪費(fèi)，將萃取后的剩余水溶液再作處理。方法是萃取后的剩余水溶液調(diào)整PH為堿性，經(jīng)EtOAC抽提分離出溶劑層和水層，再對(duì)水層調(diào)整PH值，經(jīng)倍量溶劑抽提，再次分離出溶劑層和水層，棄去水層，將此次分離出來(lái)的溶劑收集，用水和飽和Nacl液洗后，無(wú)水Na2So4脫水，濃縮干燥，EtOAC可溶酸性餾份，得到天然脫落酸ABA。
天然脫落酸的分子量為264.3，分子式C15H20O4。該物質(zhì)結(jié)構(gòu)具有5個(gè)特點(diǎn)①主核具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)；②環(huán)狀結(jié)構(gòu)上必須有雙鍵③主核具有一個(gè)側(cè)鏈；④具有一個(gè)-COOH，羧基和主核間至少有一碳原子⑤主核和側(cè)鏈必須具立體結(jié)構(gòu)。
另一種制備方法是從植物中廣泛采集Botrytis Cinerea Persr的真菌病害標(biāo)本，選擇新鮮癥狀典型的標(biāo)本，進(jìn)行表面消毒，用滅菌水沖洗，再用組織分離或直接孢子振落法，進(jìn)行單孢分離、純化培養(yǎng)，然后按照室內(nèi)菌株篩選及生產(chǎn)工藝流程方法，選拔生物活性強(qiáng)產(chǎn)率高的株系(產(chǎn)率在0.8‰以上，小麥抑芽快速檢測(cè)試驗(yàn)，抽提物稀釋至1500倍仍然有效的菌株)，再反復(fù)比較選出高產(chǎn)菌株，產(chǎn)率0.9‰～1.5‰，最后依序編號(hào)，正式將菌種接入煮至半熟滅菌大麥粒上，放入-40℃～-60℃冰箱保存?zhèn)溆?。培養(yǎng)基為PDA，室溫培養(yǎng)12天(如用谷糠23℃培養(yǎng)6天)然后加入溶劑萃取、過(guò)濾、濃縮干燥得Botcinolide的粗抽品，放在-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。將所得產(chǎn)物采用抑制小麥胚芽鞘生長(zhǎng)法，進(jìn)行快速生測(cè)篩選，將預(yù)先提取的待測(cè)粗抽品稀釋10倍、50倍、100倍……系列濃度5ml移入放有處理過(guò)的小麥種子的燒杯中，以剛好浸沒(méi)種子為宜，對(duì)照用清水，每一濃度重復(fù)3次，置26℃溫箱中培養(yǎng)5～7天，篩選出活性強(qiáng)產(chǎn)率高的菌株來(lái)生產(chǎn)天然Botcinolide。再用柱層析和TLC法純化、HPLC分析，應(yīng)用IRV、UV、MS，結(jié)合HNMR儀器解析，確定分子量和結(jié)構(gòu)式，分子量是338，分子式C20H34O8，結(jié)構(gòu)式為
將天然抑芽劑用于烤煙栽培過(guò)程的腋芽抑制上，采用涂抹或噴淋方式，達(dá)到了抑制煙芽瘋長(zhǎng)，收到了良好的效果。該抑芽劑也可用于其他植物的封頂打杈?；ɑ?、蔬菜保鮮，調(diào)控作物生育，改善品質(zhì)提高產(chǎn)量等。
天然抑芽劑由于是從植物中采集、分離、培養(yǎng)、萃取、過(guò)濾、干燥而得，整個(gè)加工過(guò)程安全無(wú)毒，不含有機(jī)合成成份，因而不污染環(huán)境、無(wú)殘毒，生產(chǎn)成本低，價(jià)格便宜，每畝成本僅需8～9元，又能增進(jìn)烤煙品質(zhì)，抑芽效果平均在90％以上。該抑芽劑也可用于其他植物的封頂打杈?；ɑ?、蔬菜保鮮，調(diào)控作物生育，改善品質(zhì)提高產(chǎn)量等。
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述


圖1為天然抑芽劑的制備方法工藝流程2為天然脫落酸ABA剩余水溶液的抽提工藝流程3為天然抑芽劑(抑1、抑2)與對(duì)照組在田間應(yīng)用示意圖首先從自然界各種植物(果樹(shù)、蔬菜、花卉、糧食、經(jīng)濟(jì)作物、野生林木……等)中采集Botrytis Cinere Persr的真菌病害標(biāo)本，然后選擇新鮮、癥狀典型的標(biāo)本，進(jìn)行表面消毒，用滅菌水沖洗，進(jìn)行單孢分離、純化培養(yǎng)，采用小麥抑芽試驗(yàn)法，篩選具有生物活性的菌株，再?gòu)挠谢钚缘木耆褐蟹磸?fù)篩選比較，尋找活性物質(zhì)產(chǎn)出率最高的菌株作為菌種保存。例如，我們從萵苣、蔥、草莓、酸木瓜等植物的灰霉病中分離到的7個(gè)菌株，按照前述方法分離培養(yǎng)、萃取、濃縮，即可得到粗產(chǎn)品，提供生測(cè)試驗(yàn)。培養(yǎng)基為PDA、PLD、PDA+柑桔皮粉，在25℃培養(yǎng)7天，然后加入溶劑萃取、過(guò)濾、濃縮干燥得天然ABA粗抽品，放在-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩⑺卯a(chǎn)物采用抑制小麥胚芽鞘生長(zhǎng)法，進(jìn)行快速生測(cè)篩選，將預(yù)先配制好的標(biāo)準(zhǔn)及待測(cè)粗抽品稀釋10倍、50倍、100倍……系列濃度5ml移入放有處理過(guò)的小麥種子的燒杯中，以剛好浸沒(méi)種子為宜，對(duì)照用清水，每一濃度重復(fù)3次，置26℃溫箱中培養(yǎng)5～7天，篩選出活性強(qiáng)產(chǎn)率高的天然脫落酸(ABA)。再用柱層析和TLC法純化、HPLC分析，應(yīng)用IRV、UV、MS，結(jié)合HNMR儀器解析、分子量和結(jié)構(gòu)式，天然脫落酸的分子量是264.3，分子式C15H20O4，結(jié)構(gòu)式為
為了避免原料浪費(fèi)，將萃取后的剩余水溶液再作處理。方法是萃取后的剩余水溶液調(diào)整PH為堿性，經(jīng)EtOAC抽提分離出溶劑層和水層，再對(duì)水層調(diào)整PH值，經(jīng)倍量溶劑抽提，再次分離出溶劑層和水層，棄去水層，將此次分離出來(lái)的溶劑收集，用水和飽和Nacl液洗后，無(wú)水Na2So4脫水，濃縮干燥，EtOAC可溶酸性餾份，得到天然脫落酸ABA。
另一種制備方法是將篩選出來(lái)產(chǎn)率高的菌種，用PDA培養(yǎng)基，室溫培養(yǎng)12天，如果用谷糠作培養(yǎng)基，23℃培養(yǎng)6天，然后用倍量乙酸乙脂浸提24小時(shí)(注意振搖)，過(guò)濾、濃縮，再用苯浸提濃縮，即得到天然抑芽劑Botcinolide。再用柱層析和TLC法純化、HPLC分析，應(yīng)用IRV、UV、MS，結(jié)合HNMR儀器解析，確定分子量和結(jié)構(gòu)式，分子量是338，分子式C20H34O8，結(jié)構(gòu)式為
用這兩種方法制備出的天然抑芽劑用于烤煙腋芽的抑制上。采用抑制小麥胚芽鞘生長(zhǎng)法，進(jìn)行快速生測(cè)篩選。方法是取精選小麥種子(汰除病損，空癟)預(yù)浸1/1000多菌靈懸浮液內(nèi)吸濕處理24小時(shí)。取滅菌燒杯(高6cm，徑4.5cm)若干，杯底各放入小玻球40粒，其上墊一層滅菌圓形濾紙片，紙上再均布小麥種子10粒。分別將預(yù)先配制好的標(biāo)準(zhǔn)及待測(cè)粗抽品稀釋10倍、50倍、100倍……系列濃度5ml移入燒杯中，以剛好浸沒(méi)種子為宜，對(duì)照用清水，每一濃度重復(fù)4次，置26℃溫箱中培養(yǎng)5～7天，觀測(cè)幼根、幼芽生長(zhǎng)有無(wú)抑制現(xiàn)象，而初步判斷抽提粗品中是否含有活性成份。如前所述，產(chǎn)品先經(jīng)室內(nèi)生測(cè)鑒定，證明活性很高，再經(jīng)室內(nèi)盆栽煙株抑芽初試，效果明顯，最后進(jìn)行多點(diǎn)田間小區(qū)試驗(yàn)，98年6月下旬～7月下旬，在我省尋甸縣、陸良縣、彌勒縣分別選擇生長(zhǎng)整齊，高矮一致，品種相同，管理一樣的煙田，(最好選紅花大金元或V-2系列品種)正常封頂打杈后，待腋芽剛露尖約1公分長(zhǎng)，按田間布置圖劃分試驗(yàn)小區(qū)。試驗(yàn)藥劑ABA(抑1)、Botcinolide(抑2)、抑芽敏、除芽通、芽敵。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別稱取一定量的各供試藥劑，加水充分?jǐn)嚢杈鶆颍{(diào)制成所需濃度，ABA(抑1)稀釋成100、200、300倍；Botcinolide(抑2)稀釋成100、200倍；抑芽敏(有效成分25.5％)300倍；除芽通(有效成分33％)100倍；芽敵(有效成分30.2％)50倍；清水對(duì)照。共九個(gè)處理，四次重復(fù)，總計(jì)36個(gè)小區(qū)，每小區(qū)0.03畝，同田隨機(jī)區(qū)組排列。選擇晴天無(wú)雨日期，于當(dāng)天下午5時(shí)后，用杯淋法或涂抹法施藥到各小區(qū)煙株腋芽上，處理后定點(diǎn)掛牌觀察記載，抑芽效果90～92％，每畝成本僅需8～9元。而國(guó)內(nèi)推廣使用的有機(jī)合成抑芽敏、芽敵、除芽通等，每畝成本13元，抑芽效果雖都達(dá)到89～92％，但對(duì)環(huán)境污染及殘毒尚未解決，就抑芽作用來(lái)說(shuō)，天然抑芽劑作為新型抑芽劑是有競(jìng)爭(zhēng)力的，采用涂抹每畝僅需10克，采用噴灑每畝20克，價(jià)錢(qián)也較便宜。該抑芽劑也可用于其他植物的封頂打杈?；ɑ?、蔬菜保鮮，調(diào)控作物生育，改善品質(zhì)提高產(chǎn)量等。
權(quán)利要求
1.一種天然抑芽劑的制備方法，其特征在于a、從植物中廣泛采集Botrytis Cinerea Persr真菌CGMCC NO.0357-1的病害標(biāo)本，選擇新鮮癥狀典型的標(biāo)本，進(jìn)行表面消毒，用滅菌水沖洗，再用組織分離或直接孢子振落法，進(jìn)行單孢分離、純化培養(yǎng)，然后按照室內(nèi)菌株篩選及生產(chǎn)工藝流程方法，選拔生物活性強(qiáng)產(chǎn)率高的株系(產(chǎn)率在0.8％以上，小麥抑芽快速檢測(cè)試驗(yàn)，抽提物稀釋至1500倍仍然有效的菌株)，再反復(fù)比較選出高產(chǎn)菌株，產(chǎn)率0.9‰～1.5‰，最后依序編號(hào)，正式將菌種接入煮至半熟滅菌大麥粒上，放入-40℃～-60℃冰箱保存?zhèn)溆?。b、培養(yǎng)基為PDA、PLD、PDA+柑桔皮粉，在25℃培養(yǎng)7天，然后加入溶劑萃取、過(guò)濾、濃縮干燥得天然ABA粗抽品，放在-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，c、將所得產(chǎn)物采用抑制小麥胚芽鞘生長(zhǎng)法，進(jìn)行快速生測(cè)篩選，將預(yù)先配制好的標(biāo)準(zhǔn)ABA液及待測(cè)粗抽品稀釋10倍、50倍、100倍……系列濃度5ml分別移入放有處理過(guò)的小麥種子的燒杯中，以剛好浸沒(méi)種子為宜，對(duì)照用清水，每一濃度重復(fù)3次，置26℃溫箱中培養(yǎng)5～7天，篩選出活性強(qiáng)，產(chǎn)率高的菌株培養(yǎng)所得粗品天然脫落酸(ABA)，d、再用柱層析和TLC法純化、HPLC分析，應(yīng)用IRV、UV、MS，結(jié)合HNMR儀器解析，確定分子量和結(jié)構(gòu)式，天然脫落酸的分子量是264.3，分子式C15H20O4，結(jié)構(gòu)式為
2.一種天然抑芽劑的制備方法，其特征在于a、從植物中廣泛采集Botrytis Cinerea Persr真菌CGMCC NO.0357-2的病害標(biāo)本，選擇新鮮癥狀典型的標(biāo)本，進(jìn)行表面消毒，用滅菌水沖洗，再用組織分離或直接孢子振落法，進(jìn)行單孢分離、純化培養(yǎng)，然后按照室內(nèi)菌株篩選及生產(chǎn)工藝流程方法，選拔生物活性強(qiáng)產(chǎn)率高的株系(產(chǎn)率在0.8％以上，小麥抑芽快速檢測(cè)試驗(yàn)，抽提物稀釋至1500倍仍然有效的菌株)，再反復(fù)比較選出高產(chǎn)菌株，產(chǎn)率0.9‰～1.5‰，最后依序編號(hào)，正式將菌種接入煮至半熟滅菌大麥粒上，放入-40℃～-60℃冰箱保存?zhèn)溆?，b、培養(yǎng)基為PDA，室溫培養(yǎng)12天(如用谷糠23℃培養(yǎng)6天)然后加入溶劑萃取、過(guò)濾、濃縮干燥得Botcinolide的粗抽品，放在一80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，c、將所得產(chǎn)物采用抑制小麥胚芽鞘生長(zhǎng)法，進(jìn)行快速生測(cè)篩選，將預(yù)先提取的待測(cè)粗抽品稀釋10倍、50倍、100倍……系列濃度5ml移入放有處理過(guò)的小麥種子的燒杯中，以剛好浸沒(méi)種子為宜，對(duì)照用清水，每一濃度重復(fù)3次，置26℃溫箱中培養(yǎng)5～7天，篩選出活性強(qiáng)產(chǎn)率高的菌株來(lái)生產(chǎn)天然Botcinolide，d、再用柱層析和TLC法純化、HPLC分析，應(yīng)用IRV、UV、MS，結(jié)合HNMR儀器解析，確定分子量和結(jié)構(gòu)式，分子量是338，分子式C20H34O8，結(jié)構(gòu)式為
3.據(jù)權(quán)利要求1或2所述的天然抑芽劑，用于烤煙腋芽抑制上。
4.據(jù)權(quán)利要求1所述和制備方法，其特征在于萃取后的剩余水溶液調(diào)整PH為堿性，經(jīng)EtOAC抽提分離出溶劑層和水層，再對(duì)水層調(diào)整PH值，經(jīng)倍量溶劑抽提，再次分離出溶劑層和水層，棄去水層，將此次分離出來(lái)的溶劑收集，用水和飽和Nacl液洗后，無(wú)水Na2So4脫水，濃縮干燥，EtOAC處理得可溶酸性餾份，得到天然脫落酸ABA。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了用于烤煙腋芽抑制的天然抑芽劑,從植物中采集、分離、純化培養(yǎng),選拔生物活性強(qiáng),產(chǎn)率高的株系,進(jìn)行小麥抑芽快速檢測(cè),再反復(fù)比較篩選出高產(chǎn)菌株,再經(jīng)培養(yǎng)、溶劑萃取、濃縮、干燥而得天然脫落酸(ABA)和Botcinolide兩種抑芽劑。將其用于烤煙腋芽的抑制上,有效率達(dá)89～92%,整個(gè)加工過(guò)程安全無(wú)毒,不含有機(jī)合成成份,因而不污染環(huán)境、無(wú)殘毒,生產(chǎn)成本低,價(jià)格便宜,也可用于花卉、蔬菜保鮮,調(diào)控作物生育,改善品質(zhì)提高產(chǎn)量等。
文檔編號(hào)A01N63/02GK1254508SQ9812274
公開(kāi)日2000年5月31日 申請(qǐng)日期1998年11月21日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月21日
發(fā)明者沈嘉祥, 陳志 申請(qǐng)人:昆明恒溢隆經(jīng)貿(mào)有限責(zé)任公司