專利名稱：生產(chǎn)雜交小麥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)普通小麥和硬粒小麥的雜種種子，所述種子產(chǎn)生高度雜合性和表現(xiàn)型一致的雜種植株。更具體地說，本發(fā)明涉及基于染色體工程的保持用于產(chǎn)生雜交小麥植株的雄性不育母本系的新方法，該母本系對隱性突變雄性不育等位基因、對隱性標(biāo)記等位基因和對顯性雄配子殺傷等位基因是純合的，本發(fā)明還涉及用于保持該母本系的新保持系，其與該母本系等基因但卻具有一條附加的異源工程化染色體，該染色體攜帶一個顯性雄性能育性等位基因、一個對所述顯性天然雄配子殺傷等位基因的雄配子殺傷敏感的隱性雄配子殺傷等位基因和一個顯性選擇性標(biāo)記等位基因。所述異源染色體臂上所有的等位基因由于所述異源染色體與所述小麥染色體之間缺乏配對和重組而永久地連鎖。所述異源工程化染色體上的隱性雄配子殺傷等位基因的存在，保證了所有的保持系存活的雄性配子缺乏該染色體，并由此缺乏所述顯性雄性能育性等位基因和所述選擇性標(biāo)記等位基因。一方面，約20-50％的雌性配子攜帶該異源工程化染色體。當(dāng)所述選擇性標(biāo)記是影響植株高度的等位基因時(攜帶該工程化染色體的植株比未攜帶該工程化染色體的植株高8-10cm)，可以獨立于矮植株收獲高植株。高植株上發(fā)育的種子中約20-50％攜帶所述異源工程化染色體，并因此而發(fā)育成雄性可育植株，而50-80％缺乏該染色體并因此發(fā)育成為雄性不育植株。每年獨立收獲高植株種子的能力保持了所述保持系中雄性可育植株的比例恒定。當(dāng)該選擇性標(biāo)記是除草劑抗性基因時(例如，對綠麥隆抗性)，可以將該除草劑施用于該自交保持系的子代，由此殺死缺乏該工程化染色體的所有植株(雄性不育植株)，僅保持系(雄性可育)植株存活。這使得可以在每代中僅生長所述自交保持系子代的雄性可育植株。當(dāng)所述選擇性標(biāo)記是藍糊粉(胚乳著色性狀)時，可以分離在該保持系上發(fā)育成藍色種子的種子(從該種子發(fā)育雄性可育植株(保持系))以及天然著色(紅色/白色)的種子(從該種子發(fā)育雄性不育植株(母系)。從所述自交保持系子代直接選出雄性不育母系的可能性簡化了該系統(tǒng)，并大大降低了雜種種子的生產(chǎn)成本。本發(fā)明再提供產(chǎn)生所述保持系的新方法、將所需栽培品種轉(zhuǎn)化成為雄性不育母系和該母系的保持系的新方法以及產(chǎn)生雜交小麥的新方法，其中產(chǎn)生的雜種植株對所述隱性突變雄性不育等位基因均為雜合的并因此是雄性可育的。
背景技術(shù)：
已確認(rèn)許多雜種植株系比純化等位基因植物系的產(chǎn)量高，并表現(xiàn)出品質(zhì)改良和對環(huán)境和生物壓力的更高的耐受。與雄花和雌花物理分離的玉米不同，普通小麥(面包)(Triticum aestivum var.aesticum)和硬粒小麥(通心粉)(Triticum turgidum var.durum)是主要自花授粉的物種，每朵花具有雌器官和雄器官。為產(chǎn)生雜種種子，因此有必要使母本雄性不育。由于小麥人工去雄不切實際，因此可以通過施用化學(xué)雜交藥劑(CHA)或通過遺傳手段導(dǎo)致雄性不育。利用CHA對小麥植株殺雄很昂貴、效率低且具污染性。實際上，CHA的使用目前主要局限于科學(xué)實驗。
通過遺傳手段產(chǎn)生雜種種子需要以下條件1)母本完全和穩(wěn)定的雄性不育性；2)通過父本完全和穩(wěn)定的育性恢復(fù)；3)通過保持系容易地繁殖母本(雄性不育)。盡管小麥遺傳學(xué)家已知這些條件，但是自從描述了第一個雄性不育小麥(Kihara,1951)后的46年中在雜交小麥生產(chǎn)方面一直未有突破。
有二種主要類型的遺傳雄性不育可以用于雜種種子生產(chǎn)核置換或異質(zhì)品系中的細胞質(zhì)雄性不育(CMS)，由異源細胞質(zhì)與普通小麥細胞核的不親和相互作用引起，和真細胞質(zhì)(euplasmic)品系中的基因性雄性不育(GMS)，由正常情況下賦予普通小麥細胞質(zhì)中雄性能育性的核基因隱性突變或缺失引起。應(yīng)注意涉及異源細胞質(zhì)的CMS通常降低雜種的生產(chǎn)能力，而涉及天然細胞質(zhì)的GMS應(yīng)提供基因組正常表達和雜種的完全生產(chǎn)能力。
雖然在許多經(jīng)濟作物(例如玉米)中基因性雄性不育占優(yōu)勢，尚未在普通小麥或硬粒小麥中充分利用該類型。普通小麥中的絕大多數(shù)嘗試均是針對在細胞質(zhì)雄性不育的基礎(chǔ)上產(chǎn)生雜種種子。在此方面普遍使用了另一小麥物種提莫菲維小麥(Triticum timopheevii)的細胞質(zhì)(G細胞質(zhì))。含有該細胞質(zhì)的異質(zhì)系為雄性不育。研究過的另一細胞質(zhì)類型是易變山羊草(Aegilops variablilis)(Sv細胞質(zhì))的細胞質(zhì)。該細胞質(zhì)在缺乏染色體臂1BS上Sv恢復(fù)基因的品系中引起雄性不育。但是，如上所述，將異源細胞質(zhì)做為不育因子在普通小麥中使用有很大的缺點，因為普通小麥細胞核與異源細胞質(zhì)之間的相互作用負面影響各種重要的性狀。另外，難以為這種異質(zhì)雄性不育系尋找在廣泛基因型范圍內(nèi)高度有效的穩(wěn)定的育性恢復(fù)基因。另外，該系統(tǒng)亦需要父本育種(例如導(dǎo)入可以恢復(fù)異源細胞質(zhì)雄性能育性的基因)，因此使得雜種種子生產(chǎn)更加昂貴，并且限制了可以用于測試結(jié)合能力(對顯著的雜種優(yōu)勢起作用)的父本的數(shù)量。
另一方面，基因性雄性不育在正常普通小麥或硬粒小麥細胞質(zhì)中表達。因此預(yù)期沒有對植株特性的細胞質(zhì)誘導(dǎo)的有害影響。另外，使用隱性雄性不育等位基因純合的母本，天然對賦予雄性能育性的顯性等位基因純合的任何小麥栽培品種都可以做為將F1雜種完全恢復(fù)育性的父本使用。不需要育種父本系，不存在對可以與雄性不育母本雜交并評價其結(jié)合能力的父本的數(shù)量的限制。
已描述了普通小麥中攜帶影響雄性能育性的幾條染色體臂，例如第四組的染色體臂染色體4A的長臂(4AL)、染色體4B的短臂(4BS)和染色體4D的短臂(4DS)，它們分別攜帶正常雄性能育性Ms-A1、Ms-B1和Ms-D1基因，和第五組染色體的長臂分別攜帶Ms-A2、Ms-B2和Ms-D2基因的5A、5B和5D(分別為5AL、5BL和5DL)。但是，直到現(xiàn)在才僅在染色體臂4BS(原為4AS)的遠端區(qū)上的Ms-B1基因座中發(fā)現(xiàn)或誘導(dǎo)引起雄性不育的三個隱性等位基因。據(jù)報道這些等位基因ms-B1-a、ms-B1-b和ms-B1-c(亦常分別稱為ms1a、ms1b和ms1c)除雄性不育外對植物特性不造成任何影響(Wilson和Driscoll,1983綜述)。
雄性不育母本系的保持是基于GMS的成功雜種生產(chǎn)系統(tǒng)的主要障礙。在二個方向上進行了努力以保持雄性不育母本。一個是使用“育性細胞質(zhì)”，另一個是為保持系配備與所述隱性突變雄性不育等位基因近同源等位的異源育性等位基因，該等位基因不傳遞至所述母本系。
保持雄性不育母本的第一種方法即使用“育性細胞質(zhì)”在很早以前由Hermsen(1965)提議，但直至現(xiàn)在未得到實驗結(jié)果支持。他描述了“育性細胞質(zhì)”的可能性，該細胞質(zhì)即天然或異源細胞質(zhì)，其中在雄性不育等位基因純合的植物中不表達雄性不育，因此該系表現(xiàn)型為雄性可育。不幸的是至今未發(fā)現(xiàn)這種細胞質(zhì)。Hermsen提議的系統(tǒng)不能實際實現(xiàn)，主要是因為在普通小麥中沒有可以恢復(fù)雄性不育基因型育性的充足的細胞質(zhì)種內(nèi)變異，并且緊密相關(guān)的小麥種的細胞質(zhì)亦不能促進恢復(fù)雄性不育基因型的雄性能育性。另一方面，較遠緣物種的細胞質(zhì)通常引起雄性不育，除了在該異質(zhì)系攜帶合適的恢復(fù)基因(restorer)的情況下。雖然如此，未研究它們對雄性不育等位基因的影響。
Franckowiak等(1976)將雄性能育性恢復(fù)基因歸因于普通小麥的D基因組，因為節(jié)節(jié)麥(Aegilops squarrosa)(D)細胞質(zhì)中的異質(zhì)普通小麥(基因組AABBDD)是雄性可育的，并且D細胞質(zhì)中的異質(zhì)硬粒小麥(基因組AABB)是雄性不育的。他們在具有D細胞質(zhì)的普通小麥異質(zhì)系中誘導(dǎo)突變，并且提議了一個雜種生產(chǎn)系統(tǒng)，其中通過同一栽培品種的euplasmic類型保持這種異質(zhì)雄性不育親本，即雄性不育母本，雄性不育親本具有雄性能育性突變等位基因和D細胞質(zhì)，保持系具有同樣的突變等位基因和天然(B)細胞質(zhì)，父本具有正常雄性能育性等位基因和B細胞質(zhì)。通過雜交這種母本和父本恢復(fù)雜種的育性。但是這種雜種具有源自母本的D細胞質(zhì)，從這種細胞質(zhì)可能對雜種特性(產(chǎn)量、活力等)具有有害影響的事實來看，這是不利的。而且，在上述Franckowiak等的系統(tǒng)中，用于在該雄性不育母本的后續(xù)世代中obtention的保持系是攜帶雄性能育性突變和確保保持系育性的B細胞質(zhì)的系。從所有得到的雄性不育突變體在B細胞質(zhì)中亦是不育的(Sasakuma等，1978)事實來看，該系統(tǒng)證明是不切實際的。因此，如此提議的“保持”系亦是雄性不育的，沒有實用價值。因此，由于不存在合適的保持系，已放棄了Franckowiak等的系統(tǒng)。
與上述相似，F(xiàn)eldman和Millet(未發(fā)表數(shù)據(jù))發(fā)現(xiàn)攜帶B基因組染色體(例如4B和5B)上的雄性不育等位基因的基因型在含有D和Sv細胞質(zhì)的異質(zhì)系中亦是雄性不育的。因此看起來“育性細胞質(zhì)”的概念(Hermsen,1965)在小麥中不可能實現(xiàn)。
保持雄性不育雌性的第二種方法的實例是Driscoll(1972)的XYZ系統(tǒng)。二十年前他提議向雄性不育母本Z系(隱性突變體等位基因ms-B1-c純合)加入附加的單條(在Y系中)或一對(在X系中)異源染色體，所述染色體攜帶顯性Ms近同源等位基因，該等位基因依次賦予X系和Y系育性。該異源染色體不與其小麥部分同源的染色體配對，其在Y系中以極低的頻率通過花粉傳遞，因此受粉的雄性不育母系產(chǎn)生種子，絕大部分的種子發(fā)芽成為雄性不育植株。因為該保持系(Y)不是純化等位基因系，通過用二體異源附加系(X)授粉雄性不育母系(Z)產(chǎn)生該保持系。該系統(tǒng)有二個主要缺點為特征通過保持系的花粉發(fā)生的異源染色體的一些傳遞向雄性不育母系的新世代導(dǎo)入了雄性能育性；X系中發(fā)生的附加衰變降低了其純度。這些可能是該系統(tǒng)從未實際(商業(yè))應(yīng)用的原因。
最近，Driscoll(1985)提議修飾上述產(chǎn)生雜交小麥的XYZ系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，自交Y系取代了Y系以保持和繁殖雄性不育Z系。該修飾取消了對起先用于產(chǎn)生大量Y系植株所需的X系的需要。而且，新提議的Y系攜帶異源等臂染色體，以使該補償性雄性能育性近同源等位基因為二份。雖然該修飾的XYZ系統(tǒng)比原XYZ系統(tǒng)需要較少的各種親本植株之間的雜交以保持和繁殖雄性不育雌株，但是在該修飾的XYZ系統(tǒng)中亦存在如上述表征原XYZ系統(tǒng)的缺點，限制了其在商業(yè)生產(chǎn)雜種種子的應(yīng)用。
從上述來看，好象雜種生產(chǎn)的傳統(tǒng)方法不夠有效，需要新的方法。在國際PCT專利申請PCT/AU91/00319(WO 92/01366)和PCT/AU93/000017(WO93/13649)中已描述了一種基于上述Driscoll(1972)XYZ系統(tǒng)的改進的這種新方法，它涉及諸如普通小麥的雜交谷類作物的生產(chǎn)。在這些出版物中有用于產(chǎn)生雜種的植物系，其具有攜帶對雄性不育突變等位基因近同源等位的顯性雄性能育性基因和賦予子代種子著色的顏色標(biāo)記基因的異源染色體或染色體節(jié)。通過用顏色分選物理分離子代種子完成雄性不育(母本)親本系的保持。這種遺傳改變了的普通小麥植株含有具有二倍體小麥一粒小麥的顯性正常雄性能育性等位基因的修飾染色體，做為附加或替換小麥4B染色體中的一條染色體。該修飾的染色體帶有攜帶Ms-Am1等位基因的一粒小麥染色體4Am的短臂(4AmS)和具有帶有著色等位基因(C)的或者一粒小麥染色體4Am的長臂(4AmL)或者長穗鵝冠草染色體4E的長臂(4EL)的近端節(jié)以及小麥染色體臂4BL的遠端節(jié)的第二條臂。該修飾的染色體的一部分與攜帶所述隱性雄性不育等位基因的小麥染色體4B同源，其一部分與攜帶所述隱性雄性不育等位基因的小麥染色體4B部分同源。該同源部分即4BL的遠端區(qū)可以與正常小麥4BL配對，由此保證減數(shù)分裂時的規(guī)則的分離。標(biāo)記該攜帶正常顯性雄性能育性等位基因Ms-Am1的染色體的另一種可能性是利用賦予子代植株植株高度增加的基因。
然而就有效保持親本系而言，上述雜種生產(chǎn)系統(tǒng)有一些缺點。第一，由保持系對雌株授粉產(chǎn)生大量的具有重組異源/4BL染色體的種子，它們將發(fā)育成為雄性可育植株。第二，雄性不育母本的保持涉及復(fù)雜的基于標(biāo)記基因的子代選擇程序。第三，用于母(雄性不育)本系的保持系亦是遺傳不穩(wěn)定系，因為它攜帶20對正常普通小麥染色體、一條攜帶雄性不育性(ms-B1-b)突變等位基因(已知為‘Probus’)(Wilson和Driscoll,1983)的4B染色體和一條具有正常雄性能育性Ms-Am1等位基因和種子著色等位基因的重組異源組4/4BL染色體。因此，所述保持系是雄性可育的，并在自交時將產(chǎn)生對該修飾的染色體純合或雜合性的育性植株。因此不可能基于著色基因區(qū)分這二種基因型，基于高度基因區(qū)分也非常困難。因此，該保持系的繁殖和其用于提供雄性不育母系工作量很大，不適于大規(guī)模商業(yè)應(yīng)用。
為克服選擇攜帶雄性能育性Ms等位基因的異源染色體的機械或其它間接方法的困難，日本Kyoto的Kyto大學(xué)T.R.Endo建議(由Tsujimoto和Tsunewaki 1983引用)使用殺配子基因Gc1，并將其連接至雄性不育等位基因ms。該源自Ae.Speltoides的殺配子等位基因使不攜帶它(但攜帶天然隱性gc1等位基因)的配子敗育。按照Endo的建議，該雄性不育母系對緊密連鎖的ms和Gc1均為純合的，將對所述母系是等基因的、但具有Ms和gc1等位基因的雄性可育系(保持系)用于對所述母系授粉，以產(chǎn)生雙雜合子msMsGc1gc1。由于攜帶gc1的配子敗育，這種自交系的所有子代將是純合子msmsGc1Gc1并與所述母系相同。然而，按照他們的建議，亦應(yīng)培育該雜種生產(chǎn)系統(tǒng)中的雄系(R系)使其含有Gc1等位基因，否則F1雜種的育性將降低。另外，Gc1引起雌配子以及雄配子的敗育，因此每年需要雜交(母系和保持系之間)和自交(雙雜合子)以更新母本種子儲備。這在時間和成本方面是缺點。Endo建議的另一個缺點源自這一事實，即所述雄性不育母本含有攜帶源自斯卑爾托山羊草(Ae.Speltoides)的Gc1等位基因的異源染色體節(jié)。該節(jié)亦可能攜帶對所述雌株特性有負面影響的等位基因，增加了雜種種子生產(chǎn)的成本，或者甚至影響雜種的產(chǎn)量。
鑒于普通小麥雜種生產(chǎn)的重要性，應(yīng)注意對實驗性雜種特性的不同報道表明最好的小麥雜種產(chǎn)量比主要的最好栽培品種提高多達30％(Wilson和Driscoll,1983)。另外，眾所周知與常規(guī)栽培品種相比，許多雜種表現(xiàn)出品質(zhì)改良和對環(huán)境和生物學(xué)壓力的耐受性更大。一般假定，雜交小麥超出純化等位基因栽培品種的相對較小的優(yōu)勢是連續(xù)選擇純合種質(zhì)高性能的結(jié)果。因此預(yù)期選擇雜合性種質(zhì)的改進性能可能導(dǎo)致在短時間內(nèi)顯著增加產(chǎn)量。
由于雜種基于目前的栽培品種，這些栽培品種正通過常規(guī)育種方法持續(xù)地改進，因此能將每個新開發(fā)或新公布的栽培品種轉(zhuǎn)化成為潛在的母系是有利的。不僅調(diào)查新公布的植物材料的結(jié)合能力是必要的，而且更重要的是當(dāng)雜種與新公布的純系之間保持顯著差距時才保持其市場的商業(yè)化生產(chǎn)新雜種。
定義在說明書和權(quán)利要求中使用了以下術(shù)語和縮寫普通小麥=面包小麥Triticum aesticm var.aestivum，是具有三個基因組ABD的異源六倍體物種(2n=42)。
硬粒小麥=制通心粉小麥，Triticum turgidum var.durum,是具有二個基因組AB的異源四倍體物種(2n=28)。
一粒小麥=包含野生(var.boeoticum)和栽培(var.一粒)分類群的二倍體物種(2n=14)，與硬粒小麥和普通小麥的A基因組二倍體供體緊密相關(guān)，具有染色體4Am與硬粒小麥和普通小麥的染色體4A以及其它第4組染色體部分同源(部分地同源)的基因組Am。
高大山羊草(Aegilops longissima)和Aegilops searsii=二倍體物種(2n=14)，分別與具有基因組Sl和Ss的硬粒小麥和普通小麥的B基因組供體緊密相關(guān)，其染色體與小麥的染色體部分同源(部分地同源)。
長穗鵝冠草(Agropyron elongatum)=包括二倍體(2n=14)、四倍體(2n=28)和十倍體(2n=70)分類群的復(fù)合物種，與硬粒小麥和普通小麥相關(guān)，具有其染色體與硬粒小麥和普通小麥染色體部分同源的E基因組(多倍體是同源多倍體)。
4BS=普通小麥和硬粒小麥染色體4B(原4A)的短臂。
6BL=普通小麥和硬粒小麥染色體6B的長臂。
4AmS和4AmL=分別為一粒小麥染色體4Am的短臂和長臂。
4EL=長穗鵝冠草染色體4E的長臂。
4SsS=Aegilops searsii染色體4Ss的短臂。
4S1S=高大山羊草染色體4Sl的短臂。
6SsL=Aegilops searsii染色體4Ss的長臂。
6SlL=高大山羊草染色體6Sl的長臂。
Ms=負責(zé)小麥雄性能育性的顯性等位基因。
Ms-B1=位于4BS上的硬粒小麥和普通小麥雄性能育性的顯性等位基因。
ms=賦予雄性不育的Ms的隱性突變等位基因。
ms-B1=當(dāng)以純合狀態(tài)存在時賦予硬粒小麥和普通小麥雄性不育的Ms-B1的隱性突變體等位基因。
ms-B1-a=ms1a，它是‘Pugsley’突變體的ms-B1等位基因。
ms-B1-b=ms1b，它是‘Probus’突變體的ms-B1等位基因。
ms-B1-c=ms1c，它是‘Cornerstone’突變體的ms-B1等位基因。
Ms-Ss1=位于4SsS上的雄性能育性的顯性等位基因，與Ms-B1近同源等位。
Ms-Sl1=位于4SlS上的雄性能育性的顯性等位基因，與Ms-B1近同源等位。
Ms-Am1=位于4AmS上的雄性能育性的顯性等位基因，與Ms-B1近同源等位。
Ki-B1=普通小麥6BL上的顯性雄配子殺傷等位基因，誘導(dǎo)殺傷攜帶ki-B1-a或ki-Sl1-a的花粉。
ki-B1-a=普通小麥6BL上的隱性雄配子殺傷等位基因；攜帶它的花粉在具有Ki-B1的植株中被殺死。
ki-B1-n=普通小麥6BL上的中性雄配子殺傷等位基因；攜帶它的花粉在具有Ki-B1的植株中不會被殺死，它亦不誘導(dǎo)殺傷攜帶ki-B1-a或ki-Sl1-a的花粉。
ki-Sl1-a=高大山羊草6SlL上的雄配子殺傷等位基因；攜帶它的花粉在具有Ki-B1的植株中被殺傷。
Rht1和Rht2=分別位于染色體臂4BS和4DS上的隱性或部分隱性等位基因，誘導(dǎo)植株高度降低。
rht=決定正常植株高度(高植株)的顯性或半顯性等位基因。
rht-Ss1=位于4Ss上決定正常植株高度(高植株)的顯性或半顯性等位基因。
rht-Sl1=位于4SsS上決定正常植株高度(高植株)的顯性或半顯性等位基因。
rht-Am1=位于4AmS上決定正常植株高度(高植株)的顯性或半顯性等位基因。
Su-B1=六倍體和四倍體小麥6BL上的等位基因，它賦予對除草劑綠麥隆[3-(3-氯-對-甲苯基)-1,1-二甲脲]和其它苯脲除草劑{例如，甲氧隆[3-(3-氯-4-甲氧基苯基(metoxyphenylyl))-1,1-二甲脲])的抗性。
su-B1=在六倍體和四倍體小麥6BL上發(fā)現(xiàn)的Su-B1的隱性等位基因；攜帶它的植株對綠麥隆敏感。
su-Sl1=在高大山羊草6SlL上發(fā)現(xiàn)的與Su-B1近同源等位的隱性等位基因；攜帶它的植株對綠麥隆敏感。
Su-Ss1=在Aegilops searsii 6SsL上發(fā)現(xiàn)的與Su-B1近同源等位的顯性等位基因，賦予對綠麥隆抗性。
Ba=決定3n胚乳糊粉層藍色的顯性等位基因。
Ba-Am1=4AmL上藍色糊粉顏色的顯性等位基因。
Ba-E1=4EL上藍色糊粉顏色的顯性等位基因。
Ph1=普通小麥和硬粒小麥染色體5B長臂上抑制部分同源染色體配對的顯性等位基因。
ph1b=允許部分同源配對的隱性突變等位基因。
cv.=栽培品種。
EC=由源自二條或多條不同的異源染色體的節(jié)組成的工程化染色體，其攜帶Ms等位基因、ki等位基因和選擇標(biāo)記，通過該標(biāo)記可以選擇具有該染色體的植株。
EC-H=攜帶做為選擇標(biāo)記的rht等位基因(植株高度)的工程化染色體。
EC-H1=由4SsS/6SlL組成、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a的工程化染色體(圖2a)。
EC-HR=攜帶做為選擇標(biāo)記的rht等位基因(植株高度)和Su等位基因(對除草劑綠麥隆抗性)的工程化染色體。
EC-HR1=由4SsS/6SlL組成、攜帶MS-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a的工程化染色體(圖2b)。
REC=由源自二條或多條不同的異源染色體的節(jié)和天然染色體臂6BL的遠端節(jié)組成的重組工程化染色體，其攜帶Ms等位基因、ki-Sl1-a等位基因和選擇標(biāo)記，通過該標(biāo)記可以選擇具有該染色體的植株。
REC-H=攜帶做為選擇標(biāo)記的rht等位基因的重組工程化染色體。
REC-H1=由4SsS/6SlL/6BL組成、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a的重組工程化染色體(圖2c)。
REC-HR=攜帶做為選擇標(biāo)記的rht等位基因和Su等位基因的重組工程化染色體。
REC-HR1=由4SsS/6SlL/6BL組成、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a的重組工程化染色體(圖2d)。
IEC=由源自二條或多條不同的異源染色體的節(jié)組成的改進工程化染色體，除攜帶Ms等位基因、ki等位基因和選擇標(biāo)記等位基因之外，還攜帶種子標(biāo)記，通過該標(biāo)記可以從不具有該染色體的種子分離具有該染色體的種子。
IEC-HC=攜帶做為選擇標(biāo)記的rht(植株高度)和Ba(種子顏色)的改進工程化染色體。
IEC-HC1=由4SsS/4EL/6SlL組成、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a的改進工程化染色體(圖3a)。
IEC-HC2=由4SsS/4AmL/6SlL組成、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a的改進工程化染色體(圖4a)。
IEC-HC3=由4AmS-4AmL/6SlL組成、攜帶Ms-4m1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a的改進工程化染色體(圖5a)。
IREC=由源自二條或多條不同的異源染色體的節(jié)和天然染色體臂6BL的遠端節(jié)組成的改進重組工程化染色體，除攜帶Ms等位基因、ki等位基因和選擇標(biāo)記等位基因之外，還攜帶種子標(biāo)記，通過該標(biāo)記可以從不具有該染色體的種子分離具有該染色體的種子。
IREC-HC=攜帶做為選擇標(biāo)記的rht和Ba的改進重組工程化染色體。
IREC-HC1=由4SsS/4EL/6SlL/6BL組成、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a的改進重組工程化染色體(圖3b)。
IREC-HC2=由4SsS/4AmL/6SlL/6BL組成、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a的改進重組工程化染色體(圖4b)。
IREC-HC3=由4AmS-4AmL/6SlL/6BL組成、攜帶Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a的改進重組工程化染色體(圖5b)。
保持系=與雄性不育母系等基因但含有一條附加的EC類型的工程化染色體的雄性可育系。
重組保持系=與雄性不育母系等基因、但染色體6B是單體并且含有做為單體置換的REC類型的一條工程化染色體的雄性可育系。
改進保持系=與雄性不育母系等基因但含有一條附加的IEC類型工程化染色體的雄性可育系。
改進重組保持系=與雄性不育母系等基因、但染色體6B是單體并且含有做為單體置換的IREC類型的一條工程化染色體的雄性可育系。
發(fā)明概述為克服先有技術(shù)的上述缺點，本發(fā)明的目的是提供保持普通小麥或硬粒小麥栽培品種基因性雄性不育母本系的方法，該方法提供穩(wěn)定保持所述雄性不育母本系的簡單方法。
本發(fā)明的再一目的是提供用于上述方法的保持系，該保持系容易、快速和穩(wěn)定地繁殖。
本發(fā)明的又一目的是提供產(chǎn)生所述保持系的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供將任何所需普通小麥或硬粒小麥栽培品種轉(zhuǎn)化成為雄性不育母系和成為保持系的新方法。
本發(fā)明使得普通小麥和硬粒小麥雜種的商業(yè)生產(chǎn)成為可能。在一個方面，本發(fā)明提供保持隱性雄性不育突變(ms)等位基因純合和顯性雄配子殺傷(Ki)等位基因純合的雄性不育母本系(A系)的新方法。保持系(B系)(


圖1)與所述母系等基因，并且還有一條攜帶與隱性雄配子殺傷等位基因(ki)連鎖的顯性雄性能育性等位基因(Ms)和至少一個選擇標(biāo)記等位基因的異源工程化染色體。含有所述工程化染色體(Ms和ki等位基因)的保持系花粉粒被殺傷。幾種類型的所述工程化染色體攜帶rht(影響植株高度)做為選擇標(biāo)記，其它的則都攜帶rht和Su1(綠麥隆抗性)等位基因做為二個選擇標(biāo)記，每個臂攜帶一個，而再有些類型攜帶rht和Ba(誘導(dǎo)藍色種子顏色)做為二個選擇標(biāo)記，每個臂攜帶一個。
因此，按照本發(fā)明已開發(fā)了一個簡單系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)保持雄性不育母本系(A系)，方法是或者通過用雄性可育保持系(B系)對該母本系授粉，產(chǎn)生的所有子代都是雄性不育雌植株(
圖1a)，或者最好根據(jù)不同的著色，從保持系的自交子代分選出那些將發(fā)育成為雄性不育母系的種子與那些將發(fā)育成為雄性可育保持系的種子(
圖1b)。類似地，通過自花授粉可以容易地保持該保持系，產(chǎn)生混合種子，其中約20％攜帶該工程化染色體并因此是雄性可育的，而約80％缺乏該染色體并因此是雄性不育的。在那些僅攜帶rht等位基因做為選擇標(biāo)記的保持系中，可以首先收獲含有該工程化染色體的較高的植株。該選擇性收獲便于在包括雄性不育的自交保持系的子代中每年保持恒定比例的約20％雄性可育保持系植株。在那些攜帶rht和Su1等位基因做為選擇標(biāo)記的保持系中，可以用除草劑綠麥隆殺死缺乏該工程化染色體的植株。這確保了每年在播種自交保持系的子代的小區(qū)中僅生長雄性可育保持系植株。另一方面，在攜帶Ba等位基因做為選擇標(biāo)記的改進保持系中，用種子清選機，可以從紅/白色種子分離藍色種子，藍色種子生長時將發(fā)育成為雄性可育植株，紅/白色種子生長時將發(fā)育成為雄性不育植株。這便于每年種植100％雄性可育植株的保持系。
按照本發(fā)明的一個方面，工程化染色體EC-H和EC-HR是源自二條異源染色體的易位染色體。它們的一條臂攜帶Ms和rht等位基因，另一條臂在EC-H中攜帶ki等位基因、在EC-HR中攜帶Su-1和ki等位基因。由于所述異源臂通常不與它們的小麥部分同源染色體配對，EC-H上的三個等位基因和EC-HR上的四個等位基因是連鎖的，互相之間不分離。EC-H(圖2a)或EC-HR(圖2b)以單份加入保持系，即該保持系是單體附加系。該保持系的有功能的花粉粒不含該工程化染色體。因此，雄性不育母系與該保持系之間雜交產(chǎn)生的所有子代都是雄性不育的，而源自該保持系自花授粉的子代的基因型是混合的，其中約20％是雄性可育的，約80％是雄性不育的。
普通小麥中EC的構(gòu)建是基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，即高大山羊草6號染色體長臂(6SlL)上的隱性雄配子殺傷ki-Sl1-a等位基因在以單份存在于攜帶普通小麥染色體6BL上的顯性雄配子殺傷Ki-B1等位基因的植株中(如在單體異源附加系中)時，不通過花粉粒(即，通過雄配子)傳遞。因此，構(gòu)建攜帶Ae.searsii的雄性能育性Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因以及高大山羊草的雄配子殺傷ki-Sl1-a等位基因的EC-H1是可行的，通過在附加4Ss和6Sl雙單體的普通小麥中發(fā)生的染色體4Ss和6Sl的同時著絲粒錯分裂、然后4SsS和6SlL著絲粒融合而產(chǎn)生它(圖7a)。所述EC-H1具有Ae.searsii(4SsS)4號染色體短臂和高大山羊草(6SlL)6號染色體長臂，Ae.searsii(4SsS)4號染色體短臂攜帶已證實賦予ms-B1-c純合的六倍體基因型雄性能育性的Ms-Ss1等位基因和使得植株較高的rht-Ss1等位基因，高大山羊草(6SlL)6號染色體長臂攜帶使得攜帶其的花粉粒在存在Ki-B1等位基因時易受殺傷的隱性ki-Sl1-a等位基因。因為在異源工程化染色體和其小麥部分同源臂之間通常不發(fā)生配對和重組，Ms-Sus1、rht-Ss1和ki-Sl1-a等位基因是連鎖的，因此亦防止了通過花粉粒傳遞Ms-Ss1等位基因。這使得可以生產(chǎn)6BL上的Ki-B1等位基因純合、位于染色體4B短臂上的已知隱性雄性不育突變等位基因之一(例如ms-B1-c)純合的保持系，但其雄性不育不表達，即由于存在攜帶Ms-Ss1等位基因的工程化染色體，該保持系為雄性可育。用該保持系對雄性不育母系授粉僅產(chǎn)生雄性不育的植株，而該保持系自交產(chǎn)生約20％雄性可育和80％雄性不育植株。
本發(fā)明的另一方面是增加自交保持系子代中保持系雄性可育基因型的比例(從20％增至50％)。雖然20％的比例足以增加保持系自己的種子，它使得母系種子的生產(chǎn)成本高，因為給定面積的母本需要較大面積的保持系以確保由該保持系經(jīng)濟有效地授精。因此增加保持系自交子代中保持系的比例有極大的優(yōu)越性。通過修飾EC-H即構(gòu)建重組工程化染色體(本文命名為REC-H)可以提高至約50％。以下述方式(圖7b)在普通小麥中產(chǎn)生命名為REC-H1的含有源自Ae.searsii的Ms等位基因的REC-H(圖2b)將小麥染色體臂6BL的遠端節(jié)易位至6SlL臂，其中易位斷點位于ki-Sl1-a等位基因遠端，使得它能與6BL染色體配對。易位產(chǎn)生于缺乏Ph1的雙單體條件(即在基因型ph1bph1b中)的部分同源配對，EC-H1(4SsS/6SlL)和6B可以配對并重組，導(dǎo)致產(chǎn)生REC-H1，即4SsS/6SlL/6BL。在Ph1純合、正常6B單體并具有單份REC-H1的系中，這二條染色體幾乎在每個性母細胞中在同源區(qū)(6BL的遠端區(qū))配對并分離至相對的極，導(dǎo)致REC-H1包含于一半的配子中。
再則，本發(fā)明的另一方面是在含有EC-H1或REC-H1的自交保持系子代中分別保持以下比例恒定1份雄性可育4份雄性不育或1份雄性可育1份雄性不育。在通過自花授粉繁殖所述保持系時，自交子代中雄性不育植株的比例隨世代增加，因為雄性不育植株不僅在雄性可育子代中得到，而且由混合生長的雄性可育姊妹株授粉的雄性不育植株的所有子代都是雄性不育的。因此，混合中的雄性可育植株(保持系)的比例降低至花粉團不足以在所有的母系生產(chǎn)小區(qū)中對所有的雄性不育雌花授粉的程度。因此很重要的是保持每代中雄性不育與雄性可育植株的原始比例恒定。這可以通過在每代中從保持系自交子代中對雄性不育植株選株達到。該步驟工作量很大，增加了母本種子的生產(chǎn)成本。因此最好利用rht等位基因在EC-H1或REC-H1的4Ss短臂上的存在。該等位基因永久性地與Ms-Ss1等位基因連鎖，它影響植株高度，其方式是攜帶它的植株(即保持系)比缺乏它的植株(雄性不育雌植株)高(6-8cm)。這個高度差異便于在此混合植株中選擇性收獲保持系。
保持自交保持系子代中雄性可育與雄性不育植株原始比例恒定的另一優(yōu)選方法是通過進一步改進EC或REC來達到，其基于將再一選擇標(biāo)記例如除草劑抗性、抗病性或藍色種子顏色加入所述保持系的這二條工程化染色體中的任一條。將綠麥隆抗性等位基因Su-Ss1加入EC中(使之為EC-HR)(圖2b)或REC中(使之為REC-HR)(圖2d)便于用該除草劑在每代中選擇性地僅殺死雄性不育植株。通過以下步驟產(chǎn)生EC-HR(圖8a)用攜帶Su-Ss1的Ae searsii品系授粉ms-B1、su-B1和Ki-B1純合并且攜帶EC-H的栽培品種中國春(CS)保持系植株，將F1做為雌株與CS回交。在產(chǎn)生的回交子代中選擇除草劑抗性植株，然后自交產(chǎn)生BC1F2子代。通過染色體計數(shù)(選擇2n=43)和通過綠麥隆抗性從BC1F2選擇保持系植株。類似地，將抗病性等位基因加入EC或REC，使得可以用病原體感染田地。僅雄性不育植株敏感并產(chǎn)生較少的種子，這些種子皺縮并被聯(lián)合收割機吹走。將長穗鵝冠草或一粒小麥或任何其它禾本科物種的藍糊粉(Ba)等位基因做為選擇標(biāo)記加入EC或REC，構(gòu)成了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，以產(chǎn)生改進工程化染色體(IEC)或改進重組工程化染色體(IREC)，所述染色體可能含有一粒小麥染色體4Am的Ms-Am1等位基因、長穗鵝冠草染色體4E的Ba-E1等位基因和高大山羊草染色體6Sl的ki-B1-a等位基因，由此便于生長100％雄性可育植株的保持系。所述Ba等位基因決定3n胚乳糊粉層中的顏色(由于產(chǎn)生花色素苷)。Ba等位基因的表達為劑量依賴型由雌配子貢獻給3n胚乳的二份Ba等位基因決定藍色種子顏色，該顏色與小麥種子的典型紅色/白色有區(qū)別。所述種子顏色標(biāo)記永久性地與Ms等位基因連鎖，并且因此區(qū)分生長時發(fā)育成為雄性可育植株(保持系)的藍色種子和生長時發(fā)育成為雄性不育植株的紅色/白色種子。可以通過分選設(shè)備機械分離這二種類型的種子。
EC和REC中的上述修飾命名為IEC-HC(圖3a、4a和5a)IREC-HC(圖3b、4b和5b)，并以以下方式產(chǎn)生以二個步驟產(chǎn)生攜帶Ae.searsii的Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因、長穗鵝冠草的Ba-E1等位基因和高大山羊草的ki-Sl1-a等位基因的IEC-HC1(圖9a-d)首先，由于在附加4Ss和4EL雙單體的普通小麥發(fā)生染色體4Ss和4EL的同時著絲粒錯分裂，然后4SsS和4EL著絲粒融合，產(chǎn)生易位染色體4SsS/4EL；第二步涉及用熱中子輻射4SsS/4EL和4SsS/6SlL雙單體附加的種子，并在子代中選擇所需易位4SsS/4EL/6SlL。
通過以下步驟產(chǎn)生攜帶Ae.searsii的Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因、一粒小麥Ba-Am1等位基因和高大山羊草的Ki-Sl1-a等位基因的IEC-HC2(
圖10)首先，由于在附加4Ss和4Am雙單體(或在4Ss單體附加和4BS/4AmL單體易位置換)的普通小麥中發(fā)生染色體4Ss和4Am的同時著絲粒錯分裂，然后4SsS和4AmL著絲粒融合，產(chǎn)生易位染色體4SsS/4AmL；第二步涉及輻射4SsS/4AmL和4SsS/6SlL雙單體附加，并在子代中選擇所需易位4SsS/4AmL/6SlL。
通過輻射在附加4Am和6Sl雙單體的普通小麥，產(chǎn)生攜帶一粒小麥Ms-Am1、rht-Am1和Ba-Am1等位基因和大山羊草的ki-Sl1-a的IEC-HC3，并在子代中選擇所需易位(
圖11)。IEC-HC3具有一粒小麥4號染色體的短臂和長臂的近端區(qū)(攜帶已證實賦予ms-B1-c純合的六倍體基因型雄性能育性的Ms-Am1等位基因、對高植株負責(zé)的rht-Am1等位基因和決定糊粉藍色著色的Ba-Am1等位基因)和攜帶隱性ki-Sl1-a等位基因的高大山羊草(6SlL)的6號染色體長臂的遠端部分。
產(chǎn)生各種REC和IREC(圖2b、2d、3b、4b和5b)以增加自交保持系自交子代中保持系雄性可育基因型的比例(從20％增至50％)，并且防止由于所述工程化染色體著絲粒錯分裂產(chǎn)生的偶然性著絲粒斷裂。通過誘導(dǎo)完成產(chǎn)生這些重組工程化染色體，即借助誘導(dǎo)的部分同源配對誘導(dǎo)EC-H1、EC-HR1、IEC-HC1、IEC-HC2或IEC-HC3中的任何一個與6B之間的重組，其中6BL的遠端節(jié)易位至6SlL臂(斷點距ki-Sl1-a等位基因遠端)(圖7b和12)。該易位使得REC和IREC可以在幾乎每個性母細胞中與Ph1純合的、6B和REC或IREC之一為單體的普通小麥品系中的6BL配對，并分離至相對的極，導(dǎo)致在一半配子中包含REC或IREC。
由于著絲粒錯分裂造成的所述工程化染色體的不合需要的著絲粒斷裂，在EC-H1中將Ms-Ss1和rht-Ss1與ki-Ss1-a分離，在EC-HR1中將Ms-Ss1和rht-Ss1與Su-Ss1和ki-Sl1-a分離，促進Ms-Ss1等位基因通過雄配子傳遞。這在用所述保持系對雄性不育母系授粉時產(chǎn)生一些雄性可育后代。這些攜帶rht等位基因的植株比雄性不育植株高，可以被選株。另外，因為著絲粒錯分裂主要在未配對染色體(單價體)中發(fā)生，所以使用在幾乎每個性母細胞中與天然6B配對的REC或IREC防止了這種不合需要的著絲粒斷裂。
本發(fā)明再提供普通小麥或硬粒小麥的雄性可育保持系，以保持用于生產(chǎn)雜交小麥的雄性不育母本系，以及提供其生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的再一方面涉及從攜帶或者IEC-HC(
圖15a)或者IREC-HC(
圖15b)的自交保持系子代中直接選擇雄性不育母本的種子。具有IEC-HC的保持系產(chǎn)生的種子約80％不是藍色，缺乏該IEC-HC并因此生長時發(fā)育成為雄性不育植株，約20％的種子是藍色，攜帶該IEC-HC并在生長時發(fā)育成為雄性可育植株。通過顏色分選設(shè)備分選所述保持系的自交種子，將從保持系的那些種子(藍色)分離母本種子(紅色/白色)。通過該優(yōu)選的方法，直接從所述保持系自交得到雄性不育母系的種子；不需要交替種植保持系和母系，顯著降低了母系生產(chǎn)成本。
在另一方面，本發(fā)明提供將普通小麥或硬粒小麥的任何所需栽培品種轉(zhuǎn)化成為雄性不育母本系和所述母系的雄性可育保持系的方法。
在再一方面，本發(fā)明涉及普通小麥或硬粒小麥雜種植物系的生產(chǎn)方法，其中將雄性不育母本系與同一物種的在本質(zhì)上對Ms-B1等位基因純合的雄性可育的任何栽培品種(R系)雜交，產(chǎn)生均為可育的和雜合性的F1雜種子代(Ms-B1ms-B1)。
附圖簡要說明
圖1a-1c描繪保持雄性不育母本系(A系)的一般性圖解，即通過或者(1a)用保持系(B系)授粉；(1b)在自交保持系分離子代中選擇它；或者(1c)將1a和1b中描述的方法結(jié)合；并用雄性系(R系)對A系授粉產(chǎn)生雜種種子(F1)。
圖2a-2d描繪工程化染色體EC-H1(2a)、EC-HR1(2b)和重組工程化染色體REC-H1(2c)和REC-HR1(2d)的圖解圖。
圖3a-3b描繪改進工程化染色體IEC-HC1(3a)和改進重組工程化染色體IREC-HC1(3b)的圖解圖。
圖4a-4b描繪改進工程化染色體IEC-HC2(4a)和改進重組工程化染色體IREC-HC2(4b)的圖解圖。
圖5a-5b描繪改進工程化染色體IEC-HC3(5a)和改進重組工程化染色體IREC-HC3(5b)的圖解圖。
圖6描繪將Cornerstone突變體隱性雄性不育性等位基因ms-B1-c轉(zhuǎn)移入普通小麥栽培品種中國春(CS)4Ss單體附加系的圖解程序。
圖7a-7b描繪在普通小麥栽培品種中國春中產(chǎn)生具有攜帶Ae.searsii 4SsS的Ms-Ss1和rht-Ss1和高大山羊草6SlL的ki-Sl1-a的工程化染色體EC-H1(7a)和重組工程化染色體REC-H1(7b)的保持系以及雄性不育母系的圖解程序。將EC-H1做為二體6B植株中單體附加而制備，EC-H1因此對Ki-Bl亦是純合的；將REC-H1做為單體6B植株中單體置換而制備，因此REC-H1對Ki-B1是半合子的。
圖8a-8b描繪產(chǎn)生具有攜帶Ae.searsii 4Ss的Ms-Ss1和rht-Ss1、Ae.searsii 6SsL的Su-Ss1和高大山羊草6SlL的ki-Sl1-a的工程化染色體EC-HR1(8a)和重組工程化染色體REC-HR1(8b)的保持系的圖解程序。將EC-HR1做為二體6B植株中單體附加而制備，EC-H1因此對Ki-B1亦是純合的；將REC-HR1做為二體6B植株中單體置換而制備，因此REC-HR1對Ki-B1是半合子的。
圖9a-9d描繪在普通小麥栽培品種中國春中產(chǎn)生具有攜帶Ae.searsii 4SsS的Ms-Ss1和rht-Ss1、長穗鵝冠草4EL的Ba-E1和高大山羊草6SlL的ki-S11-a的改進工程化染色體IEC-HC1的保持系以及雄性不育母系的三個圖解程序。在EC-H1和4E染色體雙單體附加中誘導(dǎo)雙斷裂和重接(9a)；在EC-H1與已經(jīng)輻射易位的染色體4SsS/4EL之間誘導(dǎo)單斷裂和重接(9b)；在EC-H1與通過錯分裂和著絲粒融合得到的易位染色體4SsS/4EL之間誘導(dǎo)單斷裂和重接(9c)，圖9d顯示了圖9a、圖9b和圖9c的相互關(guān)系。
圖10描繪在普通小麥栽培品種中國春中產(chǎn)生具有攜帶Ae.searsii 4SsS的Ms-Ss1和rht-Ss1、一粒小麥4AmL的Ba-Am1和高大山羊草6SlL的ki-Sl1-a的改進工程化染色體IEC-HC2的保持系以及雄性不育母系的圖解程序。
圖11描繪在普通小麥栽培品種中國春中產(chǎn)生具有攜帶一粒小麥4AmS的Ms-Am1和rht-Am1、一粒小麥4AmL的Ba-Am1和高大山羊草6SlL的ki-Sl1-a的改進工程化染色體IEC-HC3的保持系以及雄性不育母系的圖解程序。
圖12描繪在普通小麥栽培品種中國春中產(chǎn)生具有攜帶Ae.searsii 4SsS的Ms-Ss1和rht-Ss1和高大山羊草6SlL的ki-Sl1-a的改進重組工程化染色體IREC-HC1的保持系以及雄性不育母系的圖解程序。
圖13a-13b描繪基于基因性雄性不育的普通小麥和硬粒小麥的按照
圖1a的圖解，其中本文將A系命名為cv.“1”，其對隱性雄性不育等位基因ms-B1-c和顯性雄配子殺傷等位基因Ki-B1是純合的；(13a)同一cv.“1”的B系與A系等基因，但是還具有攜帶4SsS上顯性雄性能育性等位基因Ms-Ss1和顯性rht等位基因和6SlL上隱性雄配子殺傷等位基因ki-Sl1的工程化染色體EC-H1(4SsS/6SlL)，本文將R系命名為cv.“2”，其對野生型雄性能育性等位基因Ms-B1和隱性雄配子殺傷等位基因ki-B1-a或ki-B1-n之一純合；(13b)與(13a)相同，但是B系具有重組工程化染色體REC-H1而不是EC-H1，并只有單份攜帶Ki-B1的染色體6B。
圖14a-14b描繪基于基因性雄性不育的普通小麥和硬粒小麥的按照
圖1a的圖解，其中本文將A系命名為cv.“1”，其對隱性雄性不育等位基因ms-B1-c、隱性除草劑敏感性等位基因su-B1和顯性雄配子殺傷等位基因Ki-B1純合；(14a)同一cv.“1”的B系與A系等基因，但是還具有攜帶4SsS上顯性雄性能育性等位基因Ms-Ss1和顯性rht等位基因和6SlL上顯性Su-Ss1等位基因和隱性雄配子殺傷等位基因ki-Sl1的工程化染色體EC-HR1(4SsS/6SlL)，本文將R系命名為cv.“2”，其對野生型雄性能育性等位基因Ms-B1和隱性雄配子殺傷等位基因ki-B1-a或ki-B1-n之一純合；(14b)與(14a)相同，但是B系具有重組工程化染色體REC-HR1而不是EC-HR1，并只有單份攜帶Ki-B1的染色體6B。
圖15a-15b描繪基于基因性雄性不育的普通小麥和硬粒小麥的按照
圖1b和1c的替代性圖解，其中本文將A系命名為cv.“1”，其對隱性雄性不育等位基因ms-B1-c和顯性雄配子殺傷等位基因Ki-B1純合；(15a)同一cv.“1”的B系與A系等基因，但是還具有攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1、ki-Sl1-a等位基因的4SsS/4EL/6SlL的改進工程化染色體IEC-HC1，本文將R系命名為cv.“2”，其對野生型雄性能育性等位基因Ms-B1和對隱性雄配子殺傷等位基因ki-B1-a或ki-B1-n之一純合；(15b)與(15a)相同，但是B系具有改進重組工程化染色體IREC-HC1而不是IEC-HC1，并只有單份攜帶Ki-B1的染色體6B。
圖16a-16b描繪圖解程序，即將目的栽培品種(cv.“新”)轉(zhuǎn)化成為攜帶EC-H的雄性不育系和保持系(16a)；和將目的栽培品種(cv.“新”)轉(zhuǎn)化成為攜帶REC-H的雄性不育系和重組保持系(16b)。
圖17a-17b描繪圖解程序，即將目的栽培品種(cv.“新”)轉(zhuǎn)化成為攜帶EC-HR的雄性不育系和保持系(17a)；和將目的栽培品種(cv.“新”)轉(zhuǎn)化成為攜帶REC-HR的雄性不育系和重組保持系(17b)。
圖18a-18b描繪圖解程序，即將目的栽培品種(cv.“新”)轉(zhuǎn)化成為攜帶IEC-HC的雄性不育系和改進保持系(18a)；和將目的栽培品種(cv.“新”)轉(zhuǎn)化成為攜帶IREC-HC的雄性不育系和改進重組保持系(18b)。發(fā)明詳述按照本發(fā)明已經(jīng)開發(fā)了
圖1a、13a和14a中描繪的普通小麥或硬粒小麥的簡單系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)，通過用保持系(B系)授粉保持雄性不育母本系(A系)，所得到的所有子代均為雄性不育雌株。類似地，通過自花授粉容易地保持保持系自身，產(chǎn)生混合種子，其中約20％在生長時發(fā)育成為與保持系相同并攜帶工程化染色體的雄性可育植株，約80％在生長時由于缺乏Ms-Ss1等位基因發(fā)育成為雄性不育植株。利用鑒定保持系特征的選擇標(biāo)記，在自交保持系的每代的子代中保持80％雄性不育對20％雄性可育植株的比例。
當(dāng)所述選擇標(biāo)記是諸如藍糊粉的顏色選擇標(biāo)記或另一種子特性時，本發(fā)明提供同時保持雄性不育母本系(A系)和雄性可育保持系(B系)的替代改進和優(yōu)選的系統(tǒng)(
圖1b、c和14a)。通過保持系自花授粉得到所述二系的種子80％的種子是紅/白色，當(dāng)生長時發(fā)育成為雄性不育植株(A系)，20％的種子為藍色，當(dāng)生長時，發(fā)育成為雄性可育植株(B系)。使用顏色分選裝置分選出自交保持系的種子分離了這二種類型的種子。通過該優(yōu)選的方法，直接從保持系自交得到雄性不育母系種子；不需要交替種植保持系和母系，母本種子的生產(chǎn)成本顯著降低。而且，保持系小區(qū)中活花粉的數(shù)量沒有降低，因為保持系小區(qū)中的所有植株都是雄性可育的。
對于雜交小麥生產(chǎn)，將雄性不育母本系與天然為Ms-B1等位基因純合的雄性能育性的任何普通小麥或硬粒小麥栽培品種(R系)雜交，產(chǎn)生均為雜合Ms-B1ms-B1并因此為雄性可育的F1雜種后代。
因此，在一個方面，本發(fā)明提供保持普通小麥或硬粒小麥雄性不育母本系以用于雜交小麥生產(chǎn)的方法(
圖13a、14a和15a)，所述方法包括(a)用父本雜交母本，所述母本是雄性不育植株，對染色體4B短臂(4BS)上隱性ms-B1雄性不育等位基因的任何一個純合并對染色體6B長臂(6BL)上的顯性雄配子殺傷Ki-B1等位基因純合，所述父本是保持系并與母本等基因，且對母本的相同ms-B1和Ki-B1等位基因純合，并且具有選自以下的一條附加的異源工程化染色體(ⅰ)本文稱為EC的工程化染色體，由源自二條或多條不同的異源染色體的節(jié)組成，攜帶顯性雄性能育性等位基因Ms、對6BL上的天然雄配子殺傷等位基因的殺傷作用敏感的隱性等位基因ki以及一個或二個通過其可以選擇具有該染色體的植株的選擇標(biāo)記；和(ⅱ)本文稱為IEC的改進工程化染色體，由源自二條或多條不同的異源染色體的節(jié)組成，除攜帶Ms、ki和選擇標(biāo)記等位基因之外，還攜帶種子標(biāo)記，通過該種子標(biāo)記可以將具有該染色體的種子與不具有該染色體的種子分離；和(b)從(a)的雜交收獲子代種子，所有的種子對所述雄性不育和雄配子殺傷等位基因均為純合，并且缺乏所述工程化染色體EC或IEC，所述種子當(dāng)生長時發(fā)育成為所述雄性不育母系。
本發(fā)明再提供保持普通小麥或硬粒小麥雄性不育母本系以用于雜交小麥生產(chǎn)的替代方法(
圖13b、14b和15b)，所述方法包括(a)用父本雜交母本，所述母本是對染色體4B短臂(4BS)上隱性ms-B1雄性不育等位基因的任何一個純合并對染色體6B長臂(6BL)上的顯性雄配子殺傷Ki-B1等位基因純合的雄性不育植株，所述父本是保持系并與母本等基因，且對母本的同一ms-B1等位基因純合，但對攜帶Ki-B1等位基因的染色體6B和選自以下的重組工程化染色體是單體的(ⅰ)本文稱為REC的重組工程化染色體，由源自二條或多條不同的異源染色體的節(jié)和天然染色體臂6BL的遠端節(jié)組成，攜帶Ms等位基因、ki等位基因和一個或二個通過其可以選擇具有該染色體的植株的選擇標(biāo)記；和(ⅱ)本文稱為IREC的改進工程化染色體，由源自二條或多條不同的異源染色體的節(jié)和天然染色體臂6BL的遠端節(jié)組成，除攜帶Ms、ki和選擇標(biāo)記等位基因之外，還攜帶種子標(biāo)記，通過該種子標(biāo)記可以將具有該染色體的種子從不具有該染色體的種子分離；和(b)從(a)的雜交收獲子代種子，所有的種子均對所述雄性不育和雄配子殺傷等位基因純合，并且缺乏所述工程化染色體REC或IREC，所述種子當(dāng)生長時發(fā)育成為雄性不育母系。
本發(fā)明亦提供保持普通小麥或硬粒小麥雄性不育母本系以用于小麥F1雜種生產(chǎn)的另一替代改進方法(
圖15a)，所述方法包含(a)將改進保持系自交，所述保持系與母本等基因，即對任何一個隱性ms-B1雄性不育等位基因和顯性雄配子殺傷Ki-B1等位基因純合，并且具有本文命名為IEC-HC一條附加的改進工程化染色體(圖3a-5a)除攜帶Ms、rht和ki-Sl1-a等位基因之外，還攜帶決定藍種子顏色的種子選擇標(biāo)記Ba等位基因，因此所述改進工程化染色體包含或者攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a的IEC-HC1(4SsS/4EL/6SlL)、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a的IEC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL)或者攜帶Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a的IEC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL)；和(b)從所述(a)的自交植株收獲子代種子，所有的種子均對所述雄性不育和雄配子殺傷等位基因純合，80％的種子缺乏IEC-HC并因此為紅/白色，可以通過分選裝置從含有所述改進工程化染色體的藍色種子分離，所述紅/白色種子當(dāng)生長時發(fā)育成為雄性不育母系。
本發(fā)明亦提供保持普通小麥或硬粒小麥雄性不育母本系以用于小麥F1雜種生產(chǎn)的另一替代改進方法(
圖15b)，所述方法包含(a)將改進重組保持系自交，所述保持系與母本等基因，即對任何一個隱性ms-B1雄性不育等位基因純合，但對攜帶Ki-B1等位基因的染色體6B和對IREC-HC類型的改進重組工程化染色體為單體(圖3b、4b、5b)，該IREC-HC再包含位于ki-Sl1-a遠端的染色體6B長臂(6BL)遠端區(qū)，該區(qū)規(guī)則地與天然6BL的其同源區(qū)配對，所述IREC-HC除攜帶Ms、rht和ki-Sl1-a之外，還攜帶決定藍種子顏色的種子選擇標(biāo)記Ba等位基因，因此所述改進重組工程化染色體包含或者攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a的IREC-HC1(4SsS/4EL/6SlL/6BL)、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a的IREC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL/6BL)或者攜帶Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a的IREC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL/6BL)；(b)從所述(a)的自交植株收獲子代種子，所有的種子對所述雄性不育等位基因純合，50％的種子對染色體6B為二體，且缺乏IREC-HC并因此為紅/白色，當(dāng)生長時發(fā)育成為雄性不育植株，剩余50％對染色體6B為單體、對IREC-HC為單體并因此為藍色，當(dāng)生長時發(fā)育成為雄性可育植株，將(a)的所述子代種子再種植一個世代，其中雄性可育植株將自交并對雄性不育植株授粉；和(c)從(b)的植株收獲子代種子，所有的種子對所述雄性不育等位基因純合，約75％的種子對染色體6B為二體并且缺乏IREC-HC，因此為紅/白色，可以通過分選裝置從具有IREC-HC的藍色種子分離，所述紅/白色種子當(dāng)生長時發(fā)育成為雄性不育母系。
任何雄性不育ms-B1等位基因都可以按照本發(fā)明使用，例如ms-B1-a、ms-B1-b和ms-B1-c等位基因或誘導(dǎo)雄性不育的該基因座的或者普通小麥或硬粒小麥另一基因座的任何其它等位基因。禾本科一物種的任何Ba等位基因都可以按照本發(fā)明使用，例如一粒小麥的Ba-Am1、長穗鵝冠草的Ba-E1、黑麥的Ba-R1和大麥的Ba-H1。任何影響種子特征的等位基因都可以按照本發(fā)明使用。禾本科一物種的任何rht等位基因都可以按照本發(fā)明使用，例如Ae.searsii的rht-Ss1、高大山羊草的rht-Sl1和一粒小麥的rht-Am1。禾本科一物種的任何除草劑抗性等位基因都可以按照本發(fā)明使用，例如Ae.searsii的Su-Ss1或高大山羊草的Su-Sl1。禾本科一物種的任何對Ki-B1或任何其它雄配子殺傷基因的殺傷效應(yīng)敏感的ki等位基因都可以按照本發(fā)明使用。
另一方面，本發(fā)明提供普通小麥或硬粒小麥雄性可育保持系，以保持用于雜交小麥生產(chǎn)的雄性不育母本系，所述保持系與所述母本等基因，并對任何一個ms-B1雄性不育等位基因純合、對母本的雄配子殺傷Ki-B1等位基因純合，且具有攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a等位基因的一條附加的異源工程化染色體EC-H1(4SsS/6SlL)。因為保持系的雄性能育性等位基因不通過花粉粒傳遞，所以雄性不育母系與雄性可育保持系之間雜交的所有后代都與母本等基因，且為雄性不育。
本發(fā)明亦提供普通小麥或硬粒小麥雄性可育保持系以保持用于雜交小麥生產(chǎn)的雄性不育母本系，所述保持系與所述母本等基因并對任何一個ms-B1雄性不育等位基因純合、對母本的su-B1綠麥隆敏感性等位基因和雄配子殺傷Ki-B1等位基因純合，且具有攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-sl1-a等位基因的一條附加的異源工程化染色體EC-HR1(4SsS/6SlL)。因為保持系的雄性能育性等位基因不通過花粉粒傳遞，所以雄性不育母系與雄性可育保持系之間雜交的所有后代都與母本等基因且為雄性不育。
本發(fā)明再提供普通小麥或硬粒小麥替代重組雄性可育保持系以保持用于雜交小麥生產(chǎn)的雄性不育母本系，所述保持系與所述母系等基因并對任何一個ms-B1等位基因純合、但對染色體6B為單體并因此對Ki-B1等位基因為半合子，而且具有一條附加的重組工程化染色體REC-H1(4SsS/6SlL/6BL)，該REC-HC1再包含位于ki-Sl1-a等位基因遠端的6BL遠端區(qū)，該區(qū)規(guī)則地與天然6BL的其同源區(qū)配對。因此，REC將包含于50％的配子中。因為重組保持系的雄性能育性等位基因不通過花粉粒傳遞，雄性不育母系與重組雄性可育保持系之間雜交的所有后代都與母本等基因且為雄性不育。另一方面，自交重組保持系的50％子代將具有REC并因此為雄性可育。
本發(fā)明還提供普通小麥或硬粒小麥替代重組雄性可育保持系以保持用于雜交小麥生產(chǎn)的雄性不育母本系，所述保持系與所述母系等基因并對任何一個ms-B1和su-B1等位基因純合、但對染色體6B為單體并因此對Ki-B1等位基因為半合子，而且具有一條附加的重組工程化染色體REC-HR1(4SsS/6SlL/6BL)，該REC-HR1再包含位于ki-Sl1-a等位基因遠端的6BL遠端區(qū)，該區(qū)規(guī)則地與天然6BL的其同源區(qū)配對。因此，REC-HR1將包含于50％的配子中。因為重組保持系的雄性能育性等位基因不通過花粉粒傳遞，雄性不育母系與重組雄性可育保持系之間雜交的所有后代都與母本等基因且為雄性不育。另一方面，自交重組保持系的50％子代將具有REC-HR1并因此為雄性可育。
本發(fā)明亦提供普通小麥或硬粒小麥替代改進保持系以保持用于雜交小麥生產(chǎn)的雄性不育母本系，所述保持系與所述母本等基因并對任何一個ms-B1雄性不育等位基因純合、對母本的雄配子殺傷Ki-B1等位基因純合，且具有一條附加的改進異源工程化染色體IEC-HC，該染色體或者為IEC-HC1(4SsS/4EL/6SlL)、IEC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL)或者IEC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL)，它們分別攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a,Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a以及Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a等位基因。任何選擇標(biāo)記都可以置換IEC-HC中的Ba等位基因。當(dāng)選擇標(biāo)記是種子特征例如種子顏色時，將發(fā)育成為與母本等基因且雄性不育的植株的自交保持系的子代種子可以與那些將發(fā)育成為雄性可育保持系的種子分離。因此可以通過所述具有這種種子選擇標(biāo)記的改進保持系自交，保持雄性不育母本；自交改進保持系子代種子的80％為紅/白色，當(dāng)生長時將發(fā)育成為雄性不育母本植株，20％為藍色，當(dāng)生長時將發(fā)育成為雄性可育改進保持系植株。
本發(fā)明還提供普通小麥或硬粒小麥替代改進重組雄性可育保持系以保持用于雜交小麥生產(chǎn)的雄性不育母本系，所述保持系與所述母系等基因并對任何一個ms-B1等位基因純合、但對染色體6B為單體并因此對Ki-B1等位基因為半合子，而且具有一條附加的改進重組工程化染色體IREC-HC，該染色體或者為IREC-HC1(4SsS/4EL/6SlL/6BL)、IREC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL/6BL)或者IREC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL/6BL)，它們分別攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a；Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-S1-a；以及Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a等位基因，且都具有普通小麥6BL的遠端節(jié)。任何選擇標(biāo)記都可以置換IREC-HC中的Ba等位基因。
在本發(fā)明的另一個方面，提供產(chǎn)生具有工程化染色體EC-H1的普通小麥或硬粒小麥雄性可育保持系的方法(圖7a)，所述方法包含(a)用源自普通小麥栽培品種中國春的雄性可育母本與父本雜交，所述母本對染色體臂4BS上顯性Ms-B1雄性能育性等位基因和6BL上的顯性Ki-B1雄配子殺傷等位基因純合，并且具有在其長臂上攜帶隱性雄配子殺傷等位基因ki-Sl1-a的附加異源染色體6Sl，所述父本與母本等基因但對隱性ms-B1-c雄性不育等位基因純合、缺少染色體6Sl，而具有在其短臂上攜帶顯性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1的一條附加的異源染色體4Ss；(b)從所述(a)的雜交收獲子代種子，并種植所述種子，由此產(chǎn)生雄性可育F1植株，一部分為雙單體附加，即它們具有二條異源染色體，即攜帶MS-Ss1和rht-Ss1的4Ss和攜帶ki-Sl1-a的6Sl；(c)自交(b)的F1子代，收集其大量的子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生F2植株，其一部分是異源易位工程化染色體單體附加，其25％對ms-B1-c雄性不育等位基因純合并且是目的植株；(d)通過染色體計數(shù)、C-帶和使用DNA標(biāo)記選擇(c)的所述目的植株，并將其自交；(e)收集(d)的自交子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生F3植株，它們都對ms-B1-c雄性不育等位基因純合，20％由于它們亦具有所述附加的工程化染色體EC-H1而為雄性可育，這些即是目的保持系植株；和(f)通過染色體計數(shù)和使用DNA標(biāo)記選擇(e)的目的保持系植株。
本發(fā)明亦提供產(chǎn)生具有工程化染色體EC-HR1的普通小麥或硬粒小麥雄性可育保持系的方法(圖8a)，所述方法包含(a)用源自普通小麥栽培品種中國春中的雄性可育保持系的雄性可育母本與二倍體物種Aegilops searsii品系雜交，所述母本對隱性ms-B1雄性不育等位基因、隱性綠麥隆敏感等位基因su-B1和顯性Ki-B1雄配子殺傷等位基因純合，并且具有做為單體附加的工程化染色體EC-H1，該染色體在其短臂上攜帶顯性雄性能育性等位基因Ms-Ss1和半顯性rht-Ss1等位基因、在其長臂上攜帶隱性綠麥隆敏感等位基因su-Sl1和隱性雄配子殺傷等位基因ki-Sl1-a，所述二倍體物種Aegilops searsii品系在6SsL上具有顯性綠麥隆抗性等位基因Su-Ss1并在4SsS上具有Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因；(b)從所述(a)的雜交收集子代種子，并種植所述種子，由此產(chǎn)生F1植株，其中一部分具有2n=29染色體，即它們具有CS的一套染色體、工程化染色體EC-H1和Aegilops searsiii的一套染色體，基因型為ms-B1Ms-Ss1Ms-Ss1,ki-B1ki-Sl1-a和su-B1su-Sl1Su-Ss1；(c)選擇具有2n=29染色體的(b)的F1子代，將其與做為父本的cv.CS回交，收集其子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生BC1植株，其一部分對綠麥隆抗性的植株是工程化染色體EC-HR1單體附加，它們均是ms-B1MS-B1雜合并對su-B1和Ki-B1純合，是目的植株；(d)通過染色體計數(shù)和使用DNA標(biāo)記選擇(c)的所述目的植株，并將其自交；(e)收集(d)的自交子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生BC1F2植株，其20％對綠麥隆抗性，即攜帶所述工程化染色體，25％的抗性植株對ms-B1純合，但是由于它們攜帶工程化染色體EC-HR1的Ms-Ss1而為雄性可育，這些即是目的保持系植株；和(f)通過對綠麥隆抗性和使用DNA標(biāo)記選擇(e)的目的保持系植株。
本發(fā)明再提供產(chǎn)生具有重組工程化染色體REC-H1的普通小麥或硬粒小麥雄性可育重組保持系的方法(圖7b)，所述方法包含(a)用源自普通小麥栽培品種中國春的雄性可育母本與父本雜交，所述母本對染色體臂4BS上顯性Ms-B1雄性能育性等位基因和染色體臂5BL上的顯性部分同源配對抑制基因等位基因Ph1純合，對染色體6B為缺對染色體并因此缺乏顯性Ki-B1雄配子殺傷等位基因，并且具有一對攜帶隱性雄配子殺傷等位基因ki-Sl1-a的6Sl染色體，所述父本與母本等基因但卻是二體6B并因此對Ki-B1純合、缺乏染色體6Sl，亦對突變部分同源配對等位基因ph1b純合；(b)從(a)的雜交收集子代種子，并種植所述種子，由此產(chǎn)生對部分同源配對等位基因雜合的(Ph1ph1b)雄性可育(Ms-B1Ms-B1)F1植株，它們對6B和6Sl染色體均為單體；(c)將所述(b)的F1植株與父本回交；(d)收集(c)雜交的子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生BC1植株，它們均為雄性可育(Ms-B1Ms-B1)，其50％對ph1b等位基因純合，其中約50％(因為6B與6Sl配對)對6B和6Sl均為雙單體，是目的BC1植株；(e)通過使用DNA標(biāo)記并分析減數(shù)分裂時染色體配對，選擇(d)的目的BC1植株，將其用與BC1植株等基因但為純合Ph1ph1的雙末端體6BS品系(即缺少6BL臂)授粉；(f)收集(e)的雜交子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生植株，其全部對染色體臂6BS為單末端體，其中一部分亦對由6Sl的短臂和長臂的近端區(qū)(攜帶ki-Sl1-a)和染色體臂6BL的遠端區(qū)組成的重組染色體(重組點居ki-Sl1-a遠端)為單體，即是目的植株；(g)通過C-帶、使用DNA標(biāo)記和分析染色體配對選擇(f)的所述目的植株，將它們做為父本與母系雜交，該母系是非重組保持系，即對任何一個隱性雄性不育等位基因ms-B1和顯性雄配子殺傷等位基因Ki-B1均純合，具有攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a的工程化染色體EC-H1；(h)收獲(g)的雜交子代種子，并種植所述種子，由此產(chǎn)生F1植株，其中一部分為三單體，即它們對6B、異源工程化染色體EC-H1和重組染色體(6Sl/6BL)為單體，是雜合Ms-B1ms-B1、半合子Ki-B1和純合ki-Sl1-aki-Sl1-a，并是目的植株；和(i)通過染色體計數(shù)、C-帶和利用DNA標(biāo)記選擇(h)的所述目的植株，將其自交，收集子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生F2植株，其中一部分為雙單體，具有染色體6B和重組工程化染色體REC-H1(4SsS/6SlL/6BL)，攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a，這些即是目的保持系植株。
本發(fā)明亦提供產(chǎn)生具有重組工程化染色體REC-HR1的普通小麥或硬粒小麥雄性可育重組保持系的方法(圖8b)，所述方法包含(a)用源自普通小麥栽培品種中國春中的雄性可育重組保持系的雄性可育母本與二倍體物種的Aegilops searsii品系雜交，該母本是單體6B單體附加REC-H1，所述母本對染色體臂4BS上隱性ms-B1雄性不育等位基因純合、對隱性綠麥隆敏感等位基因su-B1和顯性Ki-B1雄配子殺傷等位基因為半合子，并且具有做為單體置換的工程化染色體REC-H1(4SsS/6SlL/6BL)，該染色體在其短臂上攜帶顯性雄性能育性等位基因Ms-Ss1和半顯性rht-Ss1等位基因、在其長臂上攜帶隱性綠麥隆敏感等位基因su-Sl1和隱性雄配子殺傷等位基因ki-Sl1-a，所述二倍體物種Aegilods searsii品系具有顯性綠麥隆抗性等位基因Su-Ss1以及Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因；(b)收集(a)的雜交子代種子，并種植所述種子，由此產(chǎn)生F1植株，其中50％含有重組工程化染色體，該染色體與4SsS和6SsS配對，因此在減數(shù)分裂時形成三價體，具有基因型ms-B1Ms-Ss1Ms-Ss1,ki-Sl1-a su-Sl1和Su-Sl；(c)選擇(b)的F1子代并將其與做為父本的cv.中國春回交；(d)收集其子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生BC1植株，它們均為雜合ms-B1Ms-B1并因此為雄性可育，其中一些植株是單體6B并由此對su-B1和Ki-B1為半合子，并具有做為單體置換的在短臂上攜帶Ms-Ss1和rht-Ss1、在長臂上攜帶Su-Ss1和ki-Sl1-a的重組工程化染色體REC-HR1，是目的植株；(e)通過對綠麥隆抗性和通過分析減數(shù)分裂時染色體配對選擇(c)的所述目的植株，將其自交；(f)收集(d)的自交子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生BC1F2植株，其中50％是單體6B并對重組染色體REC-HR1為單體，該染色體由4Ss的短臂(攜帶Ms-Ss1和rht-Ss1)、6Sl的長臂近端區(qū)(攜帶Su-Ss1和ki-Sl1-a)和染色體臂6BL的遠端區(qū)組成(重組點居ki-Sl1-a遠端)，這些植株的25％對ms-B1純合，對su-B1和Ki-B1為半合子，這些即是目的保持系植株；和(g)通過綠麥隆抗性、使用DNA標(biāo)記和分析染色體配對選擇(e)的目的重組保持系植株。
本發(fā)明再提供產(chǎn)生具有改進工程化染色體IEC-HC1的普通小麥或硬粒小麥雄性可育改進保持系的方法(圖9a-b)，所述方法包含(a)用源自普通小麥栽培品種中國春的雄性可育母本與父本雜交，所述母本是保持系，即對染色體臂4BS上隱性ms-B1雄性不育等位基因和染色體臂6BL上的顯性Ki-B1雄配子殺傷等位基因純合，并且具有一條在其短臂上攜帶顯性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1、在其長臂上攜帶隱性等位基因ki-Sl1-a的附加的工程化染色體EC-H1，所述父本與母本等基因但對顯性雄性能育性等位基因Ms-B1純合，具有附加的一對異源染色體4E，所述染色體在其長臂上攜帶顯性藍糊粉等位基因Ba-E1；(b)收集(a)的雜交子代種子，所有的種子都是藍色的，用熱中子輻射種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生雄性可育F1植株，它們均為雜合Ms-B1ms-B1并對Ki-B1純合，其20％是工程化染色體EC-H1和染色體4E的雙單體附加并是目的植株；(c)通過染色體計數(shù)和通過使用DNA標(biāo)記選擇(b)的所述目的植株，將其自交；(d)收集(c)子代種子，選擇藍色種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生F2植株，其一部分有43條染色體，這些植株的一部分具有改進工程化染色體IEC-H1并且是目的植株，該染色體含有4SsS/4EL/6SlL、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a，其它一些則具有易位染色體4SsS/4EL；(e)通過染色體計數(shù)和通過使用DNA標(biāo)記選擇(d)的目的植株，將其自交；(f)收集(e)的子代種子并選擇藍色種子，這些種子生長時發(fā)育成為雄性可育植株，它們攜帶改進工程化染色體IEC-HC1，這些是目的改進保持系植株；(g)如果步驟(d)未得到目的植株，則通過染色體計數(shù)和通過DNA標(biāo)記選擇具有易位染色體4SsS/4EL的(d)的植株(源自藍色種子，雄性可育)，將它們做為父本與具有EC-H1的保持系回交以產(chǎn)生F1種子；(h)從(g)的F1種子中選擇藍色種子，將其用熱中子輻射并萌發(fā)，選擇具有44條染色體的苗，即具有二條異源附加染色體4SsS/4EL和4SsS/6SlL；和(i)重復(fù)步驟(d)-(f)，由此得到具有改進工程化染色體IEC-HC1的目的改進保持系，該染色體含有4SsS/4EL/6SlL，攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a。
本發(fā)明再提供產(chǎn)生具有改進工程化染色體IEC-HC1的普通小麥或硬粒小麥雄性可育改進保持系的另一方法(圖9c)，所述方法包含(a)用源自普通小麥栽培品種中國春的雄性可育母本與父本雜交，所述母本對顯性雄性能育性等位基因Ms-B1和顯性雄配子殺傷等位基因Ki-B1純合，并且具有一對在其長臂上攜帶顯性藍糊粉等位基因Ba-E1的異源染色體4E，所述父本與母本等基因，但對隱性雄性不育等位基因ms-B1-c純合、具有在其短臂上攜帶顯性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1的附加異源染色體4Ss；(b)收集(a)的雜交子代種子，并種植所述種子，由此產(chǎn)生F1植株，它們均為雜合Ms-B1ms-B1和純合Ki-B1Ki-B1，其25％是攜帶染色體4E和4Ss的雙單體附加，是目的植株；(c)通過染色體計數(shù)和通過使用DNA標(biāo)記選擇(b)的所述目的F1植株，將其自交；(d)選擇(c)自交種子中的藍色種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生F2植株，其中一部分具有易位染色體4SsS/4EL，是目的植株；(e)通過染色體計數(shù)和通過使用DNA標(biāo)記選擇(d)的所述目的F2植株，將它們做為父本與具有EC-H1(4SsS/6SlL)的保持系回交得到F1種子，其中一些是藍色的；(f)選擇(e)的藍色種子，將它們用熱中子輻射并使其生長為F1植株，它們均對ms-B1-c和Ki-B1純合，其中少數(shù)具有4SsS/4EL和4SsS/6SlL雙單體附加，是目的植株；(g)通過染色體計數(shù)和使用DNA標(biāo)記選擇(f)的所述目的植株，將其自交；(h)收集(g)的子代種子，選擇藍色種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生F2植株，它們均對ms-B1-c和Ki-B1等位基因純合，其中一部分有43條染色體，這些植株的一部分具有改進工程化染色體IEC-H1并且是目的植株，染色體IEC-HC1含有4SsS/4EL/6SlL、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1；(i)通過染色體計數(shù)、C-帶和雄性能育性選擇(h)的目的植株，將其自交；和(j)收集(i)的子代種子并選擇藍色種子，所述種子生長時發(fā)育成為攜帶IEC-HC1的雄性可育植株，這些是目的改進保持系植株。
本發(fā)明亦提供產(chǎn)生具有改進工程化染色體IEC-HC2的普通小麥或硬粒小麥雄性可育改進保持系的方法(
圖10)，所述方法包含(a)將普通小麥栽培品種中國春二體置換品系父本與母本雜交，在父本品系中一粒小麥的染色體4Am置換了普通小麥的染色體4B，因此所述父本缺少雄性能育性等位基因Ms-B1、對雄配子殺傷等位基因Ki-B1和4AmS上的Ms-Am1和rht-Am以及4AmL上的Ba-Am1純合，所述母本與父本等基因、對隱性ms-B1雄性不育等位基因純合，并且具有一條在其短臂上攜帶顯性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1的附加的異源染色體4Ss；(b)收集(a)的雜交子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生F1植株，它們均為半合子ms-B1-c并對Ki-B1純合，其中一些是三單體4B、4Ss和4Am并是目的植株；(c)通過染色體計數(shù)選擇(b)的所述三單體植株，由此產(chǎn)生雄性可育F1植株，使其自花授粉；(d)收集(c)F2種子，選擇藍色種子并種植所述選擇的種子，由此產(chǎn)生F2植株，進一步從這些F2植株中選擇那些具有44條染色體(在減數(shù)分裂時顯示21”+2’)的植株，這些植株是目的雙單體附加4Ss和4Am；(e)自交(d)的所述目的植株，由此得到F3種子，選擇藍色種子；(f)種植(e)的藍色種子，選擇具有43條染色體(21”+1)的植株，它們?yōu)樾坌钥捎a(chǎn)生藍色種子，這些植株具有易位染色體4SsS/4AmL，是目的植株；(g)將(f)的目的植株做為父本與做為母本的純合ms-B1msB1Ki-B1KiB1并具有EC-H1(4SsS/6SlL)、攜帶Ms-Ss1rht-Ss1ki-Sl1-a的保持系雜交得到F1種子；(h)從(f)的F1子代種子中選擇藍色種子，將其用熱中子輻射并種植，再選擇具有44條染色體(21”+1”)的植株，即對異源附加染色體的短臂為二體、對其長臂為雙單體的植株，將其自交；
(i)種植(h)的藍色種子，選擇具有43條染色體、產(chǎn)生藍色和紅/白色種子的雄性可育植株，這些植株具有IEC-HC2，是目的植株；和(j)自交(i)的目的植株，收集其種子并分離藍色種子，所述種子當(dāng)生長時，發(fā)育成為具有IEC-HC2的雄性可育植株，這些即是目的改進保持系植株。
本發(fā)明亦提供產(chǎn)生具有改進工程化染色體IEC-HC3的普通小麥或硬粒小麥雄性可育改進保持系的方法(
圖11)，所述方法包含(a)將普通小麥栽培品種中國春二體置換系父本與母本雜交，在二體置換系中一粒小麥的染色體4Am置換了普通小麥的染色體4B，因此所述父本缺少雄性能育性等位基因Ms-B1、對雄配子殺傷等位基因Ki-B1和4AmS上的Ms-Am1和rht-Am1以及4AmL上的Ba-Am1純合，所述母本與父本等基因，但對隱性ms-B1雄性不育等位基因純合，并且具有一條在其短臂上攜帶顯性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1的附加的異源染色體4Ss；(b)收集(a)的F1種子，它們均為藍色并種植所述種子，它們均為半合子ms-B1-c并對Ki-B1純合，其中75％是單體4B和攜帶Ms-Am1的4Am單體置換，由此為雄性可育，使用所述單體-單體置換、對雜合Ms-B1ms-B1和純合Ki-B1等位基因并具有做為單體附加的染色體6Sl的母本授粉，其中所述母本通過將附加4Ss單體的ms-B1-cms-B1-c中國春做為父本，與對Ms-B1和Ki-B1等位基因純合并具有做為單體附加的染色體6Sl的母本雜交得到，20％的子代具有目的構(gòu)造；(c)收集(b)雜交的藍色F1種子，用熱中子輻射，將其種植并從F1植株中選擇那些具有43條(21”+1’)和42條(20”+2’)染色體的植株并使這些植株自交；(d)從(c)的自交種子選擇藍色種子并種植所述種子，選擇雄性可育、有約20％不存活花粉并產(chǎn)生藍色和紅/白色種子的植株；和(e)種植(d)的種子，分離藍色種子，所述種子當(dāng)生長時，發(fā)育成為具有IEC-HC3的雄性可育植株(具有43條染色體)，這些即是目的改進保持系植株。
本發(fā)明再提供產(chǎn)生具有改進重組工程化染色體IREC-HC的普通小麥或硬粒小麥雄性可育保持系的方法(
圖12)，所述方法包含(a)將源自普通小麥栽培品種中國春的雄性可育母本與父本雜交，所述母本對染色體臂4BS上顯性Ms-B1雄性能育性等位基因和染色體臂5BL上的顯性部分同源配對抑制基因等位基因Ph1純合，對染色體6B為缺對染色體并因此缺乏顯性Ki-B1雄配子殺傷等位基因，并且具有一對攜帶隱性雄配子殺傷等位基因ki-Sl1-a的6Sl染色體，所述父本與母本等基因但卻是二體6B，并因此對Ki-B1純合、缺少染色體6Sl、亦對突變部分同源配對等位基因ph1b純合；(b)收集(a)的雜交子代種子，并種植所述種子，由此產(chǎn)生對部分同源配對等位基因雜合的(Ph1ph1b)雄性可育(Ms-B1Ms-B1)F1植株，它們對6B和6Sl染色體均為單體；(c)將所述(b)的F1植株與父本回交；(d)收集(c)雜交的子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生BC1植株，它們均為雄性可育(Ms-B1Ms-B1)，其1/2對ph1b等位基因純合，其中約1/2(因為6B與6Sl配對)對6B和6Sl為雙單體，是目的BC1植株；(e)通過減數(shù)分裂時染色體配對和通過DNA標(biāo)記選擇(d)的目的BC1植株，將其用與BC1植株等基因但為純合Ph1Ph1的雙末端體6BS品系(即缺少6BL臂)授粉；(f)收集(e)的雜交子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生植株，它們?nèi)繉θ旧w臂6BS為單末端體，其中一部分亦對由6Sl的短臂和長臂近端區(qū)(攜帶ki-Sl1-a)和染色體臂6BL的遠端區(qū)組成的重組染色體(重組點居ki-Sl1-a遠端)為單體，即是目的植株；(g)通過C-帶、通過分析染色體配對和使用DNA標(biāo)記選擇(f)的所述目的植株，將它們做為父本與母系雜交，該母系是改進保持系，即對任何一個隱性雄性不育等位基因ms-B1和顯性雄配子殺傷等位基因Ki-B1純合，具有下述改進工程化染色體之一IEC-HC1(4SsS/4EL/6SlL)、IEC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL)或者IEC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL)，它們分別攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a，Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1或ki-Sl1-a以及Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a；(h)收集(g)的雜交子代種子，并種植所述種子，由此產(chǎn)生F1植株，其中一部分為三單體，即它們對6B、改進工程化染色體IEC-HC1、IEC-HC2或IEC-HC3之一和重組染色體(6Sl/6BL)為單體，是雜合Ms-B1ms-B1、半合子Ki-B1，是目的植株；和(i)通過染色體計數(shù)、C-帶和通過使用DNA標(biāo)記選擇(h)的所述目的植株，將其自交，收集子代種子并種植所述種子，其中一部分為雙單體，具有染色體6B和改進重組工程化染色體IREC-HC，該染色體或者為IREC-HC1(4SsS/4EL/6SlL/6BL)、IREC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL/6BL)或者IREC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL/6BL)，這些即是具有IREC-HC的目的保持系植株。
在另一方面，本發(fā)明提供在普通小麥或硬粒小麥的保持系或重組保持系每個世代中保持雄性可育與雄性不育植株比例恒定的方法，包含(a)使含有工程化染色體的雄性可育保持系自交，該染色體選自工程化染色體EC-H1和重組工程化染色體REC-H1，除攜帶Ms-Ss1和ki-Sl1-a等位基因之外，還攜帶做為選擇標(biāo)記的rht-Ss1等位基因，該標(biāo)記便于從該自交保持系的雄性可育子代中分離收獲的種子，所述種子生長時發(fā)育成為所述保持系；(b)收集(a)的子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生植株，其20％(具有工程化染色體EC-H1的保持系子代)和50％(具有重組工程化染色體REC-H1的保持系子代)含有所述工程化染色體，并與所述保持系相同，因此攜帶rht-Ss1等位基因，并比缺少所述工程化染色體的那些植株高(6-8cm)；和(c)收獲(b)的較高的植株，它們都是雄性可育，得到的子代種子中有20％(EC-H1)或50％(REC-H1)的種子攜帶所述工程化染色體，由此保持保持系或重組保持系每個世代中雄性可育與雄性不育植株的比例恒定。
本發(fā)明再提供在普通小麥或硬粒小麥的保持系或重組保持系每個世代中保持雄性可育與雄性不育植株比例恒定的方法，包含(a)使含有工程化染色體的雄性可育保持系自交，該染色體選自工程化染色體EC-HR1和重組工程化染色體REC-HR1，除攜帶Ms-Ss1和ki-Sl1-a等位基因之外，還攜帶做為選擇標(biāo)記的Su-Ss1等位基因，該標(biāo)記便于從該自交保持系的雄性可育子代中選擇具有同樣所述保持系基因型的植株；(b)收集(a)的子代種子，萌發(fā)所述種子成為子代苗，其20％(具有工程化染色體EC-HR1的保持系子代)和50％(具有重組工程化染色體REC-HR1的保持系子代)含有所述工程化染色體，用除草劑綠麥隆噴灑所述苗，由此殺死所有的敏感苗，即那些缺少EC-HR1或REC-HR1的苗；和(c)收獲(b)的綠麥隆抗性植株，它們都攜帶EC-HR1或REC-HR1并因此是雄性可育，得到的子代種子中有20％(EC-HR1)或50％(REC-HR1)的種子攜帶所述工程化染色體，由此保持保持系或重組保持系每個世代中雄性可育與雄性不育植株的比例恒定。
本發(fā)明亦提供在普通小麥或硬粒小麥的改進保持系或改進重組保持系每個世代中保持雄性可育與雄性不育植株恒定比例的方法，包含(a)使含有工程化染色體的雄性可育保持系自交，該染色體選自工程化染色體IEC-HC1和重組工程化染色體IREC-HC1，除攜帶Ms-Ss1和ki-Sl1-a等位基因之外，還攜帶做為選擇標(biāo)記的Ba等位基因(誘導(dǎo)種子藍色)，該標(biāo)記便于從該自交保持系的雄性可育子代中選擇種子，所述種子生長時發(fā)育成為所述保持系；(b)收集(a)的子代種子并借助分選裝置分離攜帶IEC-HC1或IREC-HC1的藍色種子與缺少這些染色體的紅/白色種子；和(c)種植(b)的藍色種子，它們均發(fā)育成為雄性可育改進保持系或改進重組保持系植株。
在另一方面，本發(fā)明提供防止工程化染色體通過減數(shù)分裂時著絲粒錯分裂斷裂成為二個具端著絲粒(一個臂)染色體的方法，這二個具端著絲粒染色體攜帶或者該工程化染色體短臂的Ms和rht等位基因或者長臂的ki-Sl1-a等位基因和Su等位基因(在EC-HR的情況下)和Ba等位基因(在IEC的情況下)。Ms與ki-S1-a之間的分離可以導(dǎo)致Ms的雄性傳遞，并且因此在用保持系或改進保持系對該母系授粉時或在該改進保持系自交時，產(chǎn)生一定數(shù)量的雄性可育雌株。在后二者情況下，攜帶Ms的種子生長時發(fā)育成為雄性可育植株，所述種子將是紅/白色，不能與缺乏Ms的那些種子分離，缺乏Ms的那些種子生長時發(fā)育成為雄性不育植株。在EC-HR的情況下，僅具有工程化染色體短臂、攜帶Ms-Ss1和rht-Ss1的植株對綠麥隆敏感，并可以在施用除草劑時被選擇。使用重組保持系或改進重組保持系而不是保持系或改進保持系，消除了Ms等位基因雄性傳遞的危險。在這些保持系中，重組或改進重組工程化染色體規(guī)則地與天然6B染色體配對，因此防止了在配對染色體中通常不發(fā)生的著絲粒錯分裂。這維持了Ms與Ki-Sl1-a之間的連鎖。
在另一方面，本發(fā)明提供將普通小麥或硬粒小麥目的栽培品種轉(zhuǎn)化成為雄性不育母本系和用于所述母系的具有工程化染色體EC-H的雄性可育保持系的方法(
圖16a)，所述方法包含(a)將保持系與目的栽培品種雜交，所述保持系為純合ms-B1ms-B1Ki-B1Ki-B1并具有異源工程化染色體EC-H1(4SsS/6SlL)、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a，所述栽培品種是純合Ms-B1Ms-B1ki-B1ki-B1；
(b)收集(a)雜交的子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生雄性可育F1植株，其全部是雜合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a，其1/4亦攜帶工程化染色體EC-H1，是目的植株；(c)通過染色體計數(shù)和利用DNA標(biāo)記選擇(b)的所述所需F1植株，用目的栽培品種對其授粉產(chǎn)生BC1子代，其1/16是雜合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a并攜帶工程化染色體EC-H1，是目的基因型；(d)種植(c)的所述BC1植株，通過染色體計數(shù)和通過使用DNA標(biāo)記選擇所述目的基因型，再將它們做為母本與目的栽培品種回交四個連續(xù)世代，產(chǎn)生第五代回交子代(BC5)，通過染色體計數(shù)和通過使用DNA標(biāo)記在每個世代選擇具有工程化染色體EC-H1的雜合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a后代；和(e)自交(d)的目的BC5植株，收集其子代種子并種植所述種子，由此生長BC5F2植株，其1/16是雄性不育并對雄性不育ms-B1和雄配子殺傷Ki-B1等位基因純合，是目的雄性不育母系，其它具有類似基因型但亦具有攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a的工程化染色體EC-H1的BC5F2植株是目的雄性可育保持系植株。
本發(fā)明亦提供將普通小麥或硬粒小麥目的栽培品種轉(zhuǎn)化成為雄性不育母本系和用于所述母系的具有工程化染色體EC-HR的雄性可育保持系的方法(
圖17a)，所述方法包含(a)將保持系與目的栽培品種雜交，所述保持系為純合ms-B1ms-B1su-B1su-B1Ki-B1Ki-B1并具有異源工程化染色體EC-HR1、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a，所述所需栽培品種是純合Ms-B1Ms-B1Su-B1Su-B1ki-B1ki-B1；(b)收集(a)雜交的子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生雄性可育F1植株，其全部是雜合ms-B1Ms-B1Su-B1su-B1Ki-B1ki-B1-a，其1/4亦攜帶工程化染色體，是目的植株；(c)通過染色體計數(shù)和利用DNA標(biāo)記選擇(b)的所述目的F1植株，用目的栽培品種對其授粉產(chǎn)生BC1子代，其1/32是雜合ms-B1Ms-B1Su-B1su-B1Ki-B1ki-B1-a并攜帶工程化染色體EC-HR1，是目的基因型；(d)種植(c)的所述BC1植株，通過染色體計數(shù)和通過使用DNA標(biāo)記選擇所述目的基因型，再將它們做為母本與目的栽培品種回交四個連續(xù)世代，產(chǎn)生第五代回交子代(BC5)，通過染色體計數(shù)和通過使用DNA標(biāo)記在每個世代選擇具有工程化染色體EC-HR1的雜合ms-B1Ms-B1Su-B1su-B1Ki-B1ki-B1-a后代；和(e)自交(d)的目的BC5植株，收集其子代種子并種植所述種子，由此生長BC5F2植株，其1/64是雄性不育并對雄性不育ms-B1、綠麥隆敏感性su-B1和雄配子殺傷Ki-B1等位基因純合，是目的雄性不育母系，其它具有類似基因型但亦具有攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a的工程化染色體EC-HR1的BC5F2植株是目的雄性可育保持系植株。
本發(fā)明再提供將普通小麥或硬粒小麥目的栽培品種轉(zhuǎn)化成為雄性不育母本系和用于所述母系的具有重組工程化染色體REC-H的雄性可育重組保持系的方法(
圖16b)，所述方法包含(a)將具有REC-H1的保持系做為母本與目的栽培品種雜交，所述保持系為純合ms-B1ms-B1、對6B(對Ki-B1為半合子)和重組工程化染色體REC-H1(4SsS/6SlL/6BL)為單體、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a，所述栽培品種是純合Ms-B1Ms-B1ki-B1ki-B1；(b)收集(a)雜交的子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生雄性可育F1植株，其全部是雜合ms-B1Ms-B1，其1/2對染色體6B為二體，并因此是雜合Ki-B1ki-B1-a，其1/2對染色體6B和重組工程化染色體REC-H1為雙單體、對ki-B1-a為半合子，但亦攜帶重組工程化染色體的Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a；(c)通過分析染色體配對和使用DNA標(biāo)記選擇(b)的所述二種類型的F1子代，用目的栽培品種對其授粉產(chǎn)生二種類型的BC1子代，那些源自二體F1的子代的1/4是雜合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a，那些源自雙單體F1的子代的1/4是雙單體、雜合ms-B1Ms-B1、半合子ki-B1-a，并亦攜帶重組工程化染色體REC-H1的Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a；(d)通過分析染色體配對和通過使用DNA標(biāo)記選擇(c)的二組所述目的植株，再將它們做為母本與目的栽培品種回交四個連續(xù)世代，產(chǎn)生二種類型的第五代回交子代(BC5)，通過染色體配對分析和通過使用DNA標(biāo)記在每個世代選擇具有重組工程化染色體REC-H1的二體類型中的雜合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a和雙單體類型中的雜合ms-B1Ms-B1的后代；(e)用(d)的目的二體BC5對(d)的目的雙單體BC5植株授粉，產(chǎn)生二組BC5F2，一組為二體植株，其1/8是純合ms-B1ms-B1和雜合Ki-B1ki-B1-a，是目的二體植株，一組為雙單體植株，其1/8是純合ms-B1ms-B1、半合子Ki-B1，并亦攜帶重組工程化染色體REC-H1的Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a，因此為雄性可育且是目的重組保持系；(f)分別種植(e)的所述雙單體BC5F2種子和(e)的二體BC5F2種子，通過染色體配對分析和通過使用DNA標(biāo)記選擇目的雄性可育重組保持系和雄性不育母系。
本發(fā)明亦提供將普通小麥或硬粒小麥目的栽培品種轉(zhuǎn)化成為雄性不育母本系和用于所述母系的具有重組工程化染色體REC-HR的雄性可育重組保持系的方法(
圖17b)，所述方法包含(a)將具有REC-HR1的保持系做為母本與目的栽培品種雜交，所述保持系為純合ms-B1ms-B1、對6B(對su-B1和Ki-B1為半合子)和重組工程化染色體REC-HR1為單體、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a，所述栽培品種是純合Ms-B1Ms-B1Su-B1Su-B1ki-B1ki-B1；(b)收集(a)雜交的子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生雄性可育F1植株，其全部是雜合ms-B1Ms-B1，其1/2對染色體6B為二體，并因此是雜合Su-B1su-B1Ki-B1ki-B1，其1/2對染色體6B和重組工程化染色體REC-HR1為雙單體、對Su-B1和ki-B1-a為半合子但亦攜帶重組工程化染色體REC-HR1的Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a；(c)通過分析染色體配對和使用DNA標(biāo)記選擇(b)的所述二種類型的F1植株，用目的栽培品種對其授粉產(chǎn)生二種類型的BC1子代，那些源自二體F1的子代的1/4是雜合ms-B1Ms-B1，那些源自雙單體F1的子代的1/4是雙單體、雜合ms-B1Ms-B1、半合子Su-B1和ki-B1-a并亦攜帶重組工程化染色體REC-HR1的Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a；(d)種植(c)的所述BC1子代，通過分析染色體配對和通過使用DNA標(biāo)記選擇(c)的二組所述目的植株，再將它們做為母本與目的栽培品種回交四個連續(xù)世代產(chǎn)生二種類型的第五代回交子代(BC5)，通過染色體配對分析和通過使用DNA標(biāo)記在每個世代選擇具有重組工程化染色體REC-HR1的二體類型中的雜合ms-B1Ms-B1su-B1Su-B1Ki-B1ki-B1和雙單體類型中的雜合ms-B1Ms-B1的后代；(e)用(d)的目的二體BC5對(d)的目的雙單體BC5植株授粉，產(chǎn)生二組BC5F2，一組為二體植株，其中1/16是純合ms-B1ms-B1和雜合su-B1Su-B1Ki-B1ki-B1，是目的二體植株，一組為雙單體植株，其中1/16是純合ms-B1ms-B1、半合子su-B1和Ki-B1，并亦攜帶重組工程化染色體REC-HR1的Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-S1-a，因此為雄性可育且是目的重組保持系；(f)種植(e)的所述雙單體BC5F2種子和(e)的二體BC5F2種子，通過染色體配對分析和通過對綠麥隆的反應(yīng)選擇目的雄性可育重組保持系和雄性不育母系；(g)種植二體植株的子代，其全部是純合ms-B1ms-B1并因此為雄性不育，其中1/4是純合su-B1su-B1和Ki-B1Ki-B1，是目的雄性不育母系；和(h)種植(g)的所述二體BC5F3，通過使用DNA標(biāo)記選擇目的雄性不育母系。
本發(fā)明亦提供將普通小麥或硬粒小麥目的栽培品種轉(zhuǎn)化成為雄性不育母本系和用于所述母系的IEC-HC類型的雄性可育改進保持系的方法(
圖18a)，所述方法包含(a)將改進保持系與目的栽培品種雜交，所述保持系為純合ms-B1ms-B1Ki-B1Ki-B1并具有下述改進工程化染色體之一，即或者為IEC-HC1(4SsS/4EL/6SlL、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a)、IEC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a)或者IEC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL、攜帶Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a)，所述栽培品種是純合Ms-B1Ms-B1ki-B1ki-B1；(b)收集(a)雜交的子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生雄性可育F1植株，其全部是雜合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a，其1/4亦攜帶IEC-HC類型的改進工程化染色體，是目的植株；(c)通過種子顏色選擇(b)的所述目的F1植株，用目的栽培品種對其授粉產(chǎn)生BC1子代，其1/16是雜合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a并攜帶IEC-HC類型的改進工程化染色體，是目的基因型；(d)種植(c)的所述BC1植株，通過種子顏色、染色體計數(shù)和通過使用DNA標(biāo)記選擇所述目的基因型，再將它們做為母本與目的栽培品種回交四個連續(xù)世代，產(chǎn)生第五代回交子代(BC5)，通過種子顏色、染色體計數(shù)和通過使用DNA標(biāo)記在每個世代選擇具有IEC-HC類型的改進工程化染色體、雜合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a后代；和(e)自交(d)的目的BC5植株，收集其子代種子，其中一些是藍色、一些是紅/白色，種植所述種子，由此生長BC5F2植株，其1/16是雄性不育并對雄性不育ms-B1和雄配子殺傷Ki-B1等位基因純合，它們源自紅/白色種子并且是目的雄性不育母系，其它具有類似基因型但是源自藍色種子，因此亦具有攜帶Ms、rht、Ba和ki-Sl1-a的IEC-HC類型的改進工程化染色體的BC5F2植株是目的雄性可育改進保持系植株。
本發(fā)明再提供將普通小麥或硬粒小麥目的栽培品種轉(zhuǎn)化成為雄性不育母本系和用于所述母系的IREC-HC類型的雄性可育改進重組保持系的方法(
圖18b)，所述方法包含(a)將具有IREC-HC的保持系做為母本與目的栽培品種雜交，所述保持系為純合ms-B1ms-B1、對6B(對Ki-B1為半合子)和以下改進重組工程化染色體之一為單體IREC-HC1(4SsS/4EL/6SlL/6BL、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a)、IREC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL/6BL、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a)和IREC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL/弦BL、攜帶Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a)，所述栽培品種是純合Ms-B1Ms-B1ki-B1ki-B1；(b)收集(a)雜交的子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生雄性可育F1植株，其全部是雜合ms-B1Ms-B1，其1/2對染色體6B為二體，并因此是雜合Ki-B1ki-B1-a，其1/2對染色體6B和IREC-HC類型的重組工程化染色體為雙單體、對ki-B1-a為半合子，但亦攜帶該重組工程化染色體的Ms、rht和ki-Sl1-a等位基因；(c)通過種子顏色、分析染色體配對和使用DNA標(biāo)記選擇(b)的所述二種類型的F1子代，用目的栽培品種對其授粉，產(chǎn)生二種類型的BC1子代，那些源自二體F1的子代的1/4是雜合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a，那些源自雙單體F1的子代的1/4是雙單體、雜合ms-B1Ms-B1、半合子ki-B1-a，并亦攜帶IREC-HC類型的重組工程化染色體的Ms、rht和ki-Sl1-a等位基因；(d)通過種子顏色、分析染色體配對和通過使用DNA標(biāo)記選擇(c)的二組所述目的植株，再將它們做為母本與目的栽培品種回交四個連續(xù)世代，產(chǎn)生二種類型的第五代回交子代(BC5)，通過種子顏色、染色體配對分析和通過使用DNA標(biāo)記在每個世代選擇具有IREC-HC類型的改進重組工程化染色體的二體類型中的雜合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a和雙單體類型中的雜合ms-B1Ms-B1的后代；(e)用(d)的目的二體BC5對(d)的目的雙單體BC5植株授粉，產(chǎn)生二組BC5F2，一組為二體植株，其1/8是純合ms-B1ms-B1和雜合Ki-B1ki-B1-a，它們源自紅/白色種子，是目的二體植株，一組為雙單體植株，源自藍色種子，其1/8是純合ms-B1ms-B1、半合子Ki-B1，并亦攜帶IREC-HC類型的改進重組工程化染色體的Ms、rht和ki-Sl1-a等位基因，因此為雄性可育且是目的改進重組保持系；和(f)分別種植(e)的所述雙單體BC5F2種子和(e)的二體BC5F2種子，通過染色體配對分析和通過使用DNA標(biāo)記選擇目的雄性可育重組保持系和雄性不育母系。
在本發(fā)明產(chǎn)生保持系或?qū)⒛康脑耘嗥贩N轉(zhuǎn)化成為雄性不育母本系和雄性可育保持系的方法中，通過使用DNA探針在任何一個子代世代中選擇攜帶目的ms-B1等位基因的植株，該探針定位于染色體臂4BS遠端末端，用于標(biāo)記任何突變雄性不育ms-B1等位基因，使得可以選擇攜帶所述突變等位基因的植株?？梢允褂脴?biāo)記4BS次末端區(qū)的任何DNA探針，例如PSR921(M.D.Gale,Cambridge Laboratory,JII,Norwich，英國)。
使用這些DNA標(biāo)記是鑒于這樣一個事實一些已知的突變等位基因涉及4BS的末端缺失，由于產(chǎn)生突變體等位基因ms-B1-c的缺失亦包括這些標(biāo)記的基因座，可以通過這些DNA標(biāo)記的缺失(無標(biāo)記表現(xiàn)型(null phenotyp))容易地鑒別純合植株(ms-B1-c ms-B1-c)。因此，在將顯性正常等位基因純合的植株(Ms-B1Ms-B1)做為母本與做為父本的該突變等位基因雜合的植株(Ms-B1ms-B1-c)雜交時，F(xiàn)1的50％是純合的(Ms-B1Ms-B1)，50％是雜合的(Ms-B1ms-B1-c)。將這些F1植株回交，即用父本(Ms-B1ms-B1-c)授粉，預(yù)期產(chǎn)生的1/8的回交子代(BC1)對ms-B1-cms-B1-c純合。通過使用DNA標(biāo)記鑒別和選擇這些純合的植株。每次增加的回交產(chǎn)生50％的純合隱性子代，可以通過使用上述標(biāo)記選擇該子代。
在本發(fā)明的上述方法中，通過使用DNA探針在任何一個子代世代中選擇攜帶目的ki-Sl1-a等位基因的植株，該探針定位于與6SlL上所述等位基因緊密連鎖的一個基因座，用于標(biāo)記所述等位基因。這種DNA探針的實例是PSR915(M.D.Gale,Cambridge Laboratory,JII,Norwich，英國)。亦通過敗育花粉粒的比例選擇攜帶目的ki-Sl1-a等位基因的植株。
本發(fā)明的再一方面是產(chǎn)生普通小麥或硬粒小麥雜種植株的方法，包含(a)將父本與同一物種的雄性不育母本雜交，其中所述父本選自任何目的普通小麥或硬粒小麥栽培品種，該父本天然地對顯性野生型雄性能育性(Ms-B1)等位基因純合，所述雄性不育母本是所述小麥種的品系，其對任何一個隱性突變體雄性不育(ms-B1)等位基因和顯性雄配子殺傷(Ki-B1)等位基因純合，通過如上述的本發(fā)明的保持系保持所述雄性不育母本；和(b)收集(a)雜交的子代種子，所述種子當(dāng)生長時發(fā)育成為子代雜種植株，所有植株均為雄性可育并對所述突變雄性不育等位基因雜合，即ms-B1Ms-B1。
實施例在以下實施例中，所使用的山羊草屬品系是Aegilops searsiiFeldman & Kislevex Hammer品系，具有Ms-Ss1(雄性可育)、rht-Ss1(較高植株)和SuSs1(綠麥隆抗性)等位基因，本文命名為AES-5，采集于以色列的Yattir,Southern Judea，以及高大山羊草Schweinf.&Muschl.品系，具有ki-Sl1-a(對Ki-B1的雄配子殺傷效應(yīng)敏感)等位基因，本文命名為AEL-1，采集于以色列的Revivim,Central Negev附近。
按照國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達佩斯特條約，AES-5和AEL-1的種子于1998年5月13日保藏于NCIMB Ltd.,Aberdeen,Scotland，英國，保藏號分別是40952和40953。
將在以下非限制性實施例和其附圖中更詳細地描述本發(fā)明。實施例1雜種系統(tǒng)在
圖1中總的描繪了從雄性不育母本和一父本產(chǎn)生雜種種子的三個方案。通過遺傳手段成功產(chǎn)生雜種種子所需的條件如下1)稱為‘A-系’或‘母系’的母本的雄性不育性完全且穩(wěn)定；2)用稱為‘R-系’或‘雄系’的父本完全且穩(wěn)定地恢復(fù)雄性能育性；和3)通過稱為‘B-系’或‘保持系’的雄性可育保持系容易地繁殖母系A(chǔ)-系。產(chǎn)生的F1雜種種子都是雄性可育的?；蛘咄ㄟ^用保持系B-系授粉、通過保持系B-系自交或者通過這二種方法繁殖母系A(chǔ)-系，而保持系自身B-系通過自交保持，自交保持系子代中雄性可育植株的目的比例通過使用鑒定保持系特征的選擇標(biāo)記在每個世代中保持。
用于生產(chǎn)雜交普通小麥或硬粒小麥的這種方案的實例在
圖13、14和15中更具體地顯示。做為雄性不育雌A系使用的是本文命名為cv.‘1’的栽培品種，其具有雄性不育基因，即對染色體4B短臂上的雄性不育隱性突變體等位基因之一純合(ms-B1ms-B1)、對6B長臂上的顯性雄配子殺傷等位基因(Ki-B1)純合。已描述了三個這種雄性不育等位基因(綜述于Wilson和Driscoll,1983)。這些等位基因是‘Pugsley’(Pugsley和0ram,1959-自發(fā)出現(xiàn)；ms-B1-a)、‘Probus’(Fossati和Ingold,1970-X射線誘導(dǎo)；ms-B1-b)和‘Cornerstone’(Driscoll,1977-伽嗎射線誘導(dǎo)；ms-B1-c)。等位基因ms-B1-b和ms-B1-c是末端缺失。我們先前或者通過伽嗎輻射或者通過用甲磺酸乙酯((EMS)處理誘導(dǎo)了幾種另外的突變體等位基因。憑借在這些突變體中在4BS上存在末端C帶，將EMX處理的突變體與Ms-B1基因座的各種缺失區(qū)分開來。諸如位于4BS遠端區(qū)的Xpsr921的DNA標(biāo)記不存在于ms-B1-c和幾個我們的伽嗎輻射突變體(亦有可能ms-B1-b)中，即它位于缺失的節(jié)中，其不存在可以標(biāo)記所述缺失的純合性。存在于栽培品種中國春中的Ki-B1等位基因位于染色體6B長臂上，距著絲粒約50cM(Loegering和Sears，1963)。諸如Xpsr915的DNA標(biāo)記與ki-B1等位基因緊密地連鎖。當(dāng)由攜帶EC-HR類型的工程化染色體的保持系保持雄性不育母系時，該母系亦應(yīng)對隱性綠麥隆敏感等位基因su-B1純合。存在于普通小麥栽培品種中國春和幾種其它基因型的四倍體小麥中的該等位基因位于染色體6B長臂，距著絲粒約0.5cM(Snape等，1991)。
保持系B-系是與A-系相同的栽培品種，即cv.‘1’，它對存在于A-系中相同的ms-B1和Ki-B1等位基因純合，但具有一條附加的EC-H類型的異源工程化染色體(圖2a)，該染色體由Aegilopssearsii的4SsS(其攜帶顯性雄性能育性等位基因Ms-Ss1和使得植株較高的顯性或半顯性rht-Ss1等位基因)和高大山羊草的6SlL(攜帶隱性雄配子殺傷等位基因ki-Sl1-a，使得攜帶它的花粉粒易被普通小麥或硬粒小麥的Ki-B1等位基因殺傷)組成。由于存在ki-Sl1-a，該異源工程化染色體不通過花粉粒傳遞。因此，用保持系(B-系)對雄性不育母系(A-系)授粉產(chǎn)生子代，所有的子代都與母系相同并且為雄性不育(
圖13a)。另一方面，保持系自花授粉產(chǎn)生80％的雄性不育和20％雄性可育后代(
圖13a)。由于在該工程化染色體中存在rht-Ss1等位基因，保持系的雄性可育后代比雄性不育后代高6-8cm。這種高度差利于用聯(lián)合收割機選擇性收獲雄性可育后代，由此在每個世代中保持自交保持系子代中雄性可育植株的比例恒定。
一個替代保持系B-系是與A-系相同的栽培品種，即cv.‘1’，它對存在于A-系中相同的ms-B1、su-B1和Ki-B1等位基因純合，但具有一條附加的EC-HR類型的異源工程化染色體(圖2b)，該染色體由Aegilops searsii的4SsS(攜帶顯性雄性能育性等位基因Ms-Ss1和顯性或半顯性rht-Ss1等位基因)和Aegilops slongissima的6SlS(攜帶顯性綠麥隆抗性等位基因Su-Ss1，已發(fā)現(xiàn)它賦予對該除草劑的出色抗性并從Ae.searsii的6SsL轉(zhuǎn)移至高大山羊草的6SlL，還攜帶隱性雄配子殺傷等位基因ki-Sl1-a，它使得攜帶它的花粉粒易被普通小麥或硬粒小麥的Ki-B1等位基因殺傷)組成。由于存在ki-Sl1-a，該異源工程化染色體不通過花粉粒傳遞。因此，用保持系(B-系)對雄性不育母系(A-系)授粉產(chǎn)生子代，所有的子代都與母系相同并且為雄性不育(
圖14a)。另一方面，保持系自花授粉產(chǎn)生80％的雄性不育和20％雄性可育后代(
圖14a)。由于在該工程化染色體中存在Su-Ss1等位基因，保持系的雄性可育后代對除草劑綠麥隆和其它苯脲衍生物具有抗性，而雄性不育后代則對其敏感。該抗性利于在每個世代中殺死自交保持系子代中缺乏該工程化染色體的敏感苗。
或者，保持系可以與A-系相同，但對染色體6B為單體，即它對ms-B1純合、對Ki-B1為半合子，并具有一條REC-H類型的重組工程化染色體(圖2c)，該染色體由Aegilops searsii的4SsS(其攜帶顯性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1)、高大山羊草的6SlL(攜帶隱性雄配子殺傷等位基因ki-Sl1-a，使得攜帶它的花粉粒易被普通小麥或硬粒小麥的Ki-B1等位基因殺傷)和與天然單條6B染色體同源區(qū)規(guī)則配對的染色體臂6BL的遠端區(qū)組成。重組工程化染色體REC-H與6B的規(guī)則配對確保平均分離，由此使之被包含于50％的配子中。由于存在ki-Sl1-a，該重組工程化染色體不通過花粉粒傳遞。因此，用該重組保持系對雄性不育母系(A-系)授粉產(chǎn)生子代，所有的子代都與母系相同并且雄性不育。另一方面，該重組保持系自花授粉產(chǎn)生1/2的雄性不育和1/2雄性可育后代(
圖13b)。
雄性可育后代具有rht-Ss1等位基因，比雄性不育后代高6-8cm，因此可以分別收獲。這在每個世代中保持自交保持系子代中雄性可育植株的比例恒定。
另一種保持系可以與A-系相同，但對染色體6B為單體，即它對ms-B1純合、對su-B1和Ki-B1為半合子，具有一條REC-HR類型的重組工程化染色體(圖2d)，該染色體由Aegilops searsii的4SsS(其攜帶顯性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1)、高大山羊草的6SlL(攜帶顯性綠麥隆抗性等位基因Su-Ss1-a等位基因，它從Ae.searsii的6SsL轉(zhuǎn)移至至高大山羊草的6SlL，還攜帶隱性雄配子殺傷等位基因ki-Sl1-a，它使得攜帶它的花粉粒易被普通小麥或硬粒小麥的Ki-B1等位基因殺傷)和與天然單條6B染色體同源區(qū)規(guī)則配對的染色體臂6BL的遠端區(qū)組成。重組工程化染色體REC-HR與6B的規(guī)則配對確保平均分離，由此使之被包含于50％的配子中。由于存在ki-Sl1-a，該重組工程化染色體不通過花粉粒傳遞。因此，用該重組保持系對雄性不育母系(A-系)授粉產(chǎn)生子代，所有的子代都與母系相同并且雄性不育。另一方面，該重組保持系自花授粉產(chǎn)生1/2的雄性不育和1/2雄性可育后代(
圖14b)。
雄性可育后代具有Su-Ss1等位基因，對綠麥隆抗性。對保持系小區(qū)施用該除草劑將殺死所有的缺少該工程化染色體的雄性不育后代，僅留下雄性可育保持系植株。
其它保持系含有一條IEC-HC類型的改進工程化染色體(圖3a、4a和5a)，該染色體除攜帶Ms、rht和ki-Sl1-a等位基因之外，還攜帶做為選擇標(biāo)記的、賦予種子藍色的藍糊粉(Ba)等位基因。產(chǎn)生了三種類型的這種改進工程化染色體(1)IEC-HC1，由4SsS(攜帶Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因)、4EL(攜帶Ba-E1等位基因)和6SlL(攜帶ki-Sl1-a)組成；(2)IEC-HC2，由4SsS(攜帶Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因)、4AmL(攜帶Ba-Am1等位基因)和6SlL(攜帶ki-Sl1-a)組成；(3)IEC-HC3，由4AmS(攜帶Ms-Am1和rht-Am1等位基因)、4AmL(攜帶Ba-Am1等位基因)和6SlL(攜帶ki-Sl1-a)組成。由于存在ki-Sl1-a，所述改進工程化染色體不通過花粉粒傳遞。因此，用保持系(B-系)對雄性不育母系(A-系)授粉產(chǎn)生子代，所有的子代都與母系相同并且雄性不育(
圖15a)。另一方面，保持系自花授粉產(chǎn)生80％的雄性不育和20％雄性可育后代(
圖15a)。由于存在Ba等位基因，可以通過分選裝置分離紅/白色種子和藍色種子，紅/白色種子生長時發(fā)育成為雄性不育植株，藍色種子生長時發(fā)育成為雄性可育植株。因此，在每個世代中僅種植藍色種子確保所有的保持系植株都是雄性可育。
分離保持系的生長時發(fā)育成為雄性不育植株(A-系)紅/白色種子與生長時發(fā)育成為雄性可育系(B-系)(
圖1b和15a)的可能性提供了替代的優(yōu)選方法，以直接從自交保持系的子代得到雄性不育母系的種子。此方法顯著降低了母系種子的生產(chǎn)成本。
其它保持系含有一條IREC-HC類型的改進重組工程化染色體(圖3b、4b和5b)，該改進染色體長臂上攜帶染色體臂6BL的末端節(jié)，該節(jié)與該保持系中做為單體附加存在的天然6B染色體規(guī)則地配對。這種配對確保所述改進重組工程化染色體在減數(shù)分離期間規(guī)則分離，由此使之被包含于50％的配子中。由于存在ki-Sl1-a,IREC不通過花粉粒傳遞。因此，用改進重組保持系(B-系)對雄性不育母系(A-系)授粉產(chǎn)生子代，所有的子代都與母系相同并且雄性不育(
圖15b)。另一方面，重組保持系自花授粉產(chǎn)生50％的雄性不育和50％雄性可育后代(
圖15b)。由于存在Ba等位基因，可以通過分選裝置分離紅/白色種子和藍色種子，因此，在每個世代中僅種植藍色種子確保所有的保持系植株都是雄性可育。
在許多其它禾本科植物中和在小麥中，減數(shù)分裂時單價(未配對)染色體的著絲粒有時進行橫斷分裂(錯分裂)而不是正常的縱裂，導(dǎo)致單價染色體斷裂成為二條具端著絲粒染色體或等臂染色體。單體或單體附加植株即在減數(shù)分裂是具有單價染色體的植株中此事件的頻率通常較低(幾個百分點)。由于EC-H、EC-HR和IEC-HC類型的EC做為單體附加存在于保持系中，它在減數(shù)分裂時保持未配對，保持系的自交子代可能有僅具有EC的一條臂的植株。具有長臂ECL(攜帶Ba和ki-Sl1-a)的植株將是雄性不育的。另一方面，具有短臂ECS(攜帶Ms和rht等位基因)的植株將是雄性可育的。由于具有ECS的植株未攜帶ki-Sl1-a等位基因，具有ECS的雄配子可以有功能，或者通過對雌株授粉或者通過自交而由此污染母系。在EC-HR的情況下，具有EC的短臂而缺少長臂的植株對綠麥隆敏感，可以通過對自交保持系的子代施用該除草劑而被選擇。在IEC-HC的情況下，具有EC的短臂而缺少長臂的植株產(chǎn)生紅/白色種子，可以通過分選裝置在自交保持系的子代中從藍色種子分離。
另一方面，REC-H和IREC-HC類型的重組工程化染色體在減數(shù)分裂時與天然6B染色體規(guī)則地配對，因此其著絲粒在第二次減數(shù)分裂后期僅進行縱裂，不形成具端著絲粒染色體，母系不受雄性可育植株污染。
為增加自交改進重組保持系中生長時發(fā)育成為雄性不育植株的種子的比例，有必要將所述改進重組保持系自交，并將子代種子再生長一個季節(jié)。此方法中(如
圖15b描繪)目的種子的數(shù)量可以超過70％。在具有IREC-HC類型的改進重組保持系中，可以進行二步選擇首先收獲高植株(攜帶具有rht等位基因的IREC-HC)。在第二次收獲中收獲矮植株，用種子分選機基于種子的顏色分離它們的種子。紅/白色種子缺少IREC-HC，當(dāng)生長時，發(fā)育成為雄性不育母系。
父本(R-系，cv.‘2’)是任何正常的普通小麥或硬粒小麥栽培品種，其天然對雄性能育性Ms-B1等位基因純合，并且或者對顯性Ki-B1等位基因或者對隱性ki-B1等位基因之一(ki-B1-a或ki-B1-n)純合。
因此，通過示于
圖13a-b、14a-b和15a-b的流程，快速和有效地生產(chǎn)做為F1子代的普通小麥或硬粒小麥的雜種種子，其全部對雄性不育等位基因雜合(Ms-B1ms-B1)并因此為雄性可育。迄今為止，所有用做父本的栽培品種都可以完全恢復(fù)F1雜種的雄性能育性。實施例2測試普通小麥ms-B1ms-B1基因型中由單份Aegilops searsii的雄性能育性等位基因Ms-Ss1帶來的雄性能育性的表達為測試上述雜種生產(chǎn)系統(tǒng)和雄性不育母本(A-系)保持的可行性，首先有必要產(chǎn)生異源單體附加系，其中將Aegilops searsii的染色體4Ss附加至對雄性不育等位基因ms-B1-c純合的普通小麥的全套染色體中。這通過將二體4Ss附加系(源自Aegilops searsii acc.TE-10與普通高稈小麥栽培品種中國春的雜交，由Soil and CropScience,Texas A&M University,College Station,Texas的G.Hart教授友好地提供)與半矮普通小麥栽培品種Gamenia的ms-B1-cms-B1-c Rht1Rht1rht2rht2雄性不育基因型(澳大利亞AustralianWinter Cereal Collection,RRM944,Calala Lane,Tamworth,NSW2340的管理者M.MacKay博士友好地提供)雜交而進行，所述二體附加系對Ms-B1、rht1和rht2純合、攜帶二份Ms-Ss1和rht-Ss1。得到的F1植株均為雜合Ms-B1ms-B1-c，并攜帶一條具有Ms-Ss1等位基因的附加的4Ss染色體。將這些植株自交，選擇對ms-B1-c純合的F2植株(由DNA標(biāo)記的表現(xiàn)型標(biāo)明)。如預(yù)期的那樣，所有的整倍體純合ms-B1-cms-B1-c都是雄性不育的，但那些具有攜帶Ms-Ss1的一條附加4Ss染色體的純合植株全都是雄性可育的，表明Ms-Ss1對二份ms-B1-c的完全顯性。實施例3測試對降低高度等位基因Rht1或Rht2純合的普通小麥植株與等基因但具有攜帶rht-Ss1等位基因的Ae.searsii的染色體4Ss的植株之間的高度差異Aegilops searsii是矮高度植物。然而它含有促進增進高度的rht-Ss1等位基因。該等位基因與位于第4組染色體短臂上、距著絲粒約15cM的普通小麥rht等位基因近同源等位(McIntosh,1993)。所述rht-Ss1與位于4SsS末端區(qū)的雄性能育性Ms-Ss1等位基因連鎖。因為在正常普通小麥背景中，染色體4Ss不與其小麥部分同源染色體配對，所以rht-Ss1和Ms-Ss1等位基因在異源工程化染色體的不同類型中都永久性地連鎖。該工程化染色體上存在rht-Ss1等位基因可以促進植株較高，因此可以做為選擇標(biāo)記等位基因，便利于保持系雄性可育后代的差異收獲，即收獲那些攜帶工程化染色體的后代。這將在每個世代中在自交保持系的子代中保持雄性可育植株的比例恒定。
為測試rht-Ss1對Rht等位基因之一純合的普通小麥植株高度的影響，我們將二體4Ss附加系與半矮普通小麥栽培品種Gamenia雜交，在實施例2中對這二者都進行了描述。產(chǎn)生的F1植株都是對Rht等位基因之一雜合并攜帶具有rht-Ss1等位基因的一條附加的4Ss染色體。將這些植株自交，選擇對Rht或者純合或者雜合的F2植株(由植株高度標(biāo)明)。所有的整倍體植株都比那些具有攜帶rht-Ss1等位基因的附加4Ss染色體的植株矮(平均矮6-8cm)，表明半矮普通小麥基因型中rht-Ss1的存在促進較高植株的高度，其可以做為選擇標(biāo)記使用。實施例4測試綠麥隆對綠麥隆敏感等位基因su-B1純合的普通小麥植株和對等基因且亦具有攜帶顯性抗性等位基因Su-Ss1的工程化染色體的植株的影響普通小麥的不同栽培品種顯示對除草劑綠麥隆和尿素的其它苯基衍生物不同的反應(yīng)；幾個攜帶顯性等位基因Su-B1的栽培品種(例如，Cappelle Desprez)是抗性的，而其它攜帶隱性等位基因su-B1的栽培品種(例如，中國春)是敏感的(Snape等，1991)。該基因位于染色體6B的長臂(6BL)上，距著絲粒約0.5cM。二倍體山羊草屬物種(其基因組與小麥的B基因組緊密相關(guān))的不同品系亦展示對綠麥隆的不同反應(yīng)；雖然絕大多數(shù)品系對該除草劑敏感，Ae.searsii的一個品系對該化合物有抗性。由于Ae.searsii的染色體6SsL幾乎規(guī)則地與高大山羊草的6SlL配對，可以將抗性等位基因轉(zhuǎn)移至工程化染色體EC-H的6SlL臂(圖8a、b)，由此產(chǎn)生EC-HR類型的工程化染色體。由于染色體臂4SsS和6SsL在正常普通小麥背景中不與它們的小麥部分同源染色體配對，所以Su-Ss1等位基因永久性地與工程化染色體的其它等位基因即Ms-Ss1、rht-Ss1和Ki-Sl1-a連鎖。工程化染色體上存在綠麥隆抗性等位基因利于選擇性地在自交保持系的子代的每個世代中殺死缺少該工程化染色體的雄性不育植株，而不影響雄性可育保持系植株(具有該工程化染色體)。這將確保在每個世代中僅自交保持系的雄性可育后代可以生長。
為測試綠麥隆對各種基因型的影響，我們以二倍于商業(yè)小區(qū)推薦的比率將該除草劑噴灑于對除草劑敏感等位基因su-B1純合的普通小麥和攜帶綠麥隆抗性等位基因Su-Ss1的Ae.searsii品系的植株。所有攜帶隱性su-B1等位基因的植株在噴灑后10-14天內(nèi)死亡，而那些攜帶顯性Su-Ss1等位基因的植株存活。實施例5藍糊粉對種子顏色的影響和藍色種子和紅/白色種子之間的分離普通小麥或硬粒小麥的種子顏色是紅色或白色；紅色是由于種皮中色素的存在。幾個與普通小麥或硬粒小麥相關(guān)的物種有藍色種子品系，這些物種例如一粒小麥、長穗鵝冠草、A.glaucum、A.tricophorum、A.junceum、Secale montanum、黑麥(Secale cereale和Hordeum spontaneum。藍色色素是由于在胚乳的三倍體糊粉層中產(chǎn)生花色素苷(有關(guān)綜述參見Zeven,1991)。藍色素表明糊粉的基因型，該現(xiàn)象已知為異粉性，即用藍糊粉植株對紅/白色種子的植株授粉產(chǎn)生藍色種子。藍色由藍糊粉(Ba)等位基因(在Keppenne和Baenziger1990，按照小麥基因符號共同頒布者R.A.McIntosh博士命名)決定，該等位基因位于一粒小麥染色體4Am或E.pontica的4E的長臂上(Zeven,1991)。大麥中Ba基因座(命名為B1)位于染色體4H的長臂上，距著絲粒29cM(Grain Genes數(shù)據(jù)庫，ref:BCN-25-93)。因此，基于小麥科(Triticeae)物種中存在的基因syntheny，設(shè)想在一粒小麥和E.pontica中該基因亦位于距著絲粒大約相同的距離。普通小麥的4Am或4E單體附加系的種子是藍色的，表明Ba等位基因完全顯性。該等位基因有劑量效應(yīng)，由顏色的強度度揭示三份Ba產(chǎn)生深藍色種子，二份(由該等位基因通過雌配子傳遞形成)產(chǎn)生中等藍色種子，而一份(由該等位基因通過雄配子傳遞造成)產(chǎn)生淺藍色種子。植株生長的環(huán)境(例如灌漿期干燥和溫暖條件)以及植株的遺傳背景可以降低Ba等位基因的表達，導(dǎo)致具有一份Ba的種子的一些錯分類。具有二份或三份Ba的種子一向分類正確。將或者為Ba-E1或者為Ba-Am1的Ba等位基因易位至原先不與其小麥部分同源染色體配對的異源重組工程化染色體。因此，可以將與Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因或與Ms-Am1和rht-Am1等位基因以及與ki-Sl1-a等位基因永久連鎖的Ba等位基因用做優(yōu)秀的選擇標(biāo)記。通過使用分選裝置(例如Sortex 5000)將藍色種子與紅/白色種子分離。它可以用于分離大量的種子，因此可以用于商業(yè)應(yīng)用。實施例6測試由普通小麥顯性雄配子殺傷等位基因Ki-B1殺傷攜帶ki-Sl1-a的花粉Loegering和Sears(1963)發(fā)現(xiàn)普通小麥栽培品種中國春的染色體臂6BL攜帶殺傷栽培品種Timstein的具有隱性ki等位基因(=ki-B1-a)的花粉粒的顯性雄配子殺傷等位基因。在用二個測試品系中國春和Timstein雜交幾個普通小麥栽培品種時，他們發(fā)現(xiàn)了雄配子殺傷基因基因座有至少三個等位基因顯性Ki(=Ki-B1)、隱性ki(=ki-B1-a)和中性(=ki-B1-n)等位基因。
由于該顯性等位基因僅殺傷花粉而不殺傷卵細胞，可以將它用于阻斷攜帶異源顯性雄性不育等位基因Ms-Ss1的花粉的傳遞。這需要在Ms-Ss1和ki-B1-a等位基因之間建立永久連鎖。可以通過構(gòu)建攜帶這二個等位基因并且一般不與其小麥部分同源染色體配對的異源染色體達到這種連鎖。構(gòu)建這種工程化染色體的必要條件是在一個小麥的野生親緣之一中隱性雄配子殺傷等位基因的可獲得性。
在中國春的背景中產(chǎn)生一系列高大山羊草附加系的同時，本發(fā)明人注意到高大山羊草的6號染色體(6Sl)僅在缺乏染色體6B的植株中通過花粉傳遞。在6Sl單體附加系中在用Alexander試劑(StainTechnology,44:117)染色的花粉中分析花粉敗育，顯示約20％的敗育花粉粒，可假定是那些攜帶6Sl染色體的花粉粒，而在6SlS單末端體附加系中僅觀察到2-3％敗育花粉。在自交單體附加植株的子代中未發(fā)現(xiàn)二體附加植株。這表明雖然6Sl通過卵細胞的傳遞未受影響，但存在6B時(即存在Ki-B1時)6Sl通過花粉的傳遞完全被阻斷。假定高大山羊草的幾個增加的染色體6Sl攜帶隱性雄配子殺傷等位基因(本文命名為ki-Sl1-a)，攜帶它的花粉粒易被普通小麥的Ki-B1等位基因殺傷。實施例7構(gòu)建包含攜帶Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因的4SsS和攜帶ki-Sl1-a等位基因的6SlL的工程化染色體EC-H1以單份存在于普通小麥中的或者天然或者異源染色體，如在單體或單體附加系中，在減數(shù)分裂時可以以低頻率進行著絲粒錯分裂，即著絲粒的橫分裂而不是縱分裂，導(dǎo)致產(chǎn)生一條或二條穩(wěn)定的具端著絲粒染色體。如果均以單份存在的二條非同源染色體同時進行錯分裂，則產(chǎn)生的不同染色體的具端著絲粒染色體可以融合產(chǎn)生易位染色體(Sears,1972)。這種著絲粒融合的頻率從小于1％(Sears,1972)至超過23％(Lukaszewski,1993)變化。
我們在構(gòu)建工程化染色體4SsS/6SlL中利用了這一現(xiàn)象。用攜帶Ms-Ss1和rht-Ss1的4Ss二體附加系對攜帶ki-Sl1-a的單體6Sl附加系授粉，產(chǎn)生具有染色體4Ss的F1子代，其1/4亦具有染色體6Sl，即雙單體附加系。通過使用DNA探針PSR921和PSR915分別確認(rèn)了這些植株中4Ss和6Sl的存在。
得到約2000個F2植株，首先通過染色體計數(shù)篩選。將單體附加即那些具有2n=43的苗通過DNA標(biāo)記進行進一步的篩選，以去除那些具有或者4SsL或者6SlS的苗。發(fā)現(xiàn)幾個植株具有4SsS和6SlL。C-帶分析確認(rèn)目的著絲粒融合的存在。
如所預(yù)期的，該染色體不通過花粉粒傳遞，由那些攜帶所述工程化染色體做為單體附加系的植株對整倍體植株授粉僅產(chǎn)生整倍體子代，而單體附加系自交產(chǎn)生的約20％的苗具有43條染色體。實施例8構(gòu)建包含攜帶Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因的4SsS和攜帶Su-Ss1 ki-Sl1-a等位基因的6SlL的工程化染色體EC-HR1為構(gòu)建工程化染色體EC-HR1，將顯性綠麥隆抗性等位基因Su-Ss1從選擇的Ae.searsii品系的染色體臂6SsL轉(zhuǎn)移至工程化染色體EC-H1的6SlL中。這通過雜交源自普通小麥栽培品種中國春中的雄性可育保持系的雄性可育母本完成。該母本對ms-B1、su-B1和Ki-B1等位基因純合，并具有做為單體附加的工程化染色體EC-H1(4SsS/6Sl)，該染色體在其短臂上攜帶Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因、在其長臂上攜帶su-Sl1ki-Sl1-a等位基因，與其雜交的是二倍體物種Ae.searsii品系，其在染色體6Ss長臂上即在6SsL上攜帶綠麥隆抗性等位基因、在4SsS上攜帶Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因。約20％的F1子代具有工程化染色體EC-H1，因此具有2n=29染色體，可以與其它2n=28的F1植株區(qū)分。具有工程化染色體的F1植株在第一減數(shù)分裂中期時由于工程化染色體(4SsS/6SlL)與Ae.searsii的染色體臂4SsS和6SsL配對而展示26條單價染色體(26’)和一條三價染色體(1”’)。由于EC的4Ss與Ae.searsii的4SsS配對不改變6SlL與6SsL之間EC短臂的等位基因構(gòu)成，在著絲粒和Su基因座之間交換(cross)和Su與ki位點之間的第二次交換之后，產(chǎn)生了目的EC-HR1染色體。用su-B1純合的中國春對2n=29的F1植株授粉一次或二次，產(chǎn)生了2n=43(21”+1’)、具有做為單體附加的目的工程化染色體EC-HR1的植株。向自交單體附加植株的子代施用綠麥隆殺死了2n=42的所有植株(缺少EC-HR1并因此缺少綠麥隆抗性等位基因)，僅那些2n=43即那些攜帶EC-HR1的植株未受影響。實施例9通過著絲粒融合構(gòu)建異源染色體4SsS/4EL和4SsS/4AmL我們亦利用著絲粒融合現(xiàn)象產(chǎn)生具有4SsS/4EL和4SsS/4AmL構(gòu)成的異源染色體。用純合ms-B1ms-B1Ki-B1Ki-B1并攜帶Ms-Ss1和rht-Ss1的4Ss二體附加系對具有雜合Ms-B1ms-B1Ki-B1Ki-B1并附加攜帶Ba-E1等位基因的4E單體的普通小麥附加系授粉，產(chǎn)生具有染色體4Ss的F1子代，其1/4亦具有染色體4E，即雙單體附加。分別通過藍色種子和通過DNA標(biāo)記確認(rèn)了4E和4Ss在這些植株中的存在。選擇藍色F2種子(在F1植株上)，將其萌發(fā)，并通過染色體計數(shù)選擇目的植株。通過DNA標(biāo)記對單體附加(2n=43)進行進一步的篩選，以去除那些具有染色體臂4SsL或4ES的植株。發(fā)現(xiàn)幾個植株具有4Ss和4EL。C-帶分析確認(rèn)了目的著絲粒融合的存在。在產(chǎn)生4SsS/4AmL中，我們用二體(4B)4Am置換系對4Ss單體系授粉，在F1中選擇三單體組合單體4B、4Ss和4Am雙單體附加。將選擇的F1植株自交，產(chǎn)生雙單體4Ss和4Am附加。通過DNA標(biāo)記和藍色種子顏色確認(rèn)了4Ss和4Am在這些植株中的存在。
萌發(fā)藍色F2種子(在F1植株上)，通過染色體計數(shù)篩選苗。選擇單體(2n=43)附加，并通過DNA標(biāo)記進一步篩選，以去除具有4SsL或4AmS的植株。發(fā)現(xiàn)幾個植株具有4SsS和4AmL。C-帶分析確認(rèn)了存在目的著絲粒融合染色體。實施例10包含4SsS(攜帶Ms-Ss1和rht-Ssl)、6SlL(攜帶ki-Sl1-a)和6BL的遠端區(qū)的重組工程化染色體REC-H1的產(chǎn)生存在普通小麥Ph1基因時部分同源染色體臂6BL和6SlL不配對。該顯性等位基因位于染色體5B的長臂上，它防止部分同源染色體配對，而允許同源染色體規(guī)則配對。通過X射線輻射栽培品種中國春在此基因座誘導(dǎo)隱性突變(ph1b)，該突變在純合條件下不抑制部分同源配對(Sears,1977)。使用該突變誘導(dǎo)部分同源配對和6BL與6SlL之間的重組。
用突變體品系ph1bph1b對其中高大山羊草的一對染色體6Sl置換了普通小麥栽培品種中國春的一對染色體6B的二體6Sl(6B)置換系授粉。將6B單體-6Sl單體置換和雜合Ph1ph1b的F1雜種做為母本與所述突變體品系回交，通過使用DNA探針WPG90(該探針由我們制備，如有需要可以提供)選擇ph1b純合的雙單體。用雙末端體6BS品系對這些被選擇的BC1子代植株授粉產(chǎn)生子代，一些子代是單末端體6BS并對重組染色體6Sl/6BL為單體，即該重組染色體包含6Sl的短臂、6Sl長臂的近端區(qū)和6BL的遠端區(qū)(易位斷點距6SlL上ki-Sl1-a的基因座遠端)。通過缺乏與6BS配對和通過位于6SlL上、距ki-Sl1-a遠端的DNA標(biāo)記以及6BL遠端區(qū)的DNA標(biāo)記對該易位染色體進行選擇。將此單末端體6BS-單體6Sl/6BL和顯性雄性能育性等位基因Ms-B1純合、缺少Ki-B1、半合子ki-Sl1-a的選定基因型做為父本，與攜帶做為單體附加的工程化染色體EC-H1(參見實施例6)的品系雜交。一些子代是三單體，即對6B、4SsS/6SlL和6Sl/6BL為單體，在這些植株中使用DNA標(biāo)記選擇雜合ms-B1-c Ms-B1 Ms-Ss1和Ki-B1ki-Sl1-a。在這些被選擇的子代植株中，在這二條易位染色體的6Sl的近端區(qū)發(fā)生配對，導(dǎo)致產(chǎn)生重組工程化染色體REC-H1(4SsS/6SlL/6BL)。該選擇的子代的自交產(chǎn)生有具有6B和REC-H1的雙單體植株，它們是純合ms-B1-c ms-B1-c、半合子Ki-B1和ki-Sl1-a。
類似地，將選定的單末端體6BS-單體6Sl/6BL做為父本與攜帶做為單體附加的改進工程化染色體IEC-HC1、IEC-HC2和IEC-HC3的品系雜交。每個雜交的一些子代是三單體，即對6B、6Sl/6BL和改進工程化染色體為單體，在這些植株中使用DNA標(biāo)記選擇雜合ms-B1Ms-B1和Ki-B1Ki-B1。在這些被選擇的植株中，在這二條易位染色體的6Sl的近端區(qū)發(fā)生配對，導(dǎo)致產(chǎn)生改進重組工程化染色體IREC-HC1(4SsS/4EL/6SlL/6BL)、IREC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL/6BL)和IREC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL/6BL)。所述選擇的植株的自交產(chǎn)生有具有6B和改進重組工程化染色體的雙單體植株，它們是純合ms-B1-cms-B1-c、羊合子Ki-B1和ki-Sl1-a。實施例11包含4SsS(攜帶Ms-Ss1和rht-Ss1)、6SlL(攜帶Su-Ss1和ki-Sl1-a)和6BL的遠端區(qū)的重組工程化染色體REC-HR1的產(chǎn)生通過將攜帶重組工程化染色體REC-H1的單體附加系與攜帶綠麥隆抗性等位基因Su-Ss1的Ae.searsii品系雜交，選擇具有25’+1”的F1植株，并用中國春對它們授粉完成REC-HR1的制備(與實施例8類似)。實施例12制備改進工程化染色體IEC-HC1(4SsS/4EL/6SlL)、IEC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL)和IEC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL)制備這些改進工程化染色體涉及產(chǎn)生6SlL的遠端區(qū)(攜帶ki-Sl1-a等位基因)與著絲粒融合染色體的4EL或4AmL部分同源區(qū)之間的末端易位互換。易位斷點位于4EL或4AmL的Ba等位基因(距著絲粒約30cM)與6SlL的ki-Sl1-a等位基因(距著絲粒約50cM)之間。
在幾種情況下，通過使用X射線或熱中子輻射種子或花粉粒誘導(dǎo)末端易位(有關(guān)綜述參見Keppenne和Baenziger,1990；Sharma和Knott,1966)。熱中子在誘導(dǎo)易位方面更有效，并且不引起萌發(fā)減少。
對著絲粒融合染色體4SsS/6SlL為單體附加(參見實施例6)、對ms-B1和Ki-B1等位基因純合、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a的植株由以下之一授粉，(ⅰ)融合染色體4SsS/4EL或4SsS/4AmL單體附加、ms-B1和Ki-B1純合并分別攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1和Ba-E1或Ba-Am1，或(ⅱ)4Am單體附加并亦攜帶Ms-Am1、rht-Am1和Ba-Am1。根據(jù)親本的組合，F(xiàn)1子代亦具有二體S附加和雙單體L附加4SsS/6SlL+4SsS/4EL、4SsS/6SlL+4SsS/4AmL或4SsS/6SlL+4Am。選擇了大量的藍色種子并用1013Nthcm-2的熱中子輻射。萌發(fā)處理的種子，通過染色體計數(shù)和通過DNA標(biāo)記選擇單體附加。使這些植株自交，在其子代中選擇藍色種子，所述種子生長時發(fā)育成為雄性可育植株，所有的植株都攜帶目的易位。實施例13將目的普通小麥或硬粒小麥栽培品種轉(zhuǎn)化成為雄性不育母系和具有或者EC-H、EC-HR或者IEC-HC的保持系在
圖16a、17a和18a中圖解描述了將目的普通小麥栽培品種轉(zhuǎn)化成為雄性不育母本系和保持系的程序，其中現(xiàn)有的母系和保持系的等位基因互補物被目的栽培品種的等位基因互補物取代，以提供具有目的栽培品種等位基因互補物的雄性不育母系和保持系或改進保持系。
在此程序中，用純合Ms-B1Ms-B1和ki-B1-aki-B1-a純合的目的栽培品種對具有EC-H1、EC-HR1或一種類型的IEC-HC的保持系授粉，該保持系對隱性雄性不育等位基因ms-B1-c和對顯性雄配子殺傷等位基因Ki-B1純合、具有做為單體附加的攜帶顯性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1以及隱性雄配子殺傷等位基因ki-Sl1-a的異源工程化染色體4SsS/6SlL(在EC-HR1的情況下亦攜帶Su-Ss1等位基因)、或分別攜帶顯性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1、顯性藍糊粉Ba-E1和隱性雄配子殺傷等位基因ki-Sl1-a,Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a等位基因或Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a等位基因的改進工程化染色體4SsS/4EL/6SlL、4SsS/4AmL/6SlL或4AmS-4AmL/6SlL。F1雜種均對雄性不育等位基因Ms-B1m-B1-c和對雄配子殺傷等位基因Ki-B1ki-B1-a雜合，一些亦攜帶工程化染色體。選擇這些植株并用目的栽培品種再次授粉產(chǎn)生BC1子代，其1/4為雜合Ms-B1ms-B1-cKi-B1ki-B1-a，其一部分亦具有工程化染色體。通過染色體計數(shù)選擇單體附加苗(即選擇具有2n=43的苗)。通過使用DNA標(biāo)記和子代測試確定這二個基因座的雜合性。將所選擇的子代植株做為雌株與目的栽培品種進一步回交四個連續(xù)世代，產(chǎn)生第五代回交子代(BC5)。在每個世代如對BC1子代所述分析子代，選擇雜合Ms-B1ms-B1-cKi-B1ki-B1-a、具有做為單體附加的工程化染色體的植株。BC5自交產(chǎn)生子代，其3/64是純合m-B1-cms-B1-cKi-B1Ki-B1，是目的雄性不育母系。所述子代的另一組(1/80)具有類似的基因型并具有工程化染色體，是目的保持系。實施例14將目的普通小麥或硬粒小麥栽培品種轉(zhuǎn)化成為雄性不育母系和具有或者REC-H、REC-HR或者IREC-HC的重組保持系在
圖16b、17b和18b中圖解描述了將目的普通小麥栽培品種轉(zhuǎn)化成為雄性不育母本系和重組保持系的程序，其中現(xiàn)有的母系和保持系的等位基因互補物被目的栽培品種的等位基因互補物取代，以提供具有目的栽培品種等位基因互補物的雄性不育母系和重組保持系。
在此程序中，用純合Ms-B1Ms-B1和ki-B1和ki-B1-aki-B1-a純合的目的栽培品種對6B單體-4SsS/6SlL/6BL單體置換的重組保持系授粉，該保持系對隱性雄性不育等位基因ms-B1-c純合、具有顯性雄性能育性等位基因Ms-Ss1、對顯性雄配子殺傷等位基因Ki-B1以及隱性雄配子殺傷等位基因ki-Sl1-a(在REC-HR1的情況下亦對Su-Ss1等位基因)為半合子、或是改進重組工程化染色體單體置換的改進重組保持系之一，所述改進重組工程化染色體是分別攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a等位基因，Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a等位基因或Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a等位基因的或者4SsS/4EL/6SlL/6BL、4SsS/4AmL/6SlL/6BL或4AmS-4AmL/6SlL/6BL。F1雜種均對雄性不育等位基因雜合(Ms-B1ms-B1-c)，其1/2對6B(從其父本接受該染色體，因此對ki-B1-a為半合子)和REC或IREC為雙單體，1/2為二體6B和雜合Ki-B1ki-B1-a。選擇這些二體和雙單體植株，并用目的栽培品種授粉產(chǎn)生BC1子代，其1/2為雜合Ms-B1ms-B1-c。該BC1子代包含二種類型一種類型源自對雙單體F1植株授粉，其1/2對6B(因此對ki-B1-a為半合子)和REC或IREC為雙單體；另一種類型源自對二體F1植株授粉，其一半是雜合Ki-B1ki-B1-a。將通過細胞學(xué)分析和通過使用DNA標(biāo)記選擇的雜合Ms-B1ms-B1-c BC1植株做為雌株與目的栽培品種進一步回交四個連續(xù)世代產(chǎn)生第五代回交子代(BC5)，其中所述BC1植株為6B單體-或者4SsS/6SlL/6BL、4SsS/4EL/6SlL/6BL、4SsS/4AmL/6SlL/6BL或4AmS-4AmL/6SlL/6BL單體置換和雜合Ki-B1ki-B1-a的二體6B。在每個世代如對BC1子代所述分析子代，選擇雜合Ms-B1ms-B1-c和或者半合子ki-B1-a、具有做為單體附加的REC或IREC或者二體6B、雜合Ki-B1ki-B1-a的植株。然后用二體6B BC5對所選擇的雙單體6B-REC或IREC BC5植株授粉產(chǎn)生BC5F2子代，其1/8是雙單體6B-REC或IREC、攜帶ms-B1-cms-B1-c Ms-Ss1 Ki-B1和ki-Sl1-a，分別或者是目的重組保持系或者是改進重組保持系，1/8是具有ms-B1-cms-B1-c和Ki-B1ki-B1-a的二體，是目的雄性不育母系。
參考文獻Driscoll,C.J.(1972)Crop Sci.12:516-517.Driscoll,C.J.,(1985)Crop Sci.25,1115-1116.Franckowiak,J.D.,Maan,S.S.和Williams,N.D.(1976)Crop.Sci.16:725-728.Hermsen,J.G.Th(1965)Euphytica 14:221-224.Keppenne,V.D.和Baenziger,P.S.(1990)Genome 33:525-529.Kihara,H.(1951)Cytologia 16:117-193.Loegering,W.Q.和Sears,E.R.(1963)Can.J.Genet.Cytol.5:65-72.Lukaszewski,A.J.(1993)Genome 36:821-824.McIntosh,R.A.(1998)Proc.8th Int.Wheat Genet.Symp.,Beijing,China.1333-1500頁.Sasakuma,T.,Mann,S.S.和Williams,N.D.(1978)Crop Science18:850-853.Sears,E.R.(1972)Stadler Symposium 4:23-38.Sears,E.R.(1977)Can.J.Genet.Cytol.19:585-593.Sharma,D.和Knott,D.R.(1966)Can.J.Genet.Cytol.8:137-143.Snape,J.W.,Leckie,D.,Parker,B.B.和Nevo,E.(1991)載于Casely,J.C.,Cussans,G.W.和Atkin,R.K.(編輯)雜草和作物的除草劑抗性，Butterworth-Heinemann,Oxford，第305-317頁.Tsujimoto,H.和Tsunewaki,K.(1983)Proc.6th Int.Wheat Genet.Symp.,Kyoto，日本.第1077-1081頁Wilson,P.和Driscoll,C.J.(1983)載于Frenkel.R.(編輯)理論和應(yīng)用遺傳學(xué)專題，第6卷，Heterosis,Springer-Verlag，第294-123頁.Zeven,A.C.(1991)Euphytica 56:243-258[有關(guān)Pugsley和Oram,1959；Fossatii和Ingold,1970；和Driscoll,1977參見Wilson和Driscoll,1983的上述綜述]
權(quán)利要求
1．保持普通小麥或硬粒小麥雄性不育母本系以用于雜交小麥生產(chǎn)的方法，所述方法包括(a)用父本雜交母本，所述母本是對染色體4B短臂(4BS)上的任何一個隱性ms-Bl雄性不育等位基因純合并對染色體6B長臂(6BL)上的顯性雄配子殺傷Ki-Bl等位基因純合的雄性不育植株，所述父本是保持系并與母本等基因，且對母本相同的ms-Bl和Ki-Bl等位基因純合，并且具有選自以下的一條附加的異源工程化染色體(ⅰ)本文稱為EC的工程化染色體，由源自二條或多條不同的異源染色體的節(jié)組成，攜帶顯性雄性能育性等位基因Ms、對6BL上的天然雄配子殺傷等位基因的殺傷作用敏感的隱性等位基因ki以及一個或二個通過其可以選擇具有該染色體的植株的選擇標(biāo)記；和(ⅱ)本文稱為IEC的改進工程化染色體，由源自二條或多條不同的異源染色體的節(jié)組成，除攜帶Ms、ki和選擇標(biāo)記等位基因之外，還攜帶種子標(biāo)記，通過該種子標(biāo)記可以將具有該染色體的種子與不具有該染色體的種子分離；和(b)從(a)的雜交收獲子代種子，所有的種子均對所述雄性不育和雄配子殺傷等位基因純合，并且缺乏所述工程化染色體EC或IEC，所述種子當(dāng)生長時發(fā)育成為雄性不育母系。
2．按照權(quán)利要求1的方法，其中本文命名為EC-H的所述工程化染色體攜帶決定正常植株高度的選擇標(biāo)記rht等位基因。
3．按照權(quán)利要求1的方法，其中本文命名為IEC-HC的所述改進工程化染色體攜帶做為選擇標(biāo)記的rht等位基因和做為種子標(biāo)記的決定種子藍色的Ba等位基因。
4．按照權(quán)利要求2的方法，其中所述工程化染色體EC-H是由4SsS/6SlL組成、在短臂上攜帶Ms-Ss1和rht-Ss1、在長臂上攜帶ki-Ss1-a的工程化染色體EC-H1。
5．按照權(quán)利要求3的方法，其中所述改進工程化染色體IEC-HC選自IEC-HC1、IEC-HC2和IEC-HC3,IEC-HC1由4SsS/4EL/6SlL組成，攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a；IEC-HC2由4SsS/4AmL/6SlL組成，攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和和ki-Sl1-a；IEC-HC3由4AmL-4AmL/6SlL組成，攜帶Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a。
6．保持普通小麥或硬粒小麥雄性不育母本系以用于雜交小麥生產(chǎn)的方法，所述方法包括(a)用父本雜交母本，所述母本是對染色體4B短臂(4BS)上任何一個隱性ms-B1雄性不育等位基因純合并對染色體6B長臂(6BL)上的顯性雄配子殺傷Ki-B1等位基因純合的雄性不育植株，所述父本是保持系并與母本等基因，且對母本的同一ms-B1等位基因純合，但對攜帶Ki-B1等位基因的染色體6B和選自以下的重組工程化染色體為單體(ⅰ)本文稱為REC的重組工程化染色體，由源自二條或多條不同的異源染色體的節(jié)和天然染色體臂6BL的遠端節(jié)組成，攜帶Ms等位基因、ki等位基因和一個或二個通過其可以選擇具有該染色體的植株的選擇標(biāo)記；和(ⅱ)本文稱為IREC的改進重組工程化染色體，由源自二條或多條不同的異源染色體的節(jié)和天然染色體臂6BL的遠端節(jié)組成，除攜帶Ms、ki和選擇標(biāo)記等位基因之外，還攜帶種子標(biāo)記，通過該種子標(biāo)記可以將具有該染色體的種子與不具有該染色體的種子分離；和(b)從(a)的雜交收獲子代種子，所有的種子均對所述雄性不育和雄配子殺傷等位基因純合，并且缺乏重組工程化染色體REC或IREC，所述種子當(dāng)生長時發(fā)育成為雄性不育母系。
7．按照權(quán)利要求6的方法，其中本文命名為REC-H的所述重組工程化染色體攜帶決定正常植株高度的選擇標(biāo)記rht等位基因。
8．按照權(quán)利要求6的方法，其中本文命名為IREC-HC的所述改進重組工程化染色體攜帶做為選擇標(biāo)記的rht等位基因和做為種子標(biāo)記的決定種子藍色的Ba等位基因。
9．按照權(quán)利要求7的方法，其中所述重組工程化染色體是REC-H是由4SsS/6SlL/6BL組成、在短臂上攜帶Ms-Ss1和rht-Ss1、在長臂上攜帶ki-Ss1-a的重組工程化染色體REC-H1。
10．按照權(quán)利要求8的方法，其中所述改進重組工程化染色體IREC-HC選自IREC-HC1、IREC-HC2和IREC-HC3，IREC-HC1由4SsS/4EL/6SlL/6BL組成，攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a；IREC-HC2由4SsS/4AmL/6SlL/6BL組成，攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a；而IREC-HC3由4AmL-4AmL/6SlL/6BL組成，攜帶Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a。
11．按照權(quán)利要求2的方法，其中所述工程化染色體EC-H攜帶做為再一選擇標(biāo)記的綠麥隆抗性等位基因Su，所述工程化染色體本文命名為EC-HR。
12．按照權(quán)利要求11的方法，其中所述工程化染色體EC-HR攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a，所述工程化染色體本文命名為EC-HR1。
13．按照權(quán)利要求7的方法，其中所述重組工程化染色體REC-H攜帶做為再一選擇標(biāo)記的綠麥隆抗性等位基因Su，所述重組工程化染色體本文命名為REC-HR。
14．按照權(quán)利要求13的方法，其中所述重組工程化染色體REC-HR由攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a的4SsS/6SlL/6BL組成，所述重組工程化染色體本文命名為REC-HR1。
15．保持普通小麥或硬粒小麥雄性不育母本系以用于雜交小麥生產(chǎn)的方法，所述方法包括(a)將保持系自交，所述保持系與母本等基因，即對任何一個隱性ms-Bl雄性不育等位基因和顯性雄配子殺傷Ki-B1等位基因純合，并且具有本文命名為IEC的一條附加的改進工程化染色體，除攜帶Ms、ki和選擇標(biāo)記等位基因之外，還攜帶種子標(biāo)記，通過該種子標(biāo)記可以將具有所述染色體IEC的種子與不具有該染色體的種子分離；(b)從(a)的自交植株收獲子代種子，所有的種子均對所述雄性不育和雄配子殺傷等位基因純合；和(c)分離具有IEC并因此具有種子標(biāo)記的種子(20％)與不具有IEC因此缺少種子標(biāo)記的種子(80％)，所述缺少該種子標(biāo)記的種子生長時發(fā)育成為雄性不育母系。
16．按照權(quán)利要求15的方法，其中所述種子標(biāo)記等位基因是決定藍色種子顏色的Ba等位基因，通過分選裝置分離藍色種子與缺少Ba等位基因的紅/白色種子。
17．按照權(quán)利要求15或16的方法，其中所述改進工程化染色體IEC選自IEC-HC1、IEC-HC2和IEC-HC3,IEC-HC1由4Ss/4EL/6SlL組成，攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a； IEC-HC2由4Ss/4AmL/6SlL組成，攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a；IEC-HC3由4AmL-4AmL/6SlL組成，攜帶Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a。
18．保持普通小麥或硬粒小麥雄性不育母本系以用于雜交小麥生產(chǎn)的方法，所述方法包括(a)將改進重組保持系自交，所述保持系與母本等基因，即對4BS上的任何一個隱性ms-B1雄性不育等位基因純合，但對攜帶Ki-B1等位基因的染色體6B和對本文命名為IREC的改進重組工程化染色體為單體，所述IREC除攜帶Ms、ki和選擇標(biāo)記等位基因之外，還攜帶種子標(biāo)記，通過該種子標(biāo)記可以將具有所述染色體IREC的種子與不具有該染色體的種子分離；(b)從所述(a)的自交植株收獲子代種子，所有的種子均對所述雄性不育等位基因純合，50％的種子對染色體6B為二體且缺乏IREC和種子標(biāo)記，50％具有IREC并顯示該種子標(biāo)記。(c)種植混合的(b)的子代種子，使雄性可育植株對雄性不育植株授粉并使雄性可育植株自花授粉，產(chǎn)生混合的子代種子；和(d)分離約75％的對染色體6B二體并且缺乏IREC和種子標(biāo)記、生長時發(fā)育成為所述雄性不育母系的種子和剩余的25％具有IREC和種子標(biāo)記的種子。
19．按照權(quán)利要求18的方法，其中所述父系(male)種子標(biāo)記等位基因是決定藍色種子顏色的Ba等位基因，通過分選裝置分離藍色種子與缺少Ba等位基因的紅/白色種子。
20．按照權(quán)利要求18或19的方法，其中所述改進重組工程化染色體IREC選自IREC-HC1、IREC-HC2和IREC-HC3,IREC-HC1由4SsS/4EL/6SlL/6BL組成，攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a；IREC-HC2由4SsS/4AmL/6SlL/6BL組成，攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a；而IREC-HC3由4AmS-4AmL/6SlL/6BL組成，攜帶Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a。
21．選自普通小麥或硬粒小麥雄性可育保持系和改進雄性可育保持系，以保持用于雜交小麥生產(chǎn)的雄性不育母本系的保持系，所述保持系或改進保持系與所述母本等基因，并對母本的任何一個ms-B1雄性不育等位基因、雄配子殺傷Ki-B1等位基因純合，且具有一條附加的異源工程化染色體，該染色體選自(ⅰ)EC，由源自二條或多條不同異源染色體的節(jié)組成，攜帶顯性雄性能育性等位基因Ms、對6BL上的天然雄配子殺傷等位基因的殺傷作用敏感的隱性等位基因ki和通過其可以選擇具有所述染色體EC的植株的選擇標(biāo)記；和(ⅱ)IEC，由源自二條或多條不同異源染色體的節(jié)組成，除攜帶Ms、ki和選擇標(biāo)記等位基因之外，還攜帶通過將其可以選擇具有所述染色體IEC的種子與不具有該染色體的種子分離的種子標(biāo)記；
22．選自普通小麥或硬粒小麥重組雄性可育保持系和改進重組雄性可育保持系，以保持用于雜交小麥生產(chǎn)的雄性不育母本系的保持系，所述保持系或改進保持系與所述母本等基因，并對任何一個ms-B1雄性不育等位基因純合、但對攜帶Ki-B1等位基因的染色體6B和重組或改進重組工程化染色體為單體，該染色體選自(ⅰ)REC，由二條或多條不同異源染色體的節(jié)和天然染色體臂6BL遠端節(jié)組成，攜帶Ms等位基因、ki等位基因和通過其可以選擇具有所述染色體REC的植株的選擇標(biāo)記；和(ⅱ)IREC，由源自二條或多條不同異源染色體的節(jié)和天然染色體臂6BL遠端節(jié)組成，除攜帶Ms、ki和選擇標(biāo)記等位基因之外，還攜帶通過其可以將具有所述染色體IREC的種子與不具有該染色體種子分離的種子標(biāo)記；
23．按照權(quán)利要求21或22的保持系，其中所述工程化染色體EC-H、IEC-HC、REC-H或IREC-HC攜帶做為選擇標(biāo)記的決定正常植株高度的rht等位基因。
24．按照權(quán)利要求21-23的保持系，其中所述染色體IEC-H或IREC-HC攜帶做為選擇種子標(biāo)記的藍糊粉顏色的Ba等位基因。
25．按照權(quán)利要求23或24的保持系，其中工程化染色體選自(ⅰ)REC-H1，攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a；和(ⅱ)IREC-HC之一，攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a或Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-Am1和ki-Sl1-a或Ms-Am1、rht-Am1、Ba-Am1和ki-Sl1-a。
26．用于保持用于雜交小麥生產(chǎn)的雄性不育母本系的選自普通小麥或硬粒小麥雄性可育保持系的保持系，所述保持系與所述母本等基因，并對母本的任何一個ms-B1雄性不育等位基因、綠麥隆除草劑敏感性等位基因su-B1和雄配子殺傷Ki-B1等位基因純合，且具有選自EC-HR類型的一條附加的異源工程化染色體，該染色體由源自二條或多條不同異源染色體的節(jié)組成，攜帶顯性雄性能育性等位基因Ms、對6BL上的天然雄配子殺傷等位基因的殺傷作用敏感的隱性等位基因ki和二個選擇標(biāo)記rht(決定正常植株高度)和Su(決定對綠麥隆抗性)等位基因，通過所述選擇標(biāo)記可以選擇具有所述染色體EC-HR的植株。
27．按照權(quán)利要求26的保持系，其中所述工程化染色體是攜帶做為選擇標(biāo)記的rht-Ss1和Su-Ss1等位基因的EC-HR1類型。
28．用于保持用于雜交小麥生產(chǎn)的雄性不育母本系的選自普通小麥或硬粒小麥雄性可育重組保持系的保持系，所述保持系與所述母本等基因，即對任何一個ms-B1雄性不育等位基因純合、但對攜帶su-B1和Ki-B1等位基因的染色體6B和選自REC-HR類型的重組工程化染色體為單體，該重組工程化染色體由源自二條或多條不同異源染色體的節(jié)和天然染色體臂6BL的遠端節(jié)組成，攜帶Ms等位基因、ki等位基因和選擇標(biāo)記，通過所述選擇標(biāo)記可以選擇具有所述染色體REC-HR的植株。
29．按照權(quán)利要求28的保持系，其中所述工程化染色體是攜帶做為選擇標(biāo)記的決定正常植株高度的rht-Ss1等位基因和賦予對綠麥隆抗性的Su-Ss1等位基因的REC-HR1類型。
30．在普通小麥或硬粒小麥的保持系或重組保持系每個世代中保持雄性可育與雄性不育植株比例恒定的方法，包括(a)使具有工程化染色體的雄性可育保持系自交，該染色體選自工程化染色體EC-H和重組工程化染色體REC-H，除攜帶Ms和ki等位基因之外，還攜帶至少一個選擇標(biāo)記等位基因，該標(biāo)記便于從該雄性可育自交保持系的子代中選擇種子，所述種子生長時發(fā)育成為所述保持系；(b)收集(a)的子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生植株，其20％(具有工程化染色體EC-H的保持系子代)和50％(具有重組工程化染色體REC-H的保持系子代)具有所述工程化染色體，與所述保持系相同，因此攜帶所述選擇標(biāo)記等位基因，通過該選擇標(biāo)記等位基因可以從缺少所述工程化染色體的那些植株選擇它們；和(c)收獲(b)的展示選擇標(biāo)記的植株，它們都是雄性可育，得到子代種子中有20％(具有工程化染色體EC-H的保持系子代)或50％(具有重組工程化染色體REC-H的保持系子代)的種子攜帶所述工程化染色體，由此保持保持系或重組保持系每個世代中雄性可育與雄性不育植株的比例恒定。
31．按照權(quán)利要求30的方法，其中所述選擇標(biāo)記是增進植株高度的rht等位基因，由此便于選擇性收獲雄性可育保持系的種子，所述種子生長時發(fā)育成為所述保持系。
32．在普通小麥或硬粒小麥的保持系或重組保持系每個世代中保持雄性可育與雄性不育植株比例恒定的方法，包括(a)使具有工程化染色體的雄性可育保持系自交，該染色體選自工程化染色體EC-HR和重組工程化染色體REC-HR，除攜帶Ms-Ss1和ki-Sl1-a等位基因之外，還攜帶做為選擇標(biāo)記的除草劑抗性等位基因，該標(biāo)記便于從該自交保持系的雄性可育子代中選擇具有同樣所述保持系基因型的植株；(b)收集(a)的子代種子，萌發(fā)所述種子成為子代苗，其20％(EC-HR)和50％(REC-HR)具有所述工程化染色體，用除草劑噴灑所述苗，由此殺傷所有的敏感苗，即那些缺少所述工程化染色體的苗；和(c)收獲(b)的除草劑抗性植株，它們都攜帶所述工程化染色體并因此是雄性可育，得到子代種子中有20％(EC-HR)或50％(REC-HR)的種子攜帶所述工程化染色體，由此保持保持系或重組保持系每個世代中雄性可育與雄性不育植株的比例恒定。
33．按照權(quán)利要求32的方法，其中所述可選擇除草劑抗性等位基因是賦予對綠麥隆抗性的Su-Ss1等位基因。
34．在普通小麥或硬粒小麥的改進保持系或改進重組保持系中僅種植雄性可育保持系植株的方法，包括(a)使具有工程化染色體的雄性可育保持系自交，該染色體選自改進工程化染色體IEC-HC和改進重組工程化染色體IREC-HC，除攜帶Ms-Ss1和ki-Sl1-a等位基因之外，還攜帶種子標(biāo)記，通過該標(biāo)記可以在自交雄性可育的所述保持系的子代中從不具有所述工程化染色體的種子選擇具有該染色體的種子，所述種子生長時發(fā)育成為所述保持系；(b)收集(a)的子代種子并借助分選裝置從未展示所述標(biāo)記的種子分離展示該種子標(biāo)記的種子；和(c)種植(b)的展示種子標(biāo)記的種子，它們均發(fā)育成為雄性可育改進保持系或改進重組保持系植株。
35．按照權(quán)利要求34的方法，其中所述種子標(biāo)記是決定種子藍色的Ba等位基因。
36．產(chǎn)生具有工程化染色體EC-H1的普通小麥或硬粒小麥雄性可育保持系的方法，所述方法包括(a)將源自普通小麥栽培品種中國春的雄性可育母本與父本雜交，所述母本對染色體臂4BS上顯性Ms-B1雄性能育性等位基因和6BL上的顯性Ki-B1雄配子殺傷等位基因純合，并且具有在其長臂上攜帶隱性雄配子殺傷等位基因ki-Sl1-a的附加異源染色體6Sl，所述父本與母本等基因但對隱性ms-B1-c雄性不育等位基因純合、并而具有在其短臂上攜帶顯性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1的一條附加的異源染色體4Ss，而不是缺少染色體6Sl；(b)從(a)的雜交收集子代種子，并種植所述種子，由此產(chǎn)生雄性可育F1植株，一部分為雙單體附加，即它們具有二條異源染色體，攜帶MS-Ss1和rht-Ss1的4Ss和攜帶ki-Sl1-a的6Sl；(c)自交(b)的所述F1子代，收集其大量的子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生F2植株，其一部分是異源易位工程化染色體EC-H1單體附加，其25％對ms-B1-c雄性不育等位基因純合并且是所需植株；(d)通過染色體計數(shù)、C-帶和使用DNA標(biāo)記選擇(c)的所述所需植株，將其自交；(e)收集(d)的自交子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生F3植株，它們都對ms-B1-c雄性不育等位基因純合，25％由于它們亦具有所述附加的異源工程化染色體EC-H1而為雄性可育，這些即是所需保持系植株；和(f)通過染色體計數(shù)和使用DNA標(biāo)記選擇(e)的所需保持系植株。
37．產(chǎn)生具有重組工程化染色體REC-H1的普通小麥或硬粒小麥雄性可育重組保持系的方法，所述方法包括(a)將源自普通小麥栽培品種中國春的雄性可育母本與父本雜交，所述母本對染色體臂4BS上顯性Ms-B1雄性能育性等位基因和染色體臂5BL上的顯性部分同源配對抑制基因等位基因Ph1純合，對染色體6B為缺對染色體并因此缺乏顯性Ki-B1雄配子殺傷等位基因，并且具有一對攜帶隱性雄配子殺傷等位基因ki-Sl1-a的6Sl染色體，所述父本與母本等基因，但卻是二體6B并因此對Ki-B1純合、缺少染色體6Sl，亦對突變部分同源配對等位基因ph1b純合；(b)從(a)的雜交收獲子代種子，并種植所述種子，由此產(chǎn)生對部分同源配對等位基因雜合的(Ph1ph1b)雄性可育(Ms-B1Ms-B1)F1植株，它們對6B和6Sl染色體均為單體；(c)將所述(b)的F1植株與父本回交；(d)收集(c)雜交的子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生BC1植株，它們均為雄性可育(Ms-B1Ms-B1)，其50％對ph1b等位基因純合，其中約50％對6B和6Sl染色體為雙單體，是所需BC1植株；(e)通過使用DNA標(biāo)記和分析減數(shù)分裂時染色體配對選擇(d)的所需BC1植株，用與BC1植株等基因但為純合Ph1Ph1的雙端著絲粒6BS品系對其授粉；(f)收集(e)的雜交子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生植株，其全部對染色體臂6BS為單端著絲粒，其一部分亦對由6Sl的短臂和長臂的近端區(qū)(攜帶ki-Sl1-a)和染色體臂6BL的遠端區(qū)組成的重組染色體(重組點居ki-Sl1-a遠端)為單體，是所需植株；(g)通過C-帶、使用DNA標(biāo)記和分析染色體配對選擇(f)的所述所需植株，將它們做為父本與母系雜交，該母系是非重組保持系，即對任何一個隱性雄性不育等位基因ms-B1和顯性雄配子殺傷等位基因Ki-B1純合，并具有工程化染色體EC-H1；(h)從(g)的雜交收獲子代種子，并種植所述種子，由此產(chǎn)生F1植株，其一部分為三單體，即對6B、異源工程化染色體EC-H1和重組染色體(6Sl/6BL)為單體，是雜合Ms-B1ms-B1、半合子Ki-B1和純合ki-Sl1-aki-Sl1-a，是所需植株；和(i)通過染色體計數(shù)、C-帶和通過使用DNA標(biāo)記選擇(h)的所述所需植株，將其自交，收集子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生F2植株，其一部分為雙單體，具有染色體6B和重組工程化染色體REC-H1，攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1和ki-Sl1-a，這些即是所需保持系植株。
38．產(chǎn)生具有工程化染色體EC-HR1的普通小麥或硬粒小麥雄性可育保持系的方法，包括(a)將源自普通小麥栽培品種中國春中的雄性可育保持系的雄性可育母本與二倍體物種Aegilops searsii的品系雜交，所述母本對隱性ms-B1雄性不育等位基因、隱性綠麥隆敏感性等位基因su-B1和顯性Ki-B1雄配子殺傷等位基因純合，并且具有做為單體附加的工程化染色體EC-H1，該染色體在其短臂上攜帶顯性雄性能育性等位基因Ms-Ss1和半顯性rht-Ss1等位基因、在其長臂上攜帶隱性綠麥隆敏感性等位基因su-Sl1和隱性雄配子殺傷等位基因ki-Sl1-a，所述二倍體物種Aegilops searsii在6SsL上具有顯性綠麥隆抗性等位基因Su-Ss1并在4SsS上具有Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因；(b)從(a)的雜交收獲子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生F1植株，其一部分具有2n=29染色體，即它們具有中國春的一套染色體、工程化染色體EC-H1和Aegilops searsiii的一套染色體，基因型為ms-B1Ms-Ss1Ms-Ss1,ki-B1ki-Sl1-a和su-B1su-Sl1Su-Ss1；(c)選擇(b)的具有2n=29染色體的所述F1子代，將其與做為父本的cv.CS回交，收集其子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生BC1植株，其一部分對綠麥隆抗性的植株是工程化染色體EC-HR1單體附加，它們均是ms-B1Ms-B1雜合并對su-B1和Ki-B1純合，是所需植株；(d)通過染色體計數(shù)和使用DNA標(biāo)記選擇(c)的所述所需植株，將其自交；(e)收集(d)的自交子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生BC1F2植株，其20％對綠麥隆有抗性，即攜帶所述工程化染色體，25％的抗性植株對ms-B1純合，但是由于它們攜帶工程化染色體EC-HR1的Ms-Ss1而為雄性可育，這些即是所需保持系植株；和(f)通過對綠麥隆的抗性和使用DNA標(biāo)記選擇(e)的所需保持系植株。
39．產(chǎn)生具有重組工程化染色體REC-HR1的普通小麥或硬粒小麥雄性可育重組保持系的方法，包括(a)用源自普通小麥栽培品種中國春中的雄性可育重組保持系的雄性可育母本與二倍體物種Aegilops searsii的品系雜交，該母本是單體6B單體附加REC-H1，所述母本對隱性ms-B1雄性不育等位基因純合、對隱性綠麥隆敏感性等位基因su-B1和顯性Ki-B1雄配子殺傷等位基因為半合子，并且具有做為單體附加的工程化染色體REC-H1，該染色體在其短臂上攜帶顯性雄性能育性等位基因Ms-Ss1和半顯性rht-Ss1等位基因、在其長臂上攜帶隱性綠麥隆敏感性等位基因su-Sl1和隱性雄配子殺傷等位基因ki-Sl1-a，所述二倍體物種Aegilops searsii品系具有顯性綠麥隆抗性等位基因Su-Ss1以及Ms-Ss1和rht-Ss1等位基因；(b)從(a)的雜交收獲子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生F1植株，其50％具有所述重組工程化染色體，該染色體與4SsS和6SsS配對，因此在減數(shù)分裂時形成三價染色體，具有基因型ms-B1Ms-ss1Ms-Ss1,ki-sl1-a Su-Sl1和Su-Sl；(c)選擇(b)的所述F1子代并將其與做為父本的cv.中國春回交；(d)收集其子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生BC1植株，它們均為雜合ms-B1Ms-B1并因此為雄性可育，一些植株是單體6B并由此對su-B1和Ki-B1為半合子，并具有做為單體置換的在短臂上攜帶Ms-Ss1和rht-Ss1、在長臂上攜帶Su-Ss1和ki-Sl1-a的重組工程化染色體REC-HR1，是所需植株；(e)通過對綠麥隆的抗性和通過分析減數(shù)分裂時染色體配對選擇(c)的所述所需植株，將其自交；(f)收集(d)的自交子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生BC1F2植株，其50％是單體6B并對重組染色體REC-HR1為單體，染色體REC-HR1由4Ss的短臂(攜帶Ms-Ss1和rht-Ss1)、6Sl的長臂近端區(qū)(攜帶Su-Ss1和ki-Sl1-a)和染色體臂6BL的遠端區(qū)組成(重組點居ki-Sl1-a遠端)，這些植株的25％對ms-B1純合，對su-B1和Ki-B1為半合子，這些即是所需保持系植株；和(g)通過綠麥隆的抗性和使用DNA標(biāo)記選擇(e)的所需保持系植株。
40．產(chǎn)生具有改進工程化染色體IEC-HC1的普通小麥或硬粒小麥雄性可育改進保持系的方法，所述方法包括(a)將源自普通小麥栽培品種中國春的雄性可育母本與父本雜交，所述母本是保持系，即對染色體臂4BS上隱性ms-B1雄性不育等位基因和染色體臂6BL上的顯性Ki-B1雄配子殺傷等位基因純合，并且具有一條在其短臂上攜帶顯性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1、在其長臂上攜帶隱性等位基因ki-Sl1-a的附加的工程化染色體EC-H1，所述父本與母本等基因，但對顯性雄性能育性等位基因Ms-B1純合，具有附加的一對異源染色體4E，該染色體在其長臂上攜帶顯性藍糊粉等位基因Ba-E1；(b)收集(a)的雜交子代種子，所有的種子都是藍色的，用熱中子輻射種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生雄性可育F1植株，它們均為雜合Ms-B1ms-B1并對Ki-B1純合，其20％是工程化染色體EC-H1和染色體4E的雙單體附加，并是所需植株；(c)通過染色體計數(shù)和通過使用DNA標(biāo)記選擇(b)的所述所需F1植株，將其自交；(d)收集(c)子代種子，選擇藍色種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生F2植株，其一部分有43條染色體，這些植株的一部分具有改進工程化染色體IEC-H1，該染色體含有4SsS/4EL/6SlL、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a，是所需植株，其它一些則具有易位染色體4SsS/4EL；(e)通過染色體計數(shù)和通過使用DNA標(biāo)記選擇(d)的所需植株，將其自交；(f)收集(e)的子代種子并選擇藍色種子，這些種子生長時發(fā)育成為雄性可育植株，該植株攜帶改進工程化染色體IEC-HC1，這些是所需改進保持系植株；(B)如果步驟(d)未得到所需植株，則通過染色體計數(shù)和通過DNA標(biāo)記選擇具有易位染色體4SsS/4EL的(d)的植株(源自藍色種子，雄性可育)，將它們做為父本與具有EC-H1的保持系回交以產(chǎn)生F1種子；(h)從(g)的所述F1種子中選擇藍色種子，將其用熱中子輻射并萌發(fā)，選擇具有44條染色體的苗，即具有二條異源附加染色體4SsS/4EL和EC-H1(4SsS/6SlL)；和(i)重復(fù)步驟(d)-(f)，由此得到具有改進工程化染色體IEC-HC1的所需改進保持系，IEC-HC1具有4SsS/4EL/6SlL，攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和ki-Sl1-a。
41．產(chǎn)生具有改進工程化染色體IEC-HC1的普通小麥或硬粒小麥雄性可育改進保持系的方法，所述方法包括(a)將源自普通小麥栽培品種中國春的雄性可育母本與父本雜交，所述母本對顯性雄性能育性等位基因Ms-B1和顯性雄配子殺傷Ki-B1等位基因純合，并且具有一對在其長臂上攜帶顯性藍糊粉等位基因Ba-E1的異源染色體4E，所述父本與母本等基因，但對隱性雄性不育等位基因ms-B1-c純合、具有在其短臂上攜帶顯性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1的附加異源染色體4Ss；(b)收集(a)的雜交子代種子，并種植所述種子，由此產(chǎn)生F1植株，它們均為雜合Ms-B1ms-B1和純合Ki-B1Ki-B1，其25％是攜帶染色體4E和4Ss的雙單體附加系，是所需植株；(c)通過染色體計數(shù)和通過使用DNA標(biāo)記選擇(b)的所述所需F1植株，將其自交；(d)選擇(c)自交種子中的藍色種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生F2植株，其一部分具有易位染色體4SsS/4EL，是所需植株；(e)通過染色體計數(shù)和通過使用DNA標(biāo)記選擇(d)的所述所需F2植株，將它們做為父本與具有EC-H1(4SsS/6SlL)的保持系雜交得到F1種子，一些種子是藍色的；(f)選擇(e)的藍色種子，將它們用熱中子輻射并使其生長為F1植株，它們均對ms-B1-c和Ki-B1純合，少數(shù)具有雙單體附加4SsS/4EL和EC-H1(4SsS/6SlL)，是所需植株；(g)通過染色體計數(shù)和使用DNA標(biāo)記選擇(f)的所述所需植株，將其自交；(h)收集(g)的子代種子，選擇藍色種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生F2植株，它們均對ms-B1-c和Ki-B1純合，其一部分有43條染色體，這些植株的一部分具有改進工程化染色體IEC-H1，該染色體含有4SsS/4EL/6SlL、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Ba-E1和kj-Sl1，是所需植株；(i)通過染色體計數(shù)、C-帶和雄性能育性選擇(h)的所需植株，將其自交；和(j)收集(i)的子代種子并選擇藍色種子，所述種子生長時發(fā)育成為攜帶IEC-HC1的雄性可育植株，這些是所需改進保持系植株。
42．產(chǎn)生具有改進工程化染色體IEC-HC2的普通小麥或硬粒小麥雄性可育改進保持系的方法，所述方法包括(a)將普通小麥栽培品種中國春二體置換品系父本與母本雜交，在父本中一粒小麥的染色體4Am置換了普通小麥的染色體4B，因此所述父本缺少雄性能育性等位基因Ms-B1、對雄配子殺傷等位基因Ki-Bl和對4AmS上的Ms-Am1和rh-Am1以及4AmL上的Ba-Am1純合，所述母本與父本等基因，對隱性ms-B1雄性不育等位基因純合，并且具有一條在其短臂上攜帶顯性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1的附加的異源染色體4Ss；(b)收集(a)的雜交子代種子，它們均為藍色，種植所述種子，由此產(chǎn)生F1植株，它們均為半合子ms-B1-c并對Ki-B1純合，一些是三單體4B、4Ss和4Am并是所需植株；(c)通過染色體計數(shù)選擇(b)的所述三單體植株，由此產(chǎn)生雄性可育F1植株，使其自花授粉；(d)收集(c)的F2種子，選擇藍色種子并種植所述選擇的種子，由此產(chǎn)生F2植株，進一步從這些F2植株中選擇那些具有44條染色體的植株(在減數(shù)分裂時顯示21”+2’)，這些植株是所需4Ss和4Am雙單體附加系；(e)自交(d)的所述所需植株，由此得到F3種子，選擇藍色種子；(f)種植(e)的藍色種子，選擇具有43條染色體(21”+1)的植株，它們?yōu)樾坌钥捎a(chǎn)生藍色種子，這些植株具有易位染色體4SsS/4AmL，是所需植株；(g)將(f)的所需植株做為父本與做為母本的純合ms-B1msB1Ki-B1KiB1并具有EC-H1(4SsS/6SlL)、攜帶Ms-Ss1rht-Ss1ki-Sl1-a的保持系雜交得到F1種子；(h)從(f)的F1子代種子中選擇藍色種子，將其用熱中子輻射并種植，再選擇具有44條染色體(21”+1”)的植株，即對異源附加染色體的短臂為二體、對其長臂為雙單體，將其自交；(i)種植(h)的藍色種子，選擇具有43條染色體、產(chǎn)生藍色和紅/白色種子的雄性可育植株，這些植株具有IEC-HC2，是所需植株；和(j)自交(i)的所需植株，收集其種子并分離藍色種子，所述種子當(dāng)生長時，發(fā)育成為具有IEC-HC2的雄性可育植株，這些即是所需改進保持系植株。
43．產(chǎn)生具有改進工程化染色體IEC-HC3的普通小麥或硬粒小麥雄性可育改進保持系的方法，所述方法包括(a)將普通小麥栽培品種中國春二體置換品系父本與母本雜交，在父本中一粒小麥的染色體4Am置換了普通小麥的染色體4B，因此所述父本缺少雄性能育性等位基因Ms-B1、對雄配子殺傷等位基因Ki-B1和對4AmS上的Ms-Am1和rht-Am1以及4AmL上的Ba-Am1純合，所述母本與父本等基因、但對隱性ms-B1雄性不育等位基因純合，并且具有一條在其短臂上攜帶顯性等位基因Ms-Ss1和rht-Ss1的附加的異源染色體4Ss；(b)收集(a)的F1種子，它們均為藍色并種植所述種子，它們均為半合子ms-B1-c并對Ki-B1純合，其中75％是單體4B和攜帶Ms-Am1的4Am單體置換，由此為雄性可育，使用所述單體-單體置換、對雜合Ms-B1ms-B1和純合Ki-B1等位基因并具有做為單體附加的染色體6Sl的母本授粉，其中通過將附加4Ss單體的ms-B1-cms-B1-c中國春做為父本與Ms-B1和Ki-B1等位基因純合并具有做為單體附加的染色體6Sl的母本雜交得到所述母本，20％的子代具有所需構(gòu)造；(c)收集(b)雜交的藍色F1種子，用熱中子輻射，種植這些種子，從F1植株中選擇那些具有43條(21”+1’)和42條(20”+2’)染色體的植株并使這些植株自交；(d)從(c)的自交種子選擇藍色種子并種植所述種子，選擇雄性可育、有約20％不存活花粉并產(chǎn)生藍色和紅/白色種子的植株；和(e)種植(d)的種子，分離藍色種子，所述種子當(dāng)生長時，發(fā)育成為具有IEC-HC3的雄性可育植株(具有43條染色體)，這些即是所需改進保持系植株。
44．產(chǎn)生具有改進重組工程化染色體IREC-HC的普通小麥或硬粒小麥雄性可育改進保持系的方法，所述方法包括(a)將源自普通小麥栽培品種中國春的雄性可育母本與父本雜交，所述母本對染色體臂4BS上顯性Ms-B1雄性能育性等位基因和染色體臂5BL上的顯性部分同源配對抑制基因等位基因Ph1純合，對染色體6B為缺對染色體并因此缺乏顯性Ki-B1雄配子殺傷等位基因，并且具有一對攜帶隱性雄配子殺傷等位基因ki-Sl1-a的6Sl染色體，所述父本與母本等基因但卻是二體6B并因此對Ki-B1純合、缺少染色體6Sl、亦對突變部分同源配對等位基因ph1b純合；(b)從(a)的雜交收集子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生對部分同源配對等位基因雜合的(Ph1ph1b)雄性可育(Ms-B1Ms-B1)F1植株，它們對6B和6Sl染色體均為單體；(c)將(b)的所述F1植株與父本回交；(d)收集(c)雜交的子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生BC1植株，它們均為雄性可育(Ms-B1Ms-B1)，其1/2對ph1b等位基因純合，其中約1/2(因為6B與6Sl配對)對6B和6Sl染色體為雙單體，是所需BC1植株；(e)通過減數(shù)分裂時染色體配對和通過DNA標(biāo)記選擇(d)的所需BC1植株，將其用與BC1植株等基因但為純合Ph1Ph1的雙端著絲粒6BS品系(即缺少6BL臂)授粉；(f)收集(e)的雜交子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生植株，其全部對染色體臂6BS為單端著絲粒，一部分亦對由6Sl的短臂和長臂的近端區(qū)(攜帶ki-Sl1-a)和染色體臂6BL的遠端區(qū)組成的重組染色體(易位點居ki-Sl1-a遠端)為單體，即是所需植株；(g)通過C-帶、通過分析染色體配對和使用DNA標(biāo)記選擇(f)的所述所需植株，將它們做為父本與母系雜交，該母系是改進保持系，即對任何一個隱性雄性不育等位基因ms-B1和顯性雄配子殺傷等位基因Ki-B1純合，并具有下述改進工程化染色體之一IEC-HC1(4SsS/4EL/6SlL)、IEC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL)或者IEC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL)；(h)從(g)的雜交收集子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生F1植株，其中一部分為三單體，即它們對6B、改進工程化染色體IEC-HC1、IEC-HC2或IEC-HC3之一和重組染色體(6Sl/6BL)為單體，是雜合Ms-B1ms-B1、半合子Ki-B1，是所需植株；和(i)通過染色體計數(shù)、C-帶和通過使用DNA標(biāo)記選擇(h)的所述所需植株，將其自交，收集子代種子并種植所述種子，其一部分為雙單體，具有染色體6B和改進重組工程化染色體IREC-HC，該染色體或者為IREC-HC1(4SsS/4EL/6SlL/6BL)、IREC-HC2(4SsS/4AmL/6SlL/6BL)或者IREC-HC3(4AmS-4AmL/6SlL/6BL)，這些即是具有IREC-HC的所需保持系植株。
45．將普通小麥或硬粒小麥所需栽培品種轉(zhuǎn)化成為雄性不育母本系和用于所述母系的權(quán)利要求21中定義的雄性可育保持系的方法，所述方法包括(a)將保持系與所需栽培品種雜交，所述保持系做為母本、為純合ms-B1ms-B1Ki-B1Ki-B1并具有異源工程化染色體EC-H1、攜帶Ms-Ss1和ki-Sl1-a，所述栽培品種是純合Ms-B1Ms-B1ki-B1ki-B1；(b)收集(a)雜交的子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生雄性可育F1植株，其全部是雜合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a，其20％亦攜帶工程化染色體EC-H1，是所需植株；(c)通過染色體計數(shù)和通過DNA標(biāo)記選擇(b)的所述所需F1植株，用所需栽培品種對其授粉產(chǎn)生BC1子代，其1/16是雜合Ms-B1ms-B1Ki-B1ki-B1-a并攜帶工程化染色體EC-H1，是所需基因型；(d)種植(c)的所述BC1植株，通過染色體計數(shù)和通過使用DNA標(biāo)記選擇所述所需基因型，再將它們做為母本與所需栽培品種回交四個連續(xù)世代產(chǎn)生第五代回交子代(BC5)，通過染色體計數(shù)和通過使用DNA標(biāo)記在每個世代選擇具有工程化染色體EC-H1的雜合Ms-B1ms-B1Ki-B1ki-B1-a后代；和(e)自交(d)的所需BC5植株，收集其子代種子并種植所述種子，由此生長BC5F2植株，其1/20是雄性不育并對雄性不育ms-B1和雄配子殺傷Ki-B1等位基因純合，是所需雄性不育母系，其它具有類似基因型但亦具有工程化染色體EC-H1的BC5F2植株是所需雄性可育保持系植株。
46．按照權(quán)利要求45的方法，其中該保持系是定義于權(quán)利要求21中的用于所述母系的改進保持系，具有染色體IEC-HC，通過藍色種子標(biāo)記協(xié)助在步驟(d)中的每個世代(F1、BC1-BC5、BC5F2)選擇IEC-EC的存在。
47．將普通小麥或硬粒小麥所需栽培品種轉(zhuǎn)化成為雄性不育母本系和權(quán)利要求22中定義的用于所述母系的雄性可育重組保持系的方法，所述方法包括(a)將具有異源重組工程化染色體REC-H1的保持系做為母本與所需栽培品種雜交，所述保持系為純合ms-B1ms-B1、對6B和重組工程化染色體REC-H1(4SsS/6SlL/6BL)為單體、攜帶Ms-Ss1和ki-Sl1-a，所述栽培品種是純合Ms-B1Ms-B1ki-B1ki-B1；(b)收集(a)雜交的子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生雄性可育F1植株，其全部是雜合ms-B1Ms-B1，其1/2對染色體6B為二體，并因此是雜合Ki-B1ki-B1-a，其1/2對染色體6B和重組工程化染色體REC-H1為雙單體、對ki-B1-a為半合子，但亦攜帶該重組工程化染色體的Ms-Ss1和ki-Sl1-a；(c)通過分析染色體配對和使用DNA標(biāo)記選擇(b)的所述二種類型的F1植株，用所需栽培品種對其授粉產(chǎn)生二種類型的BC1子代，那些源自二體F1的子代的1/4是雜合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a，那些源自雙單體F1的子代的1/4是雙單體、雜合ms-B1Ms-B1、半合子ki-B1-a并亦攜帶重組工程化染色體REC-H1的Ms-Ss1和ki-Sl1-a；(d)通過分析染色體配對和通過使用DNA標(biāo)記選擇(c)的二組所述所需植株，再將它們做為母本與所需栽培品種回交四個連續(xù)世代產(chǎn)生二種類型的第五代回交子代(BC5)，通過染色體配對分析和通過使用DNA標(biāo)記在每個世代選擇二體類型中的雜合ms-B1Ms-B1Ki-B1ki-B1-a和雙單體類型中的雜合ms-B1Ms-B1、具有重組工程化染色體REC-H1的后代；(e)用(d)的所需二體BC5對(d)的所需雙單體BC5植株授粉，產(chǎn)生二組BC5F2一組為二體植株，其1/8是純合ms-B1ms-B1和雜合Ki-B1ki-B1-a，是所需二體植株，一組為雙單體植株，其1/8是純合ms-B1ms-B1、半合子Ki-B1并亦攜帶重組工程化染色體REC-H1的Ms-Ss1和ki-Sl1-a，因此為雄性可育且是所需保持系；和(f)分別種植(e)的所述雙單體BC5F2種子和(e)的二體BC5F2種子，通過染色體配對分析和通過使用DNA標(biāo)記選擇所需雄性可育保持系和雄性不育母系。
48．按照權(quán)利要求47的方法，其中該保持系是定義于權(quán)利要求24中的用于所述母系的改進重組保持系，具有改進重組工程化染色體IREC-HC，通過藍色種子標(biāo)記協(xié)助在步驟(d)中的每個世代(F1、BC1-BC5、BC5F2)選擇IREC-HC的存在。
49．將普通小麥或硬粒小麥所需栽培品種轉(zhuǎn)化成為雄性不育母本系和權(quán)利要求26中定義的用于所述母系的具有工程化染色體EC-HR的雄性可育保持系的方法，所述方法包括(a)將保持系與所需栽培品種雜交，所述保持系為純合ms-B1ms-B1su-B1su-b1Ki-B1Ki-B1并具有異源工程化染色體EC-HR1、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a，所述栽培品種是純合Ms-B1Ms-B1Su-B1Su-B1ki-B1ki-B1；(b)收集(a)雜交的子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生雄性可育F1植株，其全部是雜合ms-B1Ms-B1Su-B1su-B1Ki-B1ki-B1-a，其20％亦攜帶該工程化染色體，是所需植株；(c)通過染色體計數(shù)和通過使用DNA標(biāo)記選擇(b)的所述所需F1植株，用所需栽培品種對其授粉產(chǎn)生BC1子代，其1/32是雜合ms-B1Ms-B1Su-B1su-B1Ki-B1ki-B1并攜帶工程化染色體EC-HR1，是所需基因型；(d)種植(c)的所述BC1植株，通過染色體計數(shù)和通過使用DNA標(biāo)記選擇所述所需基因型，再將它們做為母本與所需栽培品種回交四個連續(xù)世代產(chǎn)生第五代回交子代(BC5)，通過染色體計數(shù)和通過使用DNA標(biāo)記在每個世代選擇具有工程化染色體EC-HR1的雜合ms-B1Ms-B1Su-B1su-B1Ki-B1ki-B1后代；和(e)自交(d)的所需BC5植株，收集其子代種子并種植所述種子，由此生長BC5F2植株，其1/64是雄性不育并對雄性不育ms-B1、綠麥隆敏感性su-B1和雄配子殺傷Ki-B1等位基因純合，是所需雄性不育母系，其它具有類似基因型但亦具有攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a的工程化染色體EC-HR1的BC5F2植株是所需雄性可育保持系植株。
50．將普通小麥或硬粒小麥所需栽培品種轉(zhuǎn)化成為雄性不育母本系和權(quán)利要求28中定義的用于所述母系的具有重組工程化染色體REC-HR的雄性可育重組保持系的方法，所述方法包括(a)將具有REC-HR1的保持系做為母本與所需栽培品種雜交，所述保持系為純合ms-B1ms-B1、對6B(對su-B1和Ki-B1為半合子)和重組工程化染色體REC-HR1為單體、攜帶Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a，所述栽培品種是純合Ms-B1Ms-B1Su-B1Su-B1ki-B1ki-B1；(b)收集(a)雜交的子代種子并種植所述種子，由此產(chǎn)生雄性可育F1植株，其全部是雜合ms-B1Ms-B1，其1/2對染色體6B為二體，并因此是雜合Su-B1su-B1Ki-B1ki-B1，其1/2對染色體6B和重組工程化染色體REC-HR1為雙單體、對Su-B1和ki-B1-a為半合子但亦攜帶重組工程化染色體REC-HR1的Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a；(c)通過分析染色體配對和使用DNA標(biāo)記選擇(b)的所述二種類型的F1子代，用所需栽培品種對其授粉產(chǎn)生二種類型的BC1子代，那些源自二體F1的子代的1/4是雜合ms-B1Ms-B1，那些源自雙單體F1的子代的1/4是雙單體、雜合ms-B1Ms-B1、對Su-B1和ki-B1為半合子，并亦攜帶重組工程化染色體REC-HR1的Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a；(d)種植(c)的所述BC1子代，通過分析染色體配對和通過使用DNA標(biāo)記選擇(c)的二組所述所需植株，再將它們做為母本與所需栽培品種回交四個連續(xù)世代產(chǎn)生二種類型的第五代回交子代(BC5)，通過染色體配對分析和通過使用DNA標(biāo)記在每個世代選擇二體類型中的雜合ms-B1Ms-B1su-B1Su-B1Ki-B1ki-B1和雙單體類型中的雜合ms-B1Ms-B1、具有重組工程化染色體REC-HR1的后代；(e)用(d)的所需二體BC5對(d)的所需雙單體BC5植株授粉，產(chǎn)生二組BC5F2，一組為二體植株，其1/16是純合ms-B1ms-B1和雜合su-B1Su-B1Ki-B1ki-B1，是所需二體植株，一組為雙單體植株，其1/16是純合ms-B1ms-B1、半合子su-B1和Ki-B1，并亦攜帶重組工程化染色體REC-HR1的Ms-Ss1、rht-Ss1、Su-Ss1和ki-Sl1-a，因此為雄性可育且是所需重組保持系；(f)種植(e)的所述雙單體BC5F2種子和(e)的二體BC5F2種子，通過染色體配對分析和通過對綠麥隆的反應(yīng)選擇所需雄性可育重組保持系和雄性不育母系；(g)種植二體植株的子代，其全部是純合ms-B1ms-B1并因此為雄性不育，其1/4是純合su-B1su-B1和Ki-B1Ki-B1，是所需雄性不育母系；和(h)種植(g)的所述二體BC5F3，通過使用DNA標(biāo)記選擇所需雄性不育母系。
51．按照權(quán)利要求1-20和30-50的任何一項的方法，其中ms-B1雄性不育等位基因選自ms-B1-a、ms-B1-b和ms-B1-c或Ms-B1的任何其他等位基因。
52．按照權(quán)利要求21-29的任何一項的保持系，其中ms-B1雄性不育等位基因選自ms-B1-a、ms-B1-b和ms-B1-c或Ms-B1的任何其他等位基因。
53．按照權(quán)利要求1-20和30-50的任何一項的方法，其中對Ki-B1或任何其它雄配子殺傷基因的作用敏感的ki等位基因選自禾本科的任何物種的等位基因。
54．按照權(quán)利要求21-29和52的任何一項的保持系，其中對Ki-B1或任何其它雄配子殺傷基因的作用敏感的ki等位基因選自禾本科的任何物種的等位基因。
55．按照權(quán)利要求1-20、30-51和53的任何一項的方法，其中rht等位基因或任何其它增進高度的基因選自禾本科的任何物種的等位基因。
56．按照權(quán)利要求21-29、52和54的任何一項的保持系，其中rht等位基因或任何其它增進高度的基因選自禾本科的任何物種的等位基因。
57．按照權(quán)利要求1-20、30-51和53的任何一項的方法，其中Su等位基因選自禾本科的任何物種的等位基因。
58．按照權(quán)利要求21-29、52和54的任何一項的保持系，其中Su或任何其它除草劑抗性等位基因選自禾本科的任何物種的等位基因。
59．按照權(quán)利要求1-20、30-51和53的任何一項的方法，其中Ba等位基因選自禾本科的任何物種的等位基因。
60．按照權(quán)利要求21-29、52和54的任何一項的保持系，其中Ba等位基因選自禾本科的任何物種的等位基因。
61．產(chǎn)生普通小麥或硬粒小麥雜種植株的方法，包括(a)將父本與同一物種的雄性不育母本雜交，其中所述父本選自任何所需普通小麥或硬粒小麥栽培品種，該父本天生即對顯性野生型雄性能育性(Ms-B1)等位基因純合，所述雄性不育母本是所述小麥物種的品系，其對任何一個隱性突變雄性不育(ms-B1)等位基因和顯性雄配子殺傷(Ki-B1)等位基因純合，通過按照權(quán)利要求21-29的任何一個保持系保持所述雄性不育母本；和(b)收集(a)的雜交的子代種子，所述種子當(dāng)生長時發(fā)育成為子代雜種植株，所述植株均為雄性可育并是雜合ms-B1Ms-B1。
62．通過按照權(quán)利要求61的方法得到的普通小麥或硬粒小麥的雜種植物品系。
全文摘要
本發(fā)明提供生產(chǎn)雜交小麥的方法,該方法基于穩(wěn)定保持普通小麥或硬粒小麥基因性雄性不育母本系的能力。它亦提供對隱性雄性不育等位基因和對顯性雄配子殺傷等位基因純合的雄性不育母系,以及容易和穩(wěn)定繁殖的保持系。該保持系與母系等基因但具有一條異源工程化染色體,該染色體攜帶恢復(fù)保持系育性的顯性雄性能育性等位基因、對天然雄配子殺傷因子的殺傷效應(yīng)敏感并因此防止該染色體傳遞至母系的隱性雄配子殺傷等位基因、以及一個或多個便于保持保持系自身的選擇標(biāo)記。本發(fā)明亦提供將任何所需栽培品種轉(zhuǎn)化成為雄性不育母系和保持系的程序。
文檔編號A01H5/00GK1234722SQ98800970
公開日1999年11月10日 申請日期1998年5月14日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月15日
發(fā)明者M·菲爾德曼, E·米勒特 申請人:耶達研究及發(fā)展有限公司