專利名稱：遺傳工程固氮糞產(chǎn)堿菌與固氮巨大芽孢桿菌共培養(yǎng)發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用工程固氮糞產(chǎn)堿菌株和固氮巨大芽孢桿菌一起共培養(yǎng)發(fā)酵的工藝，及其共培養(yǎng)發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)發(fā)酵配方，從而大幅度提高混合發(fā)酵液的IAA分泌量、耐銨能力和固氮活性。
聯(lián)合固氮菌兼具固氮和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的雙重功能，能通過(guò)固定空氣中的氮素(類似一個(gè)微型生物氮肥廠)、分泌植物激素(刺激根系和植株的生長(zhǎng)發(fā)育)、對(duì)常見(jiàn)病蟲(chóng)害的廣譜抑制或拮抗作用達(dá)到節(jié)肥增產(chǎn)的目的。但直接分離自土壤的野生固氮菌株IAA合成能力也較低，在環(huán)境中存在NH4+時(shí)不能固氮，此外，接種土壤后的競(jìng)爭(zhēng)能力低，接種效益不顯著。上述弱點(diǎn)大大限制了固氮菌肥在綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。
針對(duì)上述問(wèn)題，本工藝與傳統(tǒng)的菌株發(fā)酵工藝相比有兩個(gè)顯著特點(diǎn)一是采用經(jīng)遺傳工程改造的工程固氮菌株以克服野生菌株上述固有的弱點(diǎn)；二是利用共培養(yǎng)技術(shù)的混合增效作用以增強(qiáng)發(fā)酵菌劑在生產(chǎn)應(yīng)用中的增產(chǎn)節(jié)肥效果?，F(xiàn)詳述如下(1)本工藝所采用的菌株均具有獨(dú)特的優(yōu)良性狀，如固氮巨大芽孢桿菌BM101抗逆性強(qiáng)，胞外分泌物豐富，芽孢存活時(shí)間長(zhǎng)，該菌株分離自我國(guó)北方水稻土壤，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院微生物所鑒定，結(jié)果已正式發(fā)表，菌株現(xiàn)保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所菌種保藏中心。
固氮糞產(chǎn)堿菌A1501分離自我國(guó)南方水稻根際土壤，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院微生物所鑒定，結(jié)果已正式發(fā)表，參見(jiàn)1995年“農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)”，第3卷，第1期，第34-41頁(yè)，菌株現(xiàn)保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所菌種保藏中心。該菌株經(jīng)遺傳工程手段改造，獲得以下兩株工程固氮菌株AC1541(參見(jiàn)1995年“農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)”，第3卷，第1期，第34-41頁(yè)的論文中的菌株A1523)和和AI1581(參見(jiàn)“農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)”，1998年增刊第80頁(yè)的論文中的菌株AT63)。工程菌AC1541基因組中整合了組成型表達(dá)的固氮正調(diào)節(jié)基因nifA和一般氮代謝調(diào)節(jié)基因ntrC，在上述兩正調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的協(xié)同作用下，消除了銨對(duì)固氮基因表達(dá)的抑制作用，工程菌在銨存在條件下保持較高的固氮活性和根表定植能力，而在相同條件下野生型則喪失了這種耐銨能力；工程固氮菌株A1581經(jīng)Tn5轉(zhuǎn)座子誘變獲得，能高水平合成植物生長(zhǎng)刺激素IAA，分泌量為野生型A1501的2倍。
(2)本工藝通過(guò)三株菌共培養(yǎng)發(fā)酵24小時(shí)，混和發(fā)酵液培養(yǎng)后的IAA分泌能力，耐銨能力和固氮活性均高于單菌株純培養(yǎng)物，表現(xiàn)出明顯的混合增效特性。因此，采用本工藝可望獲得新一代多功能多菌株的遺傳工程菌肥。
本工藝所采用的三株菌的培養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件如下(1)菌種培養(yǎng)基(15磅、121℃滅菌30分鐘，下同)KH2PO40.4克 K2HPO40.1克 NaCl 0.1克MgSO4.7H2O 0.2克 MnSO4.H2O 0.01克 Fe2(SO4)3.H2O 0.01克Na2MoO4.2H2O 0.01克 蘋(píng)果酸 1.0克 (NH4)2SO40.4克色氨酸1.0克 蒸餾水 1000毫升pH6.830℃培養(yǎng)12-24小時(shí)。工程菌AC1541和AI1581培養(yǎng)時(shí)添加50微克/毫升的卡那霉素。在液體培養(yǎng)基中加1.2-1.5％瓊脂即配制固體斜面或平板(2)種子培養(yǎng)基KH2PO40.4克 K2HPO40.1克MgSO4.7H2O 0.2克(NH4)2SO40.4克 NaCl 5克 KCl 1.0克蔗糖1.0克 乳酸鈉 1.0克色氨酸 1.0克蛋白胨 2克 酵母膏 5克蒸餾水 1000毫升 pH6.8置于180-200轉(zhuǎn)/分恒溫旋轉(zhuǎn)搖床，30℃培養(yǎng)24小時(shí)。工程菌ACl541和AI1581培養(yǎng)時(shí)添加50微克/毫升的卡那霉素。
(3)共培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基KH2PO40.4克 K2HPO40.1克MgSO4.7H2O 0.2克(NH4)2SO40.4克 苯甲酸鈉 1.0克KCl 1.0克蔗糖 1.0克 乳酸鈉 1.0克色氨酸1.0克蛋白胨2克NaCl 5克酵母膏5克蒸餾水 1000毫升pH6.8 置于180-200轉(zhuǎn)/分恒溫旋轉(zhuǎn)搖床，30℃培養(yǎng)24小時(shí)。
三菌株分別在菌種培養(yǎng)基固體平板上30℃靜置培養(yǎng)12-24小時(shí)，挑單菌落分別接種于3個(gè)盛90-150毫升種子培養(yǎng)基的500毫升搖瓶中，置于180-200轉(zhuǎn)/分恒溫旋轉(zhuǎn)搖床，30℃單菌株純培養(yǎng)24小時(shí)后，以6-15％總接種量(三株菌各接種30-50毫升)轉(zhuǎn)入盛0.9-1.5升發(fā)酵培養(yǎng)基的5升搖瓶中，置于180-200轉(zhuǎn)/分恒溫旋轉(zhuǎn)搖床，30℃多菌株共培養(yǎng)24小時(shí)。
經(jīng)檢測(cè)，共培養(yǎng)發(fā)酵液中每毫升含活菌數(shù)約1010-1011個(gè)菌；100毫升含活性物質(zhì)(包括作物生長(zhǎng)刺激物質(zhì)如IAA等)＞50微克；1毫升二次培養(yǎng)后的固氮活性＞50nmol還原的C2H2/小時(shí)，在高銨下(15mM銨)能保持無(wú)銨條件下固氮活性的50％。中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所大鼠經(jīng)口急性毒性測(cè)試，經(jīng)本工藝生產(chǎn)的發(fā)酵液屬實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)；發(fā)酵液中鉛、汞、砷和鎘等重金屬含量低于農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《微生物肥料》(NT227-94)中所規(guī)定的指標(biāo)，發(fā)酵菌劑在田間的應(yīng)用不會(huì)對(duì)土壤造成重金屬污染。


圖1示固氮巨大芽孢桿菌BM101(Ⅰ)和固氮糞產(chǎn)堿菌A1501(Ⅱ)在菌種培養(yǎng)基固體平板上的生長(zhǎng)圖2示固氮巨大芽孢桿菌BM101和2株工程固氮糞產(chǎn)堿菌AC1541和AI1581共培養(yǎng)發(fā)酵液倍比稀釋和涂LB培養(yǎng)基平板培養(yǎng)后的單菌落形態(tài)。白色菌落為BM101；棕褐色小菌落為AC1541或AI1581(工程菌單菌落形態(tài)均與野生型無(wú)差異)。其中所用的LB培養(yǎng)基為蛋白胨10克 NaCl10克酵母膏5克 瓊脂1.2-1.5％蒸餾水1000毫升 pH6.8
30℃靜置培養(yǎng)24小時(shí)實(shí)施例1采用固氮巨大芽孢桿菌BM101和2株工程固氮糞產(chǎn)堿菌AC1541和AI1581共培養(yǎng)發(fā)酵，其培養(yǎng)條件為(1)菌種培養(yǎng)基(15磅、121℃滅菌30分鐘，下同)KH2PO40.4克 K2HPO40.1克 NaCl 0.1克MgSO4.7H2O0.2克 MnSO4.H2O0.01克Fe2(Sn)3.H2O 0.01克Na2MoO4.2H2O 0.01克蘋(píng)果酸 1.0克 (NH4)2SO40.4克色氨酸 1.0克 瓊脂 1.5％pH6.8 蒸餾水1000毫升30℃培養(yǎng)24小時(shí)。工程菌AC1541和AI1581培養(yǎng)時(shí)添加50微克/毫升的卡那霉素。
(2)種子培養(yǎng)基KH2PO40.4克K2HPO40.1克 MgSO4.7H2O 0.2克(NH4)2SO40.4克NaCl 5克KCl 1.0克蔗糖 1.0克乳酸鈉1.0克 色氨酸1.0克蛋白胨 2克 酵母膏5克蒸餾水 100毫升pH6.8置于200轉(zhuǎn)/分恒溫旋轉(zhuǎn)搖床，30℃培養(yǎng)24小時(shí)。工程菌AC1541和AI1581培養(yǎng)時(shí)添加50微克/毫升的卡那霉素。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基KH2PO40.4克K2HPO40.1克MgSO4.7H2O 0.2克(NH4)2SO40.4克苯甲酸鈉1.0克KCl 1.0克蔗糖 1.0克乳酸鈉 1.0克色氨酸 1.0克蛋白胨2克 NaCl5克酵母膏5克 蒸餾水 1000毫升pH6.8 置于200轉(zhuǎn)/分恒溫旋轉(zhuǎn)搖床，30℃培養(yǎng)24小時(shí)。
1株固氮巨大芽孢桿菌BM101和2株工程固氮糞產(chǎn)堿菌AC1541和AI1581分別在菌種培養(yǎng)基固體平板上30℃靜置培養(yǎng)24小時(shí)，挑單菌落分別接種于3個(gè)盛150毫升種子培養(yǎng)基的500毫升搖瓶中，置于200轉(zhuǎn)/分恒溫旋轉(zhuǎn)搖床，30℃單菌株純培養(yǎng)24小時(shí)后，以10％接種量(三株菌各接種50毫升)轉(zhuǎn)入盛1.5升發(fā)酵培養(yǎng)基的5升搖瓶中，置于200轉(zhuǎn)/分恒溫旋轉(zhuǎn)搖床，30℃多菌株共培養(yǎng)24小時(shí)。
實(shí)施例2表1工程菌與野生型某些生物學(xué)特性的比較
*以野生型為100％進(jìn)行比較**以無(wú)氮條件下的固氮活性為100％進(jìn)行比較表2共培養(yǎng)發(fā)酵液與單菌株純培養(yǎng)液某些生物學(xué)特征的比較
1毫升菌液二次培養(yǎng)的固氮活性表3田間小區(qū)試驗(yàn)中共培養(yǎng)發(fā)酵液對(duì)水稻的促生作用及增產(chǎn)效益
表4共培養(yǎng)發(fā)酵液施用幾種蔬菜的增產(chǎn)效益
權(quán)利要求
1．一種共培養(yǎng)發(fā)酵工藝，其特征在于將固氮巨大芽孢桿菌和經(jīng)過(guò)遺傳工程改造的固氮糞產(chǎn)堿菌三種菌株接種于共培養(yǎng)發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)液中，置于恒溫旋轉(zhuǎn)搖床，28℃-30℃，培養(yǎng)20-28小時(shí)。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的共培養(yǎng)發(fā)酵工藝，其特征在于所述的共培養(yǎng)發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)液配方是磷酸二氫鉀0.4克，磷酸氫二鉀0.1克，氯化鈉5.0克，氯化鉀1.0克，七水硫酸鎂0.2克，硫酸銨0.4克，色氨酸1.0克，蔗糖1.0克， 乳酸鈉1.0克，蛋白胨2.0克，酵母膏5克， 苯甲酸鈉1.0克，蒸餾水1000毫升， pH6.8
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用固氮巨大芽孢桿菌和遺傳工程改造的固氮糞產(chǎn)堿菌株共培養(yǎng)發(fā)酵的工藝,以及共培養(yǎng)發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)液配方,從而大幅度提高混合發(fā)酵液的IAA分泌量、耐銨能力和固氮活性,與傳統(tǒng)的單菌株發(fā)酵工藝相比,本工藝的兩大特點(diǎn)是采用經(jīng)遺傳工程改造的工程固氮菌和利用了共培養(yǎng)技術(shù)的混合增效作用。本工藝可望生產(chǎn)新一代多功能多菌株的遺傳工程菌肥,在綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C05F11/00GK1219584SQ9812439
公開(kāi)日1999年6月16日 申請(qǐng)日期1998年11月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月9日
發(fā)明者林敏 , 平淑珍, 程紅梅, 王憶平 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能利用研究所, 北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院