專利名稱：來自致病桿菌的殺昆蟲蛋白毒素的制作方法
本專利申請要求出自美國臨時專利申請序號60/045,641(1997年5月5日提交)的優(yōu)先權(quán)。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及從細菌中分離的毒素及其該毒素作為殺昆蟲劑的應(yīng)用。發(fā)明背景過去，一直對用生物制劑作為控制害蟲的一種選擇感興趣。得到開發(fā)的一種這樣的方法是使用某些線蟲屬控制昆蟲的潛力。諸如Steinernema和Heterorhabditis屬的線蟲可用做生物制劑的部分原因是它們分別可轉(zhuǎn)播致病桿菌屬和光桿狀菌屬的殺昆蟲細菌共生體。一旦進入昆蟲體內(nèi)，這些線蟲將它們的細菌共生體釋放至昆蟲血淋巴中，這些細菌在昆蟲血淋巴中繁殖并最終導(dǎo)致昆蟲死亡。然后線蟲在昆蟲尸體內(nèi)發(fā)育和繁殖。含有細菌的線蟲后代作為侵染性幼蟲離開昆蟲尸體，然后它可以侵入其它的幼蟲，從而重復(fù)導(dǎo)致線蟲繁殖的循環(huán)。盡管此循環(huán)易于微量操作，但是為了有效地作為廣泛使用的殺昆蟲劑，需要在實驗室條件下向大規(guī)模進行此循環(huán)轉(zhuǎn)變，這是非常困難和昂貴的，并且不能有效地生產(chǎn)、維持、分裝和應(yīng)用。
除了諸如線蟲的控制害蟲的生物方法，目前還有一些天然來源的可商業(yè)購買的殺蟲控制試劑。這些天然來源方法與化學(xué)合成方法同樣有效。這樣的天然存在的試劑之一是從細菌蘇云金芽孢桿菌(Bt)得到的晶體蛋白毒素。這些蛋白毒素已配制成可噴灑的昆蟲控制試劑。Bt技術(shù)更近期的應(yīng)用已將合成毒素的基因分離并轉(zhuǎn)入植物中。隨后轉(zhuǎn)基因植物合成Bt毒素，由此控制昆蟲(見美國專利號5,380,831、5,567,600和5,567,862，授予Mycogen，San Diego，CA)。
轉(zhuǎn)Bt基因植物十分有效并且預(yù)計將在某些作物和地區(qū)中大量使用。這種方法引起了一種關(guān)注，即比傳統(tǒng)的噴灑施用更快產(chǎn)生的抗性控制問題。因此，非常需要開發(fā)其它與Bt不同的合成毒素的細菌來源，這種細菌來源可用于轉(zhuǎn)基因植物策略，或與Bt結(jié)合用于產(chǎn)生控制昆蟲的轉(zhuǎn)基因植物。
現(xiàn)有技術(shù)已知，致病桿菌屬與Stenernema屬線蟲共生。不利地是，如在許多文章中所報道的，此細菌只有在注射入昆蟲幼蟲體內(nèi)時才有殺昆蟲活性，而在經(jīng)口攝入時不表現(xiàn)生物活性[見Jarosz J.等，“殺幼蟲毒素參與桿狀線蟲(Steinernema Feltiae和Heterorhabditis bacteriophora)昆蟲寄生的致病機理”Entomophage，36(3)，1991，361-368；Balcerzak，Malgorzata“對由內(nèi)生線蟲(Steinernema Feltiae和Heterorhabditisbacteriophors I)引起的寄生進行比較研究，線蟲-細菌復(fù)合物及相關(guān)細菌本身在致病機理中的作用”Acta Parasitologica Polonica，1991，36(4)，175-181]。
因為上述原因，難以有效地利用線蟲或其細菌共生體的殺昆蟲特性。因此，很有必要發(fā)掘來自致病桿菌屬細菌的具有經(jīng)口攝入活性的蛋白試劑，以便能將由此得到的產(chǎn)物配制成可噴灑的殺昆蟲劑或者分離編碼該蛋白試劑的細菌基因以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。在申請人的發(fā)明之前，還沒有可合成確定具有經(jīng)口攝入活性的蛋白毒素的已知致病桿菌屬菌種或菌株。發(fā)明概述由致病桿菌屬正在生長的細菌細胞合成和分泌的天然毒素是蛋白復(fù)合物。此蛋白復(fù)合物具有從約800到約3300KDa之間變動的天然分子大小，經(jīng)SDA-PAGE凝膠分析可分成很多蛋白組分。該毒素一旦與昆蟲接觸，表現(xiàn)出針對多種昆蟲的明顯毒性。而且，通過改變培養(yǎng)基條件可改進毒素活性。另外，該毒素具有蛋白的特性，其特征在于其活性是熱不穩(wěn)定性的并且對蛋白水解敏感。
本發(fā)明提供了易于施用的殺昆蟲蛋白。
本發(fā)明也提供了施用殺昆蟲毒素的方法，所述毒素具有功能性活性并有效地抵抗多種目的昆蟲。
通過下面的說明，本發(fā)明的目的、優(yōu)點及特征將變得更加清楚。附圖簡述


圖1是通過使用一套特定引物的rep-PCR確定的致病桿菌屬菌株的親緣關(guān)系圖。
圖1上方的軸線是根據(jù)rep-PCR產(chǎn)物記錄測量的菌株間相似百分數(shù)[即，0.0(無相似性)-1.0(100％相似)]。在右邊的軸線上，數(shù)字和字母表示所測的各種菌株。分離的水平平線之間的垂直線表示以水平線上表示的菌株或菌株群(例如菌種DEX1與菌種X.nem有約83％的相似性)之間的相關(guān)程度(從垂直線與上方軸線的外推交叉點讀出)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及由致病桿菌屬細菌合成的獨特殺昆蟲蛋白毒素種類的開發(fā)，該毒素如此處所述的具有經(jīng)口攝入的抵抗昆蟲的功能性活性。致病桿菌屬菌種/菌株可從各種來源分離。這樣的來源之一是昆蟲致病線蟲，更具體地Steinernema屬線蟲或由這些線蟲侵染的昆蟲尸體。也可能是可以容納合成殺昆蟲毒素的致病桿菌屬細菌的其它來源。所述毒素具有如此處定義的功能性活性。在自然環(huán)境中這樣的來源可以是陸生的或水生的。
致病桿菌屬在分類學(xué)上為腸桿菌科的成員，盡管它有某些非此科典型特征的特征。例如，該屬的菌株是典型的硝酸鹽還原陰性和過氧化氫酶陰性。約三年前，致病桿菌屬又分出第二個屬；即只含一種發(fā)光光桿狀菌(以前稱發(fā)光致病桿菌)的光桿狀菌屬(Boemare等，1993，國際系統(tǒng)細菌學(xué)雜志，43，249-255)。這種區(qū)別是基于幾個容易由熟練技術(shù)人員鑒定的不同特征。這些不同包括DNA-DNA雜交研究結(jié)果；過氧化氫酶表型存在(光桿狀菌屬)或缺失(致病桿菌屬)；生物發(fā)光現(xiàn)象的存在(光桿狀菌屬)或缺失(致病桿菌屬)；線蟲宿主的家族，其中致病桿菌屬在Steinernematidae科中發(fā)現(xiàn)而光桿狀菌屬在Heterorhabditidae科中發(fā)明；以及細胞脂肪酸的比較分析(Janse等，1990，應(yīng)用微生物學(xué)通訊，10，131-135；Suzuki等，1990，普通應(yīng)用微生物雜志，36，393-401)。另外，最近集中于16s rRNA基因的序列(Rainey等，1995，國際系統(tǒng)細菌學(xué)雜志，45，379-381)和限制性分析(Brunel，等，1997，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)，63，574-580)的分子研究也支持這兩個屬的分開。這種命名法的改變包括在本說明書中，將來命名法的改變不應(yīng)改變此處所述的本發(fā)明的范圍。
為了確定此處公開的菌株是致病桿菌屬菌株，這些菌株通過定義致病桿菌屬菌種/菌株并將它們與其它腸桿菌科和光狀桿菌屬菌種/菌株區(qū)分開的識別特征來鑒定(Farmer，1984，Bergey系統(tǒng)細菌學(xué)手冊，第1卷，第510-511頁，Akhurst和Boemare，1988，普通微生物學(xué)雜志，134，第1835-1845頁，Boemare等，1993，國際系統(tǒng)細菌學(xué)雜志，43，第249-255頁；此處引用作為參考)。致病桿菌屬的特征如下革蘭氏染色陰性桿菌，微生物大小0.3-2×2-10μm，白色-黃色/褐色菌落的色素形成，包涵體的存在，過氧化氫酶的缺失，不能還原硝酸鹽，沒有生物發(fā)光現(xiàn)象，從培養(yǎng)基攝入染料的能力，白明膠水解陽性，能夠在腸桿菌科選擇培養(yǎng)基上生長，生長溫度低于37℃，厭氧條件下存活，和移動性。
目前，細菌致病桿菌屬包括4種確認的種，嗜線蟲致病桿菌、波氏致病桿菌、伯氏致病桿菌及貝氏致病桿菌(Brunel等，1997，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)，63，574-580)。文獻中已描述一系列的相關(guān)菌株(例如Akhurst和Boemare，1988，普通微生物學(xué)雜志，134，1835-1845；Boemare等，1993，國際系統(tǒng)細菌學(xué)雜志，43，第249-255頁，Putz等，1990，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)，56，181-186；Brunel等，1997，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)，63，574-580，Rainey等，1995，國際系統(tǒng)細菌學(xué)雜志，45，379-381)。此處已有多種致病桿菌屬菌株得到鑒定。這些菌株及其特征列于實施例的表1中。這些菌株已保藏于農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)保藏中心(NRRL)，地址為1815 North UnivesityStreet Peoria，Illinosi 61604，美國。如從
圖1可看到的，這些菌株是不同的?？梢灶A(yù)見，將來可能有其它的致病桿菌屬種類，它們將具有所述菌種的一些或全部特征和目前未定義為致病桿菌屬特性的不同特征。然而，不管其它的特性和特征，此處本發(fā)明的范圍是任何合成如此處所述的具有作為經(jīng)口活化的昆蟲控制試劑的功能性活性的蛋白的致病桿菌屬菌種或菌株。本發(fā)明進一步包括此處指定的菌株及其突變株或相變體。
此處所用的具特定含義的其它術(shù)語如下對于“功能性活性(functional activity)”，此處是指蛋白毒素作用為經(jīng)口活化的昆蟲控制試劑，即該蛋白具有毒性效力或能夠中斷或推遲昆蟲進食，它可能導(dǎo)致昆蟲死亡也可能不導(dǎo)致昆蟲死亡。當昆蟲與經(jīng)轉(zhuǎn)基因植物表達、配制蛋白組合物、可噴灑的蛋白組合物、誘餌基質(zhì)或其它傳遞系統(tǒng)傳遞的有效劑量的來自致病桿菌屬的毒素接觸時，結(jié)果通常是昆蟲的死亡或昆蟲不從將毒素提供給昆蟲的來源進食。
對于“天然大小”，是指由感興趣的致病桿菌屬菌株合成的蛋白毒素或蛋白毒素亞單位在任何處理或修飾之前的非變性大小。蛋白的天然大小可以通過熟練技術(shù)人員可用的一系列方法測定，這些方法包括但不限于凝膠過濾層析、瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳，質(zhì)譜分析、沉淀系數(shù)等?？梢酝ㄟ^蛋白水解、突變、基因截短、蛋白去折疊和其它這樣的蛋白質(zhì)生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知可使用的技術(shù)進行改變蛋白質(zhì)天然大小的處理或修飾。
此處討論的蛋白毒素通常稱為“殺昆蟲劑”。對于“殺昆蟲劑”，此處是指具有如此處進一步定義的功能性活性并用作昆蟲控制試劑的蛋白毒素。
此處所用的術(shù)語“有毒的”或“毒性”是指提供由致病桿菌合成的具有如此處定義的“功能性活性”的毒素。
術(shù)語“致病桿菌毒素”包括由致病桿菌屬微生物菌株合成的具有抵抗昆蟲的功能性活性的任何蛋白，其中致病桿菌毒素可配制成可噴灑的組合物、可由轉(zhuǎn)基因植物表達、可配制成誘餌基質(zhì)、可通過以桿狀病毒、植物RNA病毒為基礎(chǔ)的系統(tǒng)傳遞或通過其它適用的宿主或載體系統(tǒng)傳遞。
表1中列出的所選菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基用來檢測下列項目由致病桿菌屬細菌合成的殺昆蟲毒素的廣度、這些毒素的殺昆蟲范圍、該毒素的蛋白成分。此處鑒定的菌株已表明具有抵抗各種昆蟲目昆蟲的經(jīng)口攝入的毒性。這些昆蟲目包括但不限于鞘翅目、鱗翅目、雙翅目、蜱螨目。
與其它細菌毒素一樣，種群中細菌的突變幾率可能導(dǎo)致毒素基因序列的變異。此處感興趣的毒素是那些產(chǎn)生具有如此所述的接觸后抵抗一系列昆蟲的功能性活性的蛋白的毒素。優(yōu)選地，這些毒素對鱗翅目，鞘翅目，雙翅目和蜱螨目昆蟲有活性。此處本發(fā)明預(yù)期包括與由此處菌株及其衍生菌株合成的蛋白毒素同源的蛋白毒素以及任何致病桿菌合成的具功能性活性的毒素。這些同源蛋白與此處所述的這些毒素在序列上可以不同，但在功能性活性上必須相同。同源毒素包括100KDa-3200KDa之間的蛋白復(fù)合物，并且至少包含至少一個肽亞基，該亞基可以與其它亞基相同或不同。各種蛋白亞基已在本文實施例中得到鑒定和描述。典型地，這些蛋白亞基在約20KDa至約350KDa之間；約130KDa至約300KDa之間；40KDa至80KDa之間；約20KDa至約40KDa之間。
此處所述的毒素非常獨特，其獨特性在于這些毒素具有對發(fā)展昆蟲控制策略至關(guān)重要的功能性活性。在發(fā)展昆蟲控制策略時，可能通過將蛋白直接注射入有機體并躲開消化道來延遲或防止蛋白降解。在這種情況下，施用給有機體的蛋白在變性、非特異性降解或由高等生物免疫系統(tǒng)消除之前保留其功能。將殺昆蟲毒素注射入昆蟲體內(nèi)僅能在實驗室中有效應(yīng)用。
已發(fā)現(xiàn)，具如此處所定義的功能性活性的殺昆蟲蛋白毒素在經(jīng)口攝入或與昆蟲接觸時表現(xiàn)出活性，從而可以發(fā)展僅基于將蛋白毒素摻入昆蟲食物的能力的昆蟲控制策略。這樣的策略可導(dǎo)致昆蟲誘餌的生產(chǎn)。
致病桿菌毒素可以以純化和非純化的形式施用于昆蟲。該毒素可以以約1到約1000mg/升培養(yǎng)基的含量提供。這可能隨配制條件、接種來源情況、分離毒素的技術(shù)等情況變動。此處發(fā)現(xiàn)的毒素可以作為可噴灑的殺蟲劑施用。致病桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)液可以得到制備、稀釋、如果需要使用超濾或其它熟練技術(shù)人員掌握的技術(shù)濃縮100-1000倍。可用注射噴霧器、履帶式噴霧器或其它熟練技術(shù)人員掌握的任何此類裝置進行處理。處理后，培養(yǎng)液可通過將所選昆蟲放置到所述噴灑過的植物上，然后對葉子的損傷進行評分測試。如果需要，可加入佐劑和光保護劑以提高毒素在環(huán)境中的半衰期。在實驗室條件下，可用熟練技術(shù)人員掌握的方法施用培養(yǎng)液及其稀釋液或濃縮液。隨后，可以使材料干燥，將將所測的昆蟲直接放在適當?shù)闹参锝M織上。一個星期后，可使用改良的Guthrie評分法對植物損傷進行評分(Koziel，M.G.，Beland，G.L.，Bowmand，C.，Carozzi，N.B.，Crenshaw，R.，Crossland，L.，Dawson，J.，Desai，N.，Hill，M.，Kadwell，S.，Launis，K.，Lewis，K.，Maddox，D.，McPherson，K.，Meghji，M.Z.，Merlin，E.，Rhodes，R.，Warren，G.W.，Wright，M.t Evola.S.V.，1993)。用這種方法，當以可噴灑的配制物提供或當將編碼此蛋白或其部分的基因或基因衍生物通過轉(zhuǎn)基因植物或微生物提供時，培養(yǎng)液或其它含蛋白的組分可提供針對特異昆蟲蟲害的保護。
毒素可以作為在異源原核或真核宿主中原始表達的分泌物或細胞蛋白施用。細菌通常是蛋白表達的宿主。真核宿主可以包括但不限于植物、昆蟲和酵母。選擇性地，此毒素可以在細菌或田間的轉(zhuǎn)基因植物中表達或用桿狀病毒載體在昆蟲中表達。典型地，通過將一種或多種所述毒素摻入昆蟲食物中使昆蟲與毒素接觸。
飼喂昆蟲的完全致命性是優(yōu)選的，但這不是達到功能性活性所必需的。如果昆蟲躲避毒素或停止進食，即使效果是次致命的(sublethal)或致命性得到延遲或是間接的，這種躲避在一些應(yīng)用中也是有用的。例如，如果需要轉(zhuǎn)基因昆蟲抗性，昆蟲不愿食用此植物與對昆蟲的致死毒性一樣有用，因為最終目標是保護植物免受昆蟲引起的破壞而不是使昆蟲死亡。
有許多方法可用來將毒素摻入到昆蟲的食物中。例如，可以通過如此處公開的用蛋白溶液噴灑食物將毒性蛋白摻入到幼蟲食物來源中。選擇性地，可以用基因操作將純化蛋白導(dǎo)入無害的細菌中，然后細菌可以在培養(yǎng)基中生長，并施用于食物來源或存在于要消滅昆蟲的區(qū)域的土壤中。而且，可用基因操作直接將此蛋白導(dǎo)入昆蟲的食物來源。例如，多種昆蟲幼蟲的主要食物來源是植物材料。
轉(zhuǎn)基因植物的商業(yè)開發(fā)有關(guān)的一個考慮是抗性控制。這特別涉及到蘇云金芽孢桿菌毒素。已有很多商業(yè)開發(fā)蘇云金芽孢桿菌的公司，并且已有很多對產(chǎn)生Bt毒素抗性的關(guān)注。昆蟲抗性控制的一個策略是將由致病桿菌產(chǎn)生的毒素與Bt[來自芽孢桿菌菌株的植物性(vegetative)殺昆蟲蛋白(Ciba Geigy；WO94/21795)]或其它昆蟲毒素結(jié)合。這些組合可以配制成可噴灑的施用物或是分子水平上的結(jié)合。可以用合成昆蟲毒素的致病桿菌基因和其它昆蟲毒素基因如Bt轉(zhuǎn)化植物。
歐洲專利申請0400246A1描述了用2個Bt基因轉(zhuǎn)化植物。這可以是任意兩個基因，不僅僅是Bt基因。另一種產(chǎn)生含有多于一種昆蟲抗性基因的轉(zhuǎn)基因植物的途徑是產(chǎn)生兩種植物，每種植物含有一種昆蟲抗性基因。然后這些植物可以使用傳統(tǒng)的植物育種技術(shù)回交以產(chǎn)生含有多于一種昆蟲抗性基因的植物。
除了產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物，還有其它載體系統(tǒng)，其中重新加工細菌基因是可行的。使用標準的眾所周知的技術(shù)，在同一菌株中，通過將吸引昆蟲的作為食物來源的分子與毒素的功能性活性結(jié)合在一起構(gòu)建基因工程的易于分離的蛋白毒素，并使其在細菌或真核細胞中表達。經(jīng)實驗室純化后，這樣的含“固定”誘餌的毒素試劑可包裝在標準的昆蟲誘捕網(wǎng)罩中。
另一施用方案是將毒素的基因物質(zhì)整合入桿狀病毒載體中。桿狀病毒侵染特定的昆蟲宿主，包括那些致病桿菌毒素適當?shù)哪康睦ハx。可將含致病桿菌毒素的表達構(gòu)建體的侵染性桿狀病毒導(dǎo)入昆蟲侵襲的區(qū)域，由此麻醉或毒殺侵襲的昆蟲。
功能性特征的轉(zhuǎn)移需要將編碼致病桿菌毒素氨基酸序列的核苷酸序列整合到蛋白質(zhì)表達載體中，所述表達載體應(yīng)適合于載體將要存在的宿主。一種得到編碼具功能性特征的蛋白的核苷酸序列的方法是使用從毒素的氨基酸序列推測的信息，從致病桿菌分離合成毒素的天然遺傳物質(zhì)，此方法的大部分在下文中列出。如下文所述的，純化具毒素活性的蛋白的方法也已公開。
已知昆蟲病毒或桿狀病毒可以侵染某些昆蟲并對其有不利影響，病毒對昆蟲的影響緩慢，并且病毒不會立即終止昆蟲的進食。因此，不認為病毒是最佳的昆蟲蟲害控制劑。然而，將致病桿菌毒素基因連接入桿狀病毒載體可以提供有效的傳遞毒素途徑。另外，因為不同的桿狀病毒對不同的昆蟲特異，所以有可能用特定的毒素選擇性地導(dǎo)向特定的破壞性昆蟲蟲害。對毒素基因特別有用的載體是核型多角體病毒載體。已有描述利用這個病毒的轉(zhuǎn)移載體，并且目前已選擇這些載體將外源基因轉(zhuǎn)入昆蟲。病毒-毒素基因重組子可以以經(jīng)口傳播的形式構(gòu)建。桿狀病毒一般通過中腸腸道粘膜侵染目的昆蟲。毒素基因插入到很強的病毒外殼蛋白啟動子之后將得到表達并且能迅速地殺死受侵染的昆蟲。
對于本發(fā)明的蛋白毒素，除了昆蟲病毒或桿狀病毒或轉(zhuǎn)基因植物載體系統(tǒng)，也可使用蘇云金芽孢桿菌膠囊化技術(shù)包裹此蛋白，這些技術(shù)例如但不限于美國專利4,695,455、4,695,462和4,861,595，此處引用所有這些作為參考。本發(fā)明的蛋白毒素的另一種載體系統(tǒng)是將此蛋白配制成誘餌基質(zhì)，然后可用于地上和地下的昆蟲引誘位置。這樣的技術(shù)的例子包括但不限于PCT專利申請WO93/23998，此處引用作為參考。
可使用標準的分子生物學(xué)技術(shù)對此處所述的毒素進行克隆和序列測定。其它信息可見Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，和Maniatis，T.，(1989)，分子克隆實驗指南，冷泉港出版社，此處引用作為參考。
在整個實施例中使用于下列縮寫Tris＝三(羥甲基)氨基甲烷；SDS＝十二烷基磺酸鈉；EDTA＝乙二胺四乙酸；IPTG＝異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，X-gal＝5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，CTAB＝十六烷基三乙基溴化銨；kbp＝千堿基對；dATP，dCTP，dGTP，dTTP，I分別等于2′-脫氧-5′-三磷酸腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和次黃嘌呤；ATP＝腺苷三磷酸。
本發(fā)明特定的實施方案在實施例中得到進一步說明。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將很容易理解具體的實驗細節(jié)只是如隨后的權(quán)利要求書中更充分描述的本發(fā)明的舉例說明。實施例1致病桿菌屬菌株的鑒定為了確定此處所述的收集物由致病桿菌屬分離物組成，根據(jù)致病桿菌屬I型變體典型的和使其與其它腸桿菌科和發(fā)光桿菌屬種類區(qū)分的可識別的微生物特性評估菌株。[Farmer，J.J.，1984，Berger系統(tǒng)細菌學(xué)手冊，第1卷，第510-511頁(Kreig N.R.和Holt，J.G.編緝)。Williams &Wilkins，Baltimore；Akhurst和Boemare，1988，普通微生物學(xué)雜志，134，1835-1845；Forst和Nealson，1996，微生物學(xué)評淪，60，21-43]這些典型特性如下革蘭氏染色陰性桿菌；有機體大小為0.3-2μm寬和2-10μm長；偶爾為絲狀(15-50μm)和球狀；在營養(yǎng)瓊脂上有白色至黃色/褐色菌落的色素形成；結(jié)晶包涵體的存在；過氧化氫酶的缺失，氧化酶陰性；不能還原硝酸鹽；沒有生物發(fā)光現(xiàn)象；從生長培養(yǎng)基中攝取染料的能力；蛋白酶合成陽性；生長溫度低于37℃；在厭氧條件下存活；和積極地移動(表1)。使用大腸桿菌、致病桿菌和發(fā)光桿菌菌株做為對照檢測此方法。表1所示的全部結(jié)果與所有作為腸桿菌科和致病桿屬成員的菌株一致。
使用光度計確定與致病桿菌屬菌株相關(guān)的生物發(fā)光現(xiàn)象的缺少。為測定相對發(fā)光單元的有元，在液體培養(yǎng)基中接種之后多達3個時間間隔(24，48和/或72小時)對每個菌株的培養(yǎng)液(細胞和培養(yǎng)基)進行測定，并與背景發(fā)光度(未接種的培養(yǎng)基)比較。也測定幾個光桿狀菌屬菌株作為發(fā)光度的陽性對照。在測定所選培養(yǎng)液的發(fā)光之前，通過使用Sipper杯在Gilford Systems(Oberlin，OH)分光光度計中測定A560nm值來確定細胞密度。然后將得到的發(fā)光單元按細胞濃度標準化。將每份培養(yǎng)液加入96孔微量滴定板上(每孔100μl)并然后在PackardLumicount光度計(Packard Instrument公司，Meriden CT)上讀數(shù)。每個樣品的測量時間為0.1-10秒。在讀取數(shù)值之前，在光度計中將樣品攪拌10秒鐘。當達到背景發(fā)光度的≥3倍(～1-15相對光單元)時，確定為陽性。另外，通過照相膠卷覆蓋和在暗室中視覺適應(yīng)后肉眼分析來確定一些菌株菌落發(fā)光性的缺乏。
用商品革蘭氏染色試劑盒(BBL，Cockeysville，MD)結(jié)合革蘭氏染色對照玻片(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)來確定每個菌株的革蘭氏染色特性。然后用Zeiss顯微鏡(Carl Zeiss，德國)100倍油浸物鏡(結(jié)合10倍目鏡和2倍放大率)進行顯微鏡評估。使用濕的封固玻片和具測微計的相差顯微鏡(10倍目鏡，2倍和40倍物鏡放大率)顯微檢測每個菌株的有機體大小，細胞描述及包涵體(后兩項的觀察在對數(shù)生長后進行)[Akhurst，R.J.和Boemare，N.E.，1990，在生物防治中的昆蟲病原線蟲(Gaugler，R.和Kaya，H.編緝)，第75-90頁，CRC Press，Boca Raton，USA；Baghdiguian S.，Boyer-Giglio M.H.，Thaler，J.O.，Bonnot G.，Boemare N.，1993，細胞生物學(xué)，79，177-185]。在接種到Bacto營養(yǎng)瓊脂(Difco Laboratories，Detroit，MI，按每個標鑒的說明制備)上之后觀察克隆的色素形成。于28℃溫育5-7天后記錄描述結(jié)果。
為了測試過氧化氫酶活性的存在，將1ml液體培養(yǎng)物或小塊營養(yǎng)瓊脂上所測微生物的克隆放入玻璃試管中。沿著試管壁緩慢加入1ml普通過氧化氫溶液。如果立即或在5秒鐘內(nèi)出現(xiàn)氣泡(推測為氧氣)，那么記錄為陽性反應(yīng)。也對陰性對照未接種的營養(yǎng)瓊脂或液體培養(yǎng)基和過氧化氫溶液進行檢測。
通過將24小時克隆刮到DrySlide氧化酶玻片(Difco，Inc.；Detroit，MI)上以測定每個菌株的氧化酶反應(yīng)。在將微生物刮到玻片上20秒內(nèi)，氧化酶陽性菌株會形成暗紫色，暗示著細胞色素氧化酶C。不能產(chǎn)生暗紫色表明此微生物為氧化酶陰性。
為了檢測硝酸鹽還原，將每種培養(yǎng)物接種到10ml Bacto硝酸培養(yǎng)基(Difco Laboratories，Detroit，MI)中。28℃溫育24小時后，通過加入2滴對氨基苯磺酸試劑和2滴α-萘胺試劑(Difco操作指南，第10版，Difco Laboratories，Detroit，MI，1984)測定硝酸鹽還原。清晰的粉紅或紅色的出現(xiàn)表明已由硝酸鹽形成亞硝酸鹽，而沒有顏色形成表明此菌株為硝酸鹽還原陰性。在后一種情況下，加入細密鋅粉以進一步證實由亞硝酸鹽的形成和所形成的紅色確定的未還原的硝酸鹽的存在。
用含有中性紅染料的Bacto MacConkey瓊脂；含有溴麝香草酚藍染料的Bacto Tergitol-7瓊脂和含有亞甲藍和黃色曙紅染料的Bacto EMB瓊脂(配制好的瓊脂來自Difco Laboratories，Detroit，MI；都根據(jù)標簽的說明制備)檢測每個菌株從生長培養(yǎng)基攝入染料的能力。在接種到上述培養(yǎng)基后，在28℃培育5天后記錄染料的攝入。在Bacto MacConkey和Bacto Tergitol-7培養(yǎng)基上生長是腸桿菌科成員的特征。用Bacto移動性檢測培養(yǎng)基溶液(Difco Labortories，Detroit，MI；按每個標簽的說明制備)測定每個菌株的移動性。對每個菌株進行穿刺培養(yǎng)，在28℃溫育后，通過肉眼觀察從接種線展開生長的擴散帶來判斷陽性移動性。
蛋白酶的合成通過使用Bacto白明膠(Difco Laboratories，DetroitMI)平板，觀察白明膠水解情況來測定，白明膠平板按每個標簽的說明制備。在評估白明膠水解之前，接種培養(yǎng)物并將平板置于22℃溫育3-5天。為了評估在不同溫度下的生長情況，用相同的接種物來源在瓊脂平板[2％肺蛋白胨#3，2％ Bacto-瓊脂(Difco，Detroit，MI)，在去離子水中]上劃線。將平板置于20，28和37℃下培養(yǎng)5天。用電子熱電偶控制和測量培養(yǎng)箱的溫度以保證正確的溫度條件。
致病桿菌屬菌株的氧需求用下述方法測定。在液體巰基乙醇培養(yǎng)基(Difco，Detroit，MI)內(nèi)進行穿刺接種。將試管置于室溫下1周培養(yǎng)后檢查培養(yǎng)物的生長類型和生長程序。用指示劑刃天青來指示培養(yǎng)基中充氧作用或需氧生活區(qū)的存在(Difco操作指南，第10版，Difco Laboratories，Detroit，MI)。在結(jié)果不清晰時，將液體巰基乙醇培養(yǎng)基的瓊脂糖終濃度提高到0.75％并重新檢查生長特性。
致病桿菌屬菌株的多樣性可以使用每個菌株的基因組DNA通過PCR(聚合酶鏈反應(yīng))介導(dǎo)的基因組指紋分析進行測定。這種技術(shù)的根據(jù)是遍及不同細菌種類的基因組中存在重復(fù)DNA序列家族(由Versalovic J.，Schneider，M.，DE Bruijn，F(xiàn).J.和Lupski，J.R.，1994，分子細胞生物學(xué)方法，5，25-40綜述)。有三個重復(fù)序列，即重復(fù)性基因外回文序列(REP)，腸桿菌重復(fù)性基因間保守序列(ERIC)和BOX元件被認為在細菌基因組的組成中起重要作用?？梢韵嘈牛蚪M組成是由這些元件的選擇形成的并且這些元件在親緣關(guān)系相近的細菌菌株基因組中的不同分散方式可用于區(qū)別這些菌株(例如，Louws.F.J.，F(xiàn)ulbright，D.W.，Stephens.C.T.和DE Bruijn，F(xiàn).J.，1994，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)，60，2286-2295)。Rep-PCR利用與這些重復(fù)序列互補的寡核苷酸引列來擴增它們之間的不定大小的DNA片段。通過電泳分離得到的產(chǎn)物以確定每個菌株的DNA“指紋”。表1致病桿菌菌株的分類特征
>*A＝革蘭氏染色；B＝晶體包涵體，C＝生物發(fā)光，D＝細胞形狀，E＝運動性，F(xiàn)＝硝酸鹽還原；G＝過氧化氫酶的存在，H＝白明膠水解，I＝染料攝取，J＝營養(yǎng)瓊脂上的色素形成，K＝在EMB瓊脂上的生長，L＝在MacConkdy瓊脂上的生長，M＝在Tergitol-7瓊脂上的生長，N＝兼性厭氧菌，O＝于20℃的生長，P＝于28℃的生長，Q＝于37℃的生長，R＝氧化酶。++＝陽性特征；-＝陰性特征；rd＝桿狀；S＝在該屬描述特征之內(nèi)的大小，ND＝未測定。SW＝白色，C＝乳狀，Y＝黃色。
為了從菌株中分離基因組DNA，將細胞沉淀重新懸浮于TE緩沖液(10或50mM Tris-HCl，1或50mM EDTA，pH8.0)中至終體積10ml并加入12ml 5M NaCl。以15,000xg將混合物離心20分鐘。將得到的沉淀重新懸浮于5.7mlTE中并加入300μl 10％ SDS和60μl 20mg/mL蛋白酶K(Gibco BRL產(chǎn)品，Grand Island，NY)混合物，于37℃溫育1個小時，加入約10mg溶菌酶，然后將混合物繼續(xù)溫育30至45分鐘。然后加入1ml 5M NaCl和800μl CTAB/NaCl溶液(10％重量/體積CTAB，0.7MNaCl)，并于65℃溫育10至20分鐘(在某些情況下，輕輕攪拌)，然后繼續(xù)攪拌溫育20分鐘以使細胞物質(zhì)變得澄清。加入等體積的氯仿/異戊醇溶液(24∶1，體積/體積)，輕輕混勻后離心。用等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(PCI；50∶49∶1)抽提兩次。用0.6體積的異丙醇沉淀基因組DNA，用滅菌塑料環(huán)或玻璃棒移走沉淀的DNA，用70％的乙醇洗兩次，使之干燥并溶于2ml STE(10mM Tris-Hcl pH8.0，10mM NaCl，1mM EDTA)中。然后于A260nm進行DNA定量。在第二種方法中，加入0.01體積的RNAaseA(50ug/ml終濃度)并在37℃溫育2個小時。然后用等體積的PCI抽提樣品。然后用2倍體積的100％乙醇沉淀樣品并如上所述收集樣品?？諝飧稍锊悠菲鋺腋∮?50-1000μlTE中。
為了進行致病桿菌基因組DNA的rep-PCR分析，使用了下列引物REPIR-I；5＇-IIIICGICGICATCTGGC-3＇和REP2-I；5＇-ICGICTTATCIGGCCTAC-3＇。PCR使用下述25μl反應(yīng)體系進行7.75μlH2O，2.5μl10×LA緩沖液(PanVera公司，Madison.WI)，16μldNTP混合物(每種2.5mM)，每種引物(50pM/μl)各1μl，1μl DMSO，1.5μl基因組DNA(濃度0.075-0.480ug/μl)和0.25μlTakaRa EX Taq酶(PanVera公司，Madison，WI)。PCR擴增在Perkin Elmer DNA熱循環(huán)儀(Norwalk，CT)中進行，使用下述條件95℃進行7分鐘，然后[94℃1分鐘，44℃1分鐘，65℃8分鐘]進行35個循環(huán)，65℃進行15分鐘。循環(huán)后，向25μl反應(yīng)體系中加入5ul 6×凝膠上樣緩沖液(在水中含0.25％溴酚藍和40％重量/體積蔗糖)在15×20cml％瓊脂糖凝膠上使用8μl每種反應(yīng)物在TBE緩沖液(0.09M Tris-硼酸，0.002M EDTA)中電泳。凝膠于45V電泳約16個小時。然后將凝膠在20μg/ml溴化乙啶中染色1個小時并在TBE緩沖液中脫色約3個小時。在紫外光照射下拍攝凝膠的Polaroid_照片。
用RFLP掃描軟件(Scanalytics，Billerica，MA)記錄照片上每一菌株特異大小條帶的有無并將其輸入數(shù)字分類學(xué)軟件程序，NTSYS-pc(Exeter軟件，Setauket，NY)為相似性矩陣(similarity matrix)。在同樣的條件下分析對照大腸桿菌菌株HB101和水稻黃單胞菌水稻致病變種，產(chǎn)生的PCR指紋與公開報道一致(Versalovic，J.，Koeuth，T.和Lupski，J.R.1991，核酸研究，19，6823-6831；Vera Cruz，C.M.，halda-Alija，L.，Louws，F(xiàn).，Skinner，D.Z.，George，M.L.，Nelson，R.J.，DE Bruijn，F(xiàn).J.，Rice，C.和Leach，J.E.，1995，Int.Rice Res.Notes，20，23-24；Vera Cruz.C.M.，Ardales，E.Y.，Skinner，D.Z.，Talag，J.，Nelson，R.J.，Louws，F(xiàn).J.，Leung.H.，Mew，T.W.和Leach，J.E.，1996，植物病理學(xué)，86，1352-1359).然后在NTSYS-pc中用一系列程序分析來自致病桿菌屬菌株的數(shù)據(jù)；SIMQUAL(性質(zhì)數(shù)據(jù)相似性)以產(chǎn)生相似系數(shù)矩陣(用Jaccard系數(shù))和SAHN[連續(xù)的(sequential)、集合的(Agglomerative)、Heriarchical和嵌套的(nested)]聚類(Clustering)，SAHN聚類使用UPGMA方法[使用算術(shù)平均數(shù)的未加權(quán)配對法(Unweighted Pair-Group Method withArithmetic Averages)，UPGMA方法聚集相關(guān)菌株并可表現(xiàn)為親緣關(guān)系圖(
圖1)。COPH(cophenetic)和MXCOMP(矩陣比較)程序用于產(chǎn)生一個cophenetic值矩陣并將此矩陣與作為聚類基礎(chǔ)的原始矩陣比較相關(guān)性。產(chǎn)生作為結(jié)果的標準化框架(Mantel)統(tǒng)計量(r)來評估聚類分析的區(qū)配程度(r＝0.8-0.9代表很好的匹配)。在我們的實驗中r＝0.9，表明了非常好的匹配。因此，此處公開的菌株包括不同的代表致病桿菌屬的容易區(qū)分的菌株群體。
此處公開的菌株在申請遞交以前已保藏于如下國際保藏單位農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)保藏中心(NRRL)，國家農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究中心，ARS-USDA，1815 North University St.，Peoria，IL 61604。1997年4月29日保藏了以下具NRRL名稱的菌株S.Carp(NRRL-B-21732)；X.Wi(NRRL-B-21733)；X.hem(NRRL-B-21734)；X.NH3(NRRL-B-21735)；X.riobravis(NRRL-B-21736)；GL133B(NRRL-B-21737)；DEX1(NRRL-B-21738)；DEX2(NRRL-B-21739)；DEX3(NRRL-B-21740)；DEX4(NRRL-B-21741)；DEX5(NRRL-B-21742)；和DEX6(NRRL-B-21743)。此處公開的其它菌株于1998年4月30日保藏于NRRL。總共保藏了39個菌株。實施例2由各種致病桿菌屬菌株合成的毒素的功能性用途通過將I期變體菌落接種于裝有175ml 2％際蛋白胨#3(PP3)(Difco laboratories，Detroit，MI)液體培養(yǎng)基的帶三重擋板的500ml培養(yǎng)瓶中來產(chǎn)生各種致病桿菌屬菌株的“貯備”培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)瓶具有Delong頸部并用Kaput蓋子覆蓋。接種后，三角瓶在旋轉(zhuǎn)搖床上以150rpm于28℃溫育24-72小時。然后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至裝有無菌磁力攪棒的無菌瓶中，然后用無菌礦物油覆蓋以防止暴露于空氣中。貯備培養(yǎng)物在室溫下保存于黑暗中。然后將這些培養(yǎng)物用作每個菌株發(fā)酵的接種源。I期變體克隆也在-70℃冷凍貯存以用作接種源。I期單菌落從含有溴麝香草酚藍(0.0025％)的PP3平板上挑取并放入3.0ml PP3中；在旋轉(zhuǎn)搖床(150rpm)上于28℃培養(yǎng)過夜。然后加入甘油(以PP3稀釋的)以得到20％的終濃度，并將培養(yǎng)物以小份冷凍于-70℃。培養(yǎng)物接種時，在無菌條件下取出冷凍小份的一部分在含有溴麝香草酚藍的PP3平板上劃線以重新篩選I期克隆。
通過接種2ml油覆蓋的貯備培養(yǎng)物或通過轉(zhuǎn)移I期變體菌落至裝有175ml滅菌培養(yǎng)基的帶三重檔板的用kaput蓋子覆蓋的500ml培養(yǎng)瓶中來預(yù)生產(chǎn)“接種”培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)物。通常在旋轉(zhuǎn)搖床上以150rpm于28℃溫育16個小時后，將接種培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)培養(yǎng)瓶中。生產(chǎn)培養(yǎng)瓶通常通過將約1％的活躍生長的接種培養(yǎng)物加入無菌PP3或胰胨豆胨培養(yǎng)基(TSB，Difco Laboratories，Detroit，MI)中進行接種。對于小規(guī)模生產(chǎn)，培養(yǎng)瓶用I期變體菌落直接接種。在用Kaput蓋子覆蓋的帶三重擋板的500ml燒瓶中進行培養(yǎng)液的生產(chǎn)。生產(chǎn)培養(yǎng)瓶于28℃在旋轉(zhuǎn)搖床上以150rpm搖動。生產(chǎn)發(fā)酵在24-72小時后終止。
適當溫育后，將培養(yǎng)液裝入1.0升無菌的聚乙烯瓶中，于10℃以2600xg旋轉(zhuǎn)1小時，將培養(yǎng)液從細胞和碎片沉淀上倒出。將培養(yǎng)液過濾除菌或用切向流動微過濾裝置(Pall Filtron，Northborough，MA)使用具0.5μm開放通道的聚醚砜(PES)濾膜進一步使培養(yǎng)液澄清。然后用10,000或100,000分子量阻擋膜、M12超濾裝置(Amicon，BeverlyMA)或具10,000或100,000分子量孔經(jīng)的離心濃縮儀(Millipore，Bedford，MA和Pall Filtron，North borough，MA)將得到的培養(yǎng)液濃縮(高達10倍)。在用離心濃縮儀時，將培養(yǎng)液于2000xg旋轉(zhuǎn)約2小時。將膜透過液加入相應(yīng)的滯留物中以得到比所用孔經(jīng)更大的組分的所需濃度。經(jīng)過這些步驟后，培養(yǎng)液用于生化分析和生物學(xué)評估。通過將1ml加工的培養(yǎng)液樣品在填滿沙子的加熱儀中于100℃加熱10-20分鐘來達到熱失活。
來自不同致病桿菌屬菌株的培養(yǎng)液和毒素復(fù)合物可用于減少昆蟲數(shù)量并在抑制昆蟲群體的方法中使用，此方法包括將有效滅活昆蟲量的上述活性物質(zhì)施用到昆蟲的活動場所。從如上所述發(fā)酵的所選致病桿菌菌株的培養(yǎng)液中觀察到的功能性活性的范圍在表2中表示。通過提高培養(yǎng)液的濃度或使用此處公開的其它的發(fā)酵方法可能提高或增加用這些菌株可測到的活性。和與蛋白相關(guān)的活性一致，培養(yǎng)液經(jīng)濃縮后，其功能性活性表現(xiàn)了熱不穩(wěn)定性和/或存在于高分子量滯留物中(大于10KDa，主要是大于100KDa)。表2來自不同致病桿菌菌株的培養(yǎng)液的功能性活性
*＝與對照比較的死亡率和/或生長抑制≥25％**＝1，煙草夜蛾；2，玉米螟；3，煙草天蛾；4，黃瓜十一星葉甲；5，棉鈴象甲；6，蚊；7，棉葉螨；8，棉蛉蟲；9，稻夜蛾；10，甜菜夜蛾。
來自不同的致病桿菌菌株的培養(yǎng)液表現(xiàn)出抵抗多種昆蟲的不同的功能性活性(致死率和/或生長抑制)。更具體地，可見到抵抗玉米根草螟幼蟲和棉鈴象甲的活性，這兩種昆蟲屬于鞘翅目昆蟲。鞘翅目的其它成員包括狹體叩頭蟲，油菜花露尾甲，惡性葉蟲，豆象科和馬鈴薯葉甲。培養(yǎng)液和純化的毒素復(fù)合物也有抵抗鱗翅目成員煙草夜蛾，煙草天蛾，棉鈴蟲，甜菜夜蛾，稻夜蛾和玉米螟的活性。此昆蟲目的其它典型成員是粉紋夜蛾，小地老虎，蘋果蠹蛾，織網(wǎng)衣蛾，印度谷螟，卷葉蛾科，菜粉蝶，頓蓑蛾，美國天幕蟲和草螟亞科。也可見到抵抗雙翅目成員蚊幼蟲的活性。雙翅目的其它成員有豌豆癭蚊，胡蘿卜蠅，甘藍根花蠅，蕪菁根蠅，蔥地種蠅，大蚊和家蠅及各種蚊。也可見培養(yǎng)液有抵抗蜱螨目成員棉葉螨的活性，蜱螨目包括草莓蛛螨，茶半跗線螨，桔紅蜘螨，榆全爪螨，梨埃癭螨和番茄葉刺皮癭螨。
按下達對抵抗玉米根草螟幼蟲的活性進行測定。將致病桿菌培養(yǎng)液(10倍濃縮，過濾滅菌)、PP3或TSB(10倍濃縮)、純化的毒素復(fù)合物或10mM磷酸鈉沖液(pH7.0)以40μl小份直接施用到人工飼料(約1.5cm2)的表面(Rose，R.I和McCabe，J.M，1973，J.Econ.Entomol.，66，398-400)。毒素復(fù)合物以10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)稀釋。使飼料盤在無菌的通風(fēng)櫥中空氣干燥，并且用單個的從表面消毒的卵孵出的新生黃瓜十一星葉甲(Southern com rootworm，SCR)侵染加樣孔。將平板并置于潮濕的培養(yǎng)箱中在27℃放置適當時間(3-5天)。然后記錄死亡率和測定的幼蟲重量。在所有實驗中一般每次處理用8-16昆蟲。對照死亡率一般低于5％。
按下述對抵抗棉鈴象甲(Anthomonas grandis)的活性進行測定。將濃縮(10倍)的致病桿菌培養(yǎng)液或?qū)φ张囵B(yǎng)基(PP3)以60μl小份施用到0.35g人工飼料表面(Stoneville Yellow鱗翅目飼料)并使之干燥。將單個的12-24小時的棉鈴象甲幼蟲置于飼料上，密封加樣孔并在25℃，50％相對濕度(RH)下放置5天。然后記錄死亡率和幼蟲重量。對照死亡率在0-25％之間變動。
按下述對抵抗蚊幼蟲的活性進行測定。測定在96孔微量滴定板上進行。每個加樣孔含有200μl水溶液[10倍濃縮的致病桿菌培養(yǎng)液，對照培養(yǎng)基(2％PP3)和約20只1天齡的幼蟲(埃及伊蚊)]。每種處理有6個加樣孔。在感染后24小時讀取結(jié)果。對照沒有觀察到死亡。
按下述對抵抗鱗翅目幼蟲的活性進行測定。將濃縮(10倍)的致病桿菌培養(yǎng)液、對照培養(yǎng)基(PP3或TSB)、純化的毒素復(fù)合物或10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)以40μl小份直接施用于標準人工鱗翅目飼料(Stoneville Yeoolw飼料)的表面(約1.5cm2)。使飼料平板在無菌的通風(fēng)櫥中空氣干燥，并用單個新生幼蟲侵染每個加樣孔。玉米螟(Ostrinia nttbialis)，稻夜蛾armyworm(Spodoptera frugiperda)，棉鈴蟲(Helicoverpa zea)和煙草天蛾(Manduca sexta)卵來自商業(yè)途經(jīng)并由人工孵化而煙草夜蛾(Heliothis virescens)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)幼蟲由內(nèi)部提供。用幼蟲侵染后，密封飼料平板并置于潮濕的培養(yǎng)箱中于27℃在黑暗中放置適當?shù)臅r間。在第5天記錄死亡率和重量的測定結(jié)果。在所有實驗中每種處理用16只昆蟲。對照死亡率一般為0-12.5％。
按下述對抵抗棉葉螨(Tetranychus urticae)的活性進行檢測。將幼小南瓜修剪成單個子葉并用10倍濃縮的培養(yǎng)液或?qū)φ张囵B(yǎng)基(PP3)噴灑。干燥后，以混合的紅蜘蛛群體侵染植物并將其在潮濕和室溫條件下放置72小時。然后計算存活螨的數(shù)量以確定控制水平、實施例3來自致病桿菌菌株x.riobravis的高度純化的毒素蛋白的功能性活性如引處所述的從致病桿菌菌株x.riobravis的發(fā)酵培養(yǎng)液中純化功能性毒素蛋白。按照實施例2所述的方法，針對5種昆蟲種類的新生幼蟲測定此毒素的活性，這5種昆蟲是黃瓜十一星葉甲，玉米螟，煙草天蛾，棉鈴蟲和煙草夜蛾。結(jié)果見表3。當與400g毒素/cm2飼料劑量的毒素接觸5天后，所有種類都表現(xiàn)出生長抑制和/或致死效應(yīng)。表3高度純化的x.riobravis毒素作用于各種昆蟲種類
*數(shù)值是以對照效應(yīng)校正后的死亡率百分數(shù)/生長抑制百分數(shù)。實施例4不同培養(yǎng)基對所選致病桿菌菌株發(fā)酵培養(yǎng)液的功能性活性的影響。
使用幾種不同的培養(yǎng)基進一步優(yōu)化測定幾種致病桿菌菌株發(fā)酵培養(yǎng)液功能性活性的條件。如此處所述的將GL133B，X.riobravis，X.wi，DEX8和DEX1培養(yǎng)于PP3，TSB和含1.25％NaCl的PP3(PP3S)中。然后按此處所述制備培養(yǎng)液并進行針對新生煙草天蛾的實驗以確定功能性活性的改變。在兩種實驗情況下(情況A為PP3與TSB比較，情況B為PP3與PP3S比較)，在PP3S和/或TSB中的發(fā)酵物的功能性活性與同時得到的PP3發(fā)酵物相比有所提高(表4)。在某些實驗中，發(fā)現(xiàn)用PP3的發(fā)酵物活性不明顯。在情況A和情況B時產(chǎn)生的功能性活性表現(xiàn)出熱不穩(wěn)定性并且由高分子量膜(＞100,000KDa)保留。在細菌完全生長后加入NaCl不提高毒素活性，這表明所看到的功能活性的提高不是由于提高培養(yǎng)基中的NaCl濃度而是由于增加了毒素。
如此處所述的，所看到的PP3S發(fā)酵物中的X.riobravis的活性增加通過從PP3和PP3S中的發(fā)酵物部分純化毒素得到研究。與使用培養(yǎng)液時的觀察結(jié)果一致，來自PP3S培養(yǎng)液的活性組分(如此處所述的從陰離子交換和大小排阻層析得到)含有增加的生物活性，蛋白濃度和如由SDS-PAGE分析確定的更復(fù)雜的蛋白模式。表4不同培養(yǎng)基對所選致病桿病發(fā)酵培養(yǎng)液的功能性活性的影響
＝25-50％死亡率，++＝51-75％死亡率，+++＝＞76％死亡率，-＝＜25％死亡率實施例5致病桿菌X.nem、X.riobravis和X.Wi純化、鑒定及活性以純化那些具有如生物分析中確定的(見實施例2)抵抗煙草天蛾(Manduca sexta，下文稱THW)最大活性的組分為基礎(chǔ)建立如下方法。通常，收集如此處所述在PP3液體培養(yǎng)基中生長并過濾的4-20L致病桿菌培養(yǎng)液并用裝在Amicon M-12過濾裝置(Amicon Inc.，Beverly，MA)上的Amicon S1Y100型螺旋形超濾柱濃縮。滯留物含有其中大部分分子量大于100KDa的天然蛋白，而濾過物含有分子量小于100KDa的天然蛋白。大部分抵抗THW的活性包含在100KDa的滯留物中。然后用10mM磷酸鈉(pH＝7.0)對滯留物連續(xù)滲濾直到濾液達到A280＜0.100。除非另有說明，此后所有步驟都在10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中進行。然后將滯留物濃縮至終體積0.20L并用0.45uM的無菌過濾器(Corning，Corning，NY)過濾。
將經(jīng)過過濾的物質(zhì)以7.5ml/分鐘上樣到pharmacia HR 16/10柱上，該柱裝有PerSeptive Biosystem POROS 50 HQ強陰離子交換基質(zhì)并已在使Perseptive Biosystem SPRINT HPLC系統(tǒng)(Perseptive Biosystems，F(xiàn)ramingham，MA)的緩沖液中平衡。上樣后，用緩沖液洗柱直到A280＜0.100。然后用總體積為50ml的含0.4M NaCl的緩沖液以2.5ml/分鐘的速度從柱上洗脫蛋白20分鐘。然后用含1.0M NaCl的緩沖液以相同的流速洗柱20分鐘(終體積為50ml)。將用0.4M和1.0M NaCl洗脫的蛋白放在分開的透析袋(SPECTRA/POR膜MWCO2000Spectrum，Houston，TX)中并于4℃在12L緩沖液中透析過夜。在某些情況下，0.4M組分不透析而是立即通過凝膠過濾去鹽(見下述)。大部分抵抗THW的活性包含在0.4M組分中。
通過將20ml 0.4M組分上樣到Pharmacia XK26/100柱上進一步純化此組分，該柱預(yù)先使用0.75ml/分鐘的流速裝有Sepharose CL4B(Pharmacia)。當純化X.nem和X.wi時，0.4M組分在Sepharose CL4B柱上分離產(chǎn)生4至5個明顯的峰。來自X.riobravis菌株的蛋白盡管有一個相當于空柱體積的明顯的峰，也有一個很寬的低吸收區(qū)，在800分鐘洗脫的約280分鐘至約448分鐘處。通常，在450分鐘以后和800分鐘之前，可看到兩個較大的吸收峰。X.wi和X.nem的活性部分通常在800分鐘洗脫的約256分鐘至416分鐘處。
如此處所述的根據(jù)A280nm處峰的輪廓收集各組分并使用MilliporeULTRAFREE-15離心過濾裝置Biomax-50K NMWL膜(Millipore Inc.Bedford，MA)濃縮至0.75ml終體積或通過結(jié)合到Pharmacia MonoQHR10/10柱上濃縮。使用BioRad蛋白分析試劑盒(BioRad，Hercules，CA)以牛γ球蛋白作為標準測定蛋白濃度。
用Pharmacia HR 16/50柱確定THW毒素復(fù)合物的天然分子量，該柱已預(yù)先裝有所述磷酸鹽緩沖液中的Sepharose CL4B。然后用已知分子大小的蛋白校準此柱，由此能夠計算毒素復(fù)合物大約的天然分子大小。如表5中所示，毒素復(fù)合物的分子大小如下菌株X.nem為1500±530KDa；菌株X.riobravis為1000±350KDa，菌株X.wi為3290KDa+1150KDa，菌株ILM078為980±245；菌株DEX6為1013±185；菌株ILM080為956±307。然后如此處公開的經(jīng)離子交換、凝膠過濾、離子交換、疏水作用層析、離子交換層析純化的X.wi的高度純化的組分使用定量凝膠過濾來分析其大小。發(fā)現(xiàn)此物質(zhì)的天然分子大小為1049±402KDa(表5)。
使用SDS-PAGE分析測定毒素復(fù)合物中蛋白質(zhì)單個多肽的大小。通常，將20μg來自每個菌株的毒素復(fù)合物蛋白上樣到2-15％聚丙烯酰胺凝膠(Integrated Separation Sytems，Natick，MA)上并于20mA在SDS-PAGE緩沖液(BioRad)中電泳。電泳結(jié)束后，凝膠在BioRad考馬斯亮藍R-250
中染色。隨后，凝膠在甲醇∶乙酸∶水；40∶10∶40(體積/體積/體積)中脫色。用水沖洗凝膠15分鐘并用MolecularDynamics PERSONAL LASER DENSITOMETER(Sunnyvale，CA)掃描。與BioRad高分子標準(200-45KDa)相比對每一泳道定量并計算分子大小。
來自每個菌株的組成THW毒素復(fù)合物的單個多肽的大小在表6中列出。單個多肽的大小為32KDa至330KDa。每個X.wi，X.nem，X.riobravis，ILM080，ILM078和DEX6菌株都有在160-330KDa，100-160KDa和50-80KDa范圍內(nèi)的組成毒素復(fù)合物的多肽。這些數(shù)據(jù)表明菌株之間毒素復(fù)合物的肽組分不同；但是在所有例子中，可看出毒素是由23KDa-330KDa亞單位組成的大的寡聚蛋白復(fù)合物。實施例5來自X.reobravis和X.wi的致病桿菌毒素復(fù)合物的次級分離為了次級分離，如上所述分離出10mg來自X.riobravis的致病桿菌蛋白毒素復(fù)合物并將其以2ml/分鐘的流速上樣到用10mM磷酸緩沖液(pH7.0)平衡的pharmacia MonoQ HR 10/10柱上。用該緩沖液洗柱直至280mm的吸收值回到基線。用在該緩沖液中的0-1.0M NaCl線性梯度以2ml/分鐘洗脫與柱結(jié)合的蛋白1小時。收集2ml級分并用于如此處所述的抵抗THW的生物分析。在HTW生物分析中通過測定每個組分的2倍稀釋液以確定在活性峰。在0.3-0.4M NaCl時的洗脫觀察到抵抗THW的活性峰。收集具有抵抗THW活性的組分并通過SDS-PAGE凝膠電泳進行分析。觀察到有四種主要的大小約為220KDa，190KDa，130KDa和54KDa的多肽。
上述肽在4-20％ SDS-PAGE(Integrated SeparationSystems)上電泳并轉(zhuǎn)印到PROBLOTT聚氟乙烯(PVDF)膜(AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)上。分別將印跡送至Harvard MicroChem和Cambridge Pro Chem以進行氨基酸分析和N末端氨基酸序列測定。
對于X.wi的次級分離實驗，將約10mg毒素以2ml/分鐘的流速上樣到用10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)平衡的MonoQ HR10/10柱上。用該緩沖液洗柱直至A280mm回到基線。用在該緩沖液的0-1.0M Nacl線性梯度以2ml/分鐘洗脫與柱結(jié)合的蛋白1小時。收集2ml級分并用于如此處所述的抵抗THW的生物分析。在A280mm處至少觀察到兩個主要的可測峰。在約0.10-0.25M NaCl的洗脫中觀察到主要的功能性THW活性。收集具有抵抗THW活性的組分并通過凝膠電泳分析。通過SDS-PAGE觀察到有多達8個主要的大小約為330KDa，320KDa，270KDa，220KDa，200KDa，190KDa，170KDa，130KDa，91KDa，76KDa，55Kda，和36KDa的多肽。
將收集的THW活性峰組分上樣到phenyl-sepharose HR5/5柱上。加入固體硫酸銨至終濃度1.7M。然后將此溶液于1ml/分鐘上樣到用含1.7M硫酸銨的50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)平衡的柱上。用含1.7M硫酸銨的50mM磷酸鉀(pH7.0)到10mM磷酸鉀(pH7.0)的線性梯度于0.5ml/分鐘洗脫與柱結(jié)合的蛋白60分鐘。經(jīng)THW生物分析后確定，在A280nm時在約40至約50分鐘之間洗脫活性峰。將組分逆著10mM磷酸鈉(pH7.0)透析過夜。通過SDS-PAGE觀察到有6個主要的大小約為270KDa，220KDa，170KDa，130KDa和76KDa的多肽。
來自5/5或10/10 Phenyl-sepharose柱的THW活性組分肽在4-40％SDS-PAGE凝膠(Integrated Separation Systems)上電泳并轉(zhuǎn)印到PROBLOTT PVDF膜(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)上。將印跡分別送至Harvard MicroChem和Cambridge ProChem以進行氨基酸分析和N末端氨基酸序列測定。130KDa(SEQ IN NO1)、76KDa(SEQ.ID NO2)和38KDa(SEQ.ID NO3)肽的N末端氨基酸序列在本文中列出。
用毒素復(fù)合物或THW phenly-sepharose純化組分進行昆蟲生物分析。對于草地夜蟲蛾，甜菜夜蛾，煙草天蛾，煙草夜蛾，玉米螟和黃瓜十一星葉甲，可觀察到功能性活性(至少20％死亡率和/或至少40％生長抑制)。在所測的毒素復(fù)合物試劑中觀察到抵抗煙草天蛾和煙草夜蛾的活性比抵抗黃瓜十一星葉甲幼蟲的活性更高。X.wi毒素復(fù)合物和任何其它純化組分的昆蟲活性表現(xiàn)為熱敏感性。實施例6致病桿菌菌株X.carpocapsae的生產(chǎn)、分離和鑒定。
將1％X.carpocapsae(也被稱為X.Carp)分離株的過夜培養(yǎng)接種物加入含25ml PP3的125ml培養(yǎng)瓶中，并在旋轉(zhuǎn)搖床上以250rpm于28℃溫育72小時。隨后，如此處所述將培養(yǎng)物以10,000xg離心20分鐘，再使用0.2um的濾膜過濾上清。將15ml樣品上清加入Ultrafree-15100,000 NMWL離心過濾裝置(Millipore MA)，并以2000xg離心。滯留物用100mM磷酸鉀(pH6.9)洗兩次并重新懸浮于1.0ml相同溶液中。如此處公開的通過使用10％分離膠和4％濃縮膠的SDS-PAGD對蛋白進行分析，膠的大小用BioRad預(yù)染色的標準(Hercules，CA)校準。凝膠在15℃以40V電泳16個小時，然后用來自Novex.Inc.(SanDiego，CA)的膠態(tài)藍染色。表5來自致病桿菌菌株的毒素復(fù)合物的鑒定
對于進一步的分離，將樣品在使用100mM磷酸鉀(pH6.9)的無梯度系統(tǒng)下上樣到內(nèi)徑7.5mm、柱高60cm的BIO-SEP S4000柱(Phenomenex，Torrance，CA)上。每個樣品的總上樣量為250-500μg蛋白。根據(jù)蛋白大小(大小排阻層析)將組分收集為如下3組大小1,000KDa的蛋白；800-1000KDa的蛋白和小于800KDa的蛋白。選取800,000-1,000,000Da的組分用于進一步分析。表6來自致病菌株的毒素復(fù)合物肽的分子大小(KDa
收集具有最大功能性活性的800-1000KDa組分并用100,000NMWL離心過濾裝置(Millipore，Bedford，MA)濃縮。每個收集的滯留物組分用100mM磷酸鉀(pH6.9)洗兩次并重新懸浮。使用bicinchoninic酸蛋白分析試劑盒(Pierce，Rockford，IL)測定蛋白濃度。此組分中的蛋白通過如此處所述的SDS-PAGE得到分析并發(fā)現(xiàn)有一些不同大小的蛋白。然后將這些物質(zhì)在DEAE柱上進一步分離，其中以逐漸增加的鹽濃度洗脫蛋白。然后又通過SDS-PAGE檢測具有最大活性的組分并發(fā)現(xiàn)該組分由4種主要蛋白組成，它們的大小如下200，190，175和45KDa。將來自DEAE步驟的活性組分過HPLC凝膠過濾柱(如上述，Biosep S4000)并發(fā)現(xiàn)抵抗煙草天蛾的毒性活性存在于含大于800KDa的天然蛋白的組分中。
按下述進行生物分析。煙草天蛾卵購自Carolina生物供應(yīng)公司。這些卵在新鮮的小麥胚飼料(ICN，CA)上孵化和飼養(yǎng)，于25℃培養(yǎng)在16小時光照/8小時黑暗光循環(huán)培養(yǎng)箱中。通過將12只煙草天蛾幼蟲放在含300μg如上述得到的超濾滯留物的昆蟲食物塊上來測定經(jīng)口攝入的毒性數(shù)據(jù)。連續(xù)觀察5天。對于HPLC排阻層析組分，將20ug總蛋白用于小麥胚飼料。實驗重復(fù)兩次。
序列表(1)基本信息(i)申請人Ensign，Jerald C.
Bowen，David J.
Tenor，Jennifer L.
Ciche，Todd A.
Petell，James K.
Strickland，James A.
Orr，Gregory L.
Fatig，RaymondBintrim，Scott B.(ii)發(fā)明名稱來自致病桿菌的殺昆蟲蛋白毒素(iii)序列數(shù)目3(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人Dow AgroSciences，LLC(B)街名9330 Zionsville Road(C)城市Indianapolis(D)州名IN(E)國家US(F)郵政編碼(ZIP)46268(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機；IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(vi)目前申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日
(viii)律師/代理人信息(A)姓名Borucki.Andrea T.
(B)登記號33651(C)參考/著錄號50612P1(ix)電信信息(A)電話317-337-4846(B)傳真317-337-4847(2)關(guān)于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度12個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(v)片段類型N端(vi)序列描述SEQ ID NO1Asn Gln Asn Val Glu Pro Ser Ala Gly Asp Ile Val1 5 10(2)關(guān)于SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(v)片段類型N端(vi)序列描述SEQ ID NO2Ser Gln Asn Val Tyr Arg Tyr Pro1 5(2)關(guān)于SEQ ID NO3的信息
(i)序列特征(A)長度7個氯基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(v)片段類型內(nèi)部的(vi)序列描述SEQ ID NO3Met Thr Lys Gln Glu Tyr Leu1 權(quán)利要求
1.一種組合物，已含有效劑量的具抵抗昆蟲的功能性活性的致病桿菌蛋白毒素，所述蛋白毒素來自天然分子大小至少100KDa的蛋白。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中致病桿菌毒素具有經(jīng)口攝入抵抗昆蟲的功能性活性并由嗜線蟲致病桿菌、波氏致病桿菌，伯氏致病桿菌，貝氏致病桿菌或其它致病桿菌屬種類的純化培養(yǎng)物合成。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中純化的致病桿菌培養(yǎng)物選自由S.carp，X.wi，X.nem，X.NH3，X.riobravis，GL133B，DEX1，DEX2，DEX3，DEX4，DEX5，DEX6，DEX7，DEX8，ILM037，ILM039，ILM070，ILM078，ILM079，ILM080，ILM081，ILM082，ILM083，ILM084，ILM102，ILM103，ILM104，ILM129，ILM133，ILM135，ILM138，ILM142，ILM143，GLX26，GLX40，GLX166，SEX20，SEX76，和SEX180組成的群體。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中具有抵抗昆蟲的功能性活性的毒素由稱為S.carp，X.wi，X.nem，X.NH3，X.riobravis，GL133B，DEX1，DEX2，DEX3，DEX4，DEX5，DEX6，DEX7，DEX8，ILM037，ILM039，ILM070，ILM078，ILM079，ILM080，ILM081，ILM082，ILM083，ILM084，ILM102，ILM103，ILM104，ILM129，ILM133，ILM135，ILM138，ILM142，ILM143，GLX26，GLX40，GLX166，SEX20，SEX76，and SEX180的致病桿菌菌株的純化培養(yǎng)物合成。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中具有抵抗昆蟲的功能性活性的毒素是由致病桿菌純化培養(yǎng)物合成的一種或多種毒素的混合物。
6.權(quán)利要求3的組合物，其中具有抵抗昆蟲的功能性活性的毒素由所述致病桿菌的純化培養(yǎng)物合成，所述毒素是一種或多種毒素的混合物所述純化培養(yǎng)物選自由S.carp，X.wi，X.nem，X.NH3，X.riobravis，GL133B，DEX1，DEX2，DEX3，DEX4，DEX5，DEX6，DEX7，DEX8，ILM037，ILM039，ILM070，ILM078，ILM079，ILM080，ILM081，ILM082，ILM083，ILM084，ILM102，ILM103，ILM104，ILM129，ILM133，ILM135，ILM138，ILM142，ILM143，GLX26，GLX40，GLX166，SEX20，SEX76，和SEX180組成的群體。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中昆蟲屬于鞘翅目，鱗翅目，雙翅目或蜱螨目。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中鞘翅目昆蟲種類選自由玉米根草螟、棉鈴象甲、狹體叩頭蟲、油菜花露尾甲、惡性葉蟲、豆象科和馬鈴薯葉甲組成的群體。
9.權(quán)利要求7的組合物，其中鱗翅目昆蟲種類選自由甜菜夜蛾、玉米螟、煙草天蛾、煙草夜蛾、粉紋夜蛾、小地老虎、棉鈴蟲、蘋果衣蛾、織網(wǎng)衣蛾、印度谷螟、卷葉蛾科、花粉喋、頓蓑蛾、美國天幕蟲、草螟亞科和草地夜蛾組成的群體。
10.權(quán)利要求7的組合物，其中雙翅目昆蟲種類是選自由豌豆癭蚊、胡蘿卜蠅、甘藍根花蠅、蕪菁根蠅、蔥地種蠅、大蚊、家蠅和各種蚊種類組成的群體。
11.權(quán)利要求7的組合物，其中蜱螨目昆蟲種類選自由棉葉螨、草莓蛛螨、茶半跗線螨、桔紅蜘螨、榆全瓜螨、梨埃癭螨和番茄葉刺皮癭螨組成的群體。
12.基本上純的含有致病桿菌屬菌株的微生物培養(yǎng)物，其中致病桿菌屬菌株選自由S.carp，X.wi，X.nem，X.NH3，X.riobravis，GL 133B，DEX1，DEX2，DEX3，DEX4，DEX5，DEX6，DEX7，DEX8，ILM037，ILM039，ILM070，ILM078，ILM079，ILM080，ILM081，ILM082，ILM083，ILM084，ILM102，ILM103，ILM104，ILM129，ILM133，ILM135，ILM138，ILM142，ILM143，GLX26，GLX40，GLX166，SEX20，SEX76，和SEX180組成的群體。
13.含致病桿菌蛋白的純化蛋白制品，其中致病桿菌蛋白有至少一個分子量大約在約20KDa到約350KDa；約130KDa到約350KDa；約80KDa到約130KDa；約40KDa到約80KDa；或約20KDa到約40KDa之間的亞基。
14.權(quán)利要求13的純蛋白制品，包含天然的致病桿菌蛋白，所述致病桿菌蛋白具有至少一個分子量至少為100Kda或更大的亞基。
15.純化蛋白制品，包含含有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白。
16.控制昆蟲的方法，包括對昆蟲施用有效量的具有抵抗昆蟲的功能性活性的蛋白毒素，其中蛋白由致病桿菌屬純化細菌培養(yǎng)物合成并具有至少為100KDa的分子量。
17.權(quán)利要求16的方法，其中具有抵抗昆蟲的功能性活性的致病桿菌毒素由嗜線蟲致病桿菌，波氏致病桿菌，伯氏致病桿菌，貝式致病桿菌或致病桿菌屬種類的純化培養(yǎng)物合成。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述致病桿菌的純化培養(yǎng)物選自由S.carp，X.wi，X.nem，X.NH3，X.riobravis，GL133B，DEX1，DEX2，DEX3，DEX4，DEX5，DEX6，DEX7，DEX8，ILM037，ILM039，ILM070，ILM078，ILM079，ILM080，ILM081，ILM082，ILM083，ILM084，ILM102，ILM103，ILM104，ILM129，ILM133，ILM135，ILM138，ILM142，ILM143，GLX26，GLX40，GLX166，SEX20，SEX76，和SEX180組成的群體。
19.權(quán)利要求16的方法，其中具有抵抗昆蟲的功能性活性的毒性由稱為S.carp，X.wi，X.nem，X.NH3，X.riobravis，GL133B，DEX1，DEX2，DEX3，DEX4，DEX5，DEX6，DEX7，DEX8，ILM037，ILM039，ILM070，ILM078，ILM079，ILM080，ILM081，ILM082，ILM083，ILM084，ILM102，ILM103，ILM104，ILM129，ILM133，ILM135，ILM138，ILM142，ILM143，GLX26，GLX40，GLX166，SEX20，SEX76，和SEX180的致病桿菌菌株的純化培養(yǎng)物合成。
20.權(quán)利要求16的方法，其中具有抵抗昆蟲的功能性活性的毒素是由致病桿菌的純化培養(yǎng)物合成的一種或多種毒素的混合物。
21.權(quán)利要求16的方法，其中的昆蟲屬于鞘翅目，鱗翅目，雙翅目或蜱螨目。
22.權(quán)利要求21的方法，其中鞘翅目昆蟲種類選自由玉米根草螟、棉鈴象甲、狹體叩頭蟲、油菜花露尾甲、惡性葉蟲、豆象科和馬鈴薯葉甲組成的群體。
23.權(quán)利要求21的方法，其中鱗翅目昆蟲種類選自由甜菜夜蛾、玉米螟、煙草天蛾、煙草夜蛾、粉紋夜蛾、小地老虎、棉鈴蟲、蘋果蠧蛾、織網(wǎng)衣蛾、印度谷螟、卷葉蛾科、花粉喋、頓蓑蛾、美國天幕蟲、草螟亞科和草地夜蛾組成的群體。
24.權(quán)利要求21的方法，其中雙翅目昆蟲種類是選自由豌豆癭蚊、胡蘿卜蠅、甘藍根花蠅、蕪菁根蠅、蔥地種蠅、大蚊、家蠅和各種蚊種類組成的群體。
25.權(quán)利要求21的方法，其中蜱螨目昆蟲種類選自由棉葉螨、草莓蛛螨、茶半跗線螨、桔紅蜘螨、榆全瓜螨、梨埃癭螨和番茄葉刺皮癭螨組成的群體。
26.改變由致病桿菌屬菌株合成的毒素水平或毒素組合物的方法，包括改進培養(yǎng)基組成。
27.權(quán)利要求26的方法，其中通過在胰胨豆胨培養(yǎng)液中發(fā)酵來改進培養(yǎng)基組成。
28.權(quán)利要求26的方法，其中通過增強所述培養(yǎng)基的離子強度來改進培養(yǎng)基組成。
全文摘要
來自致病桿菌屬的蛋白與昆蟲接觸時對其有毒性。這些蛋白毒素可施用于昆蟲幼蟲食物和植物以控制昆蟲。
文檔編號A01N63/02GK1229413SQ98800791
公開日1999年9月22日 申請日期1998年5月4日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月5日
發(fā)明者J·C·安西根, D·J·伯溫, J·L·坦納, T·A·希馳, J·K·帕泰爾, J·A·斯特里克蘭德, G·L·歐爾, R·O·法提格, S·B·賓特里姆, R·T·弗蘭馳－康斯坦特 申請人:道農(nóng)業(yè)科學(xué)公司, 威斯康星阿路姆尼研究基金會