專利名稱：一種被修飾多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種呼吸性變應(yīng)原性有所降低的被修飾多肽，包含呼吸性變應(yīng)原性有所降低的被修飾多肽的工業(yè)組合物，皮膚護(hù)理產(chǎn)品，被修飾多肽用于降低工業(yè)組合物和產(chǎn)品變應(yīng)原性的用途，以及降低多肽變應(yīng)原性的方法。
背景技術(shù)：
在醫(yī)療和工業(yè)應(yīng)用中，多肽、包括酶的用途是本領(lǐng)域眾所周知的。由于多肽有可能會(huì)導(dǎo)致不需要的免疫應(yīng)答-通常是IgG和/或IgE應(yīng)答，這取決于刺激的方式-因此最近三十年已開發(fā)了減小免疫應(yīng)答的技術(shù)。
一種技術(shù)是“PEG化”技術(shù)，即將數(shù)個(gè)聚合分子偶聯(lián)到目的多肽上。使用該技術(shù)時(shí)，免疫系統(tǒng)難于識別多肽表面上負(fù)責(zé)抗體形成的表位，因此降低了免疫應(yīng)答。
對于直接導(dǎo)入人體循環(huán)系統(tǒng)以達(dá)到一種特定生理效果的多肽(即藥物)而言，典型的潛在免疫應(yīng)答是IgG和/或IgM應(yīng)答；而通過呼吸系統(tǒng)吸入的多肽(即工業(yè)多肽)有可能會(huì)引起IgE應(yīng)答(即變應(yīng)原性應(yīng)答)。
對這種免疫應(yīng)答降低作出解釋的一種理論是聚合分子會(huì)遮蔽多肽表面上負(fù)責(zé)免疫應(yīng)答引起抗體形成的表位。另一種理論認(rèn)為或者至少部分因素是偶聯(lián)物越大，獲得的免疫應(yīng)答就會(huì)越低。
美國專利第4179337號涉及無免疫原性多肽，例如與聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)偶聯(lián)的酶和肽激素。至少保留了多肽生理活性的15％。該專利以分子量約750Da-6000Da的PEG為例進(jìn)行了描述，這些多肽并不用于工業(yè)應(yīng)用中。
WO96/17929(Novo Nordisk A/S)描述了與聚合分子如PEG偶聯(lián)的被修飾多肽偶聯(lián)物。該被修飾的酶可用于多種工業(yè)應(yīng)用中。實(shí)施例中與多肽偶聯(lián)的聚合分子的分子量分別是5000、15000和35000Da。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及變應(yīng)原性有所降低的被修飾多肽和含有被修飾多肽、可用于工業(yè)應(yīng)用的組合物和產(chǎn)品。
人們通常相信，聚合分子的分子量和長度不應(yīng)太短/輕，因?yàn)槎?輕聚合分子不能有效地遮蔽多肽表面。
本發(fā)明人已證實(shí)，對于用于工業(yè)應(yīng)用中、不會(huì)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的多肽(例如酶)來說，這種說法是錯(cuò)誤的。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)所研究的多肽用于工業(yè)應(yīng)用中(其中潛在危險(xiǎn)是該多肽被吸入后造成的變應(yīng)原性應(yīng)答)時(shí)，可以將親本多肽與分子量為100-5000Da、優(yōu)選100-2000Da、尤其是100-1000Da的聚合分子偶聯(lián)，而不會(huì)喪失使呼吸性變應(yīng)原性應(yīng)答顯著降低的能力。
第一方面，本發(fā)明涉及偶聯(lián)了分子量為100-低于750Da、尤其是100-500Da、比如300Da左右的聚合分子的多肽。
第二方面，本發(fā)明涉及含有偶聯(lián)了分子量為100-5000Da的聚合分子的被修飾多肽、用于工業(yè)產(chǎn)品中的組合物。工業(yè)多肽工業(yè)應(yīng)用中所用的多肽常常有酶活性和/或抗微生物活性。與藥用多肽相反，工業(yè)多肽并不打算導(dǎo)入機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)。
因此，工業(yè)多肽，如工業(yè)組合物和/或產(chǎn)品(如下述，例如去污劑，包括衣物和碗碟洗滌劑；食品或飼料添加劑，包括面包制備用的添加劑；處理紡織品的組合物；以及個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品，包括化妝品)中用作活性成分的酶不太可能與人或動(dòng)物機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)直接接觸，因?yàn)檫@樣的多肽(或包含這類多肽的產(chǎn)品)不會(huì)注射到(或通過其它途徑進(jìn)入)血管中。
因此，就工業(yè)多肽而言，潛在的危險(xiǎn)是通過呼吸道吸入多肽引起的呼吸性變態(tài)反應(yīng)(即IgE應(yīng)答)。
在本發(fā)明上、下文中，“工業(yè)多肽”定義為不打算導(dǎo)入人和/或動(dòng)物體循環(huán)系統(tǒng)的多肽，包括肽、蛋白質(zhì)和/或酶。
這類“工業(yè)多肽”的例子包括如下述具有酶活性的多肽。
本發(fā)明也涉及變應(yīng)原性有所降低的皮膚護(hù)理產(chǎn)品。
此外，本發(fā)明還涉及分子量為100-5000Da、優(yōu)選100-2000Da、特別是100-1000Da的被修飾多肽在降低工業(yè)產(chǎn)品變應(yīng)原性方面的用途。
本發(fā)明最后涉及通過將多肽偶聯(lián)分子量為100-5000Da的聚合分子而降低多肽變應(yīng)原性的方法。發(fā)明詳述本發(fā)明的目的是提供變應(yīng)原性有所降低的被修飾多肽，以及含有變應(yīng)原性有所降低的被修飾多肽、可用于工業(yè)用途的組合物和產(chǎn)品。
術(shù)語“變應(yīng)原性有所降低”在本發(fā)明上、下文中是指與相應(yīng)的親本多肽相比，當(dāng)吸入本發(fā)明的被修飾多肽時(shí)，產(chǎn)生的會(huì)導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)的IgE(在人中為IgE，在特定動(dòng)物中為具有類似作用的分子)的量有所降低?？捎眯g(shù)語“呼吸性變應(yīng)原性”代替。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)多肽是用于工業(yè)應(yīng)用中(其中主要的潛在危險(xiǎn)是因吸入多肽導(dǎo)致的變態(tài)反應(yīng))時(shí)，親本多肽可以與分子量為100-5000Da、優(yōu)選100-2000Da、特別是100-1000Da的聚合分子偶聯(lián)，而不會(huì)喪失使變態(tài)反應(yīng)顯著降低的能力。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，與多肽(特別是酶)偶聯(lián)的聚合分子的分子量為100-750Da，如100-500Da，例如約300Da。
令人驚奇的是，與多肽偶聯(lián)的聚合分子可以如此之小，并證實(shí)了一個(gè)現(xiàn)有假說是錯(cuò)誤的，即與多肽偶聯(lián)的聚合分子的分子量和長度不應(yīng)太短/小，因?yàn)槎?小的聚合分子不能充分遮蔽多肽表面。
本發(fā)明第一方面涉及有分子量為100-750Da、特別是100-500Da、如300Da左右的聚合分子共價(jià)偶聯(lián)到分子量為5-100kDa(如15-60kDa)的親本多肽上的被修飾多肽。
因?yàn)槎?小的聚合分子抑制多肽功能活性的可能性更小，故將短/小的聚合分子偶聯(lián)到目的多肽上更有優(yōu)勢。例如，與偶聯(lián)了更大/重的聚合分子的相應(yīng)酶相比，偶聯(lián)了具有如本發(fā)明上述分子量大小的聚合分子的酶其活性位點(diǎn)對底物來說更易于接近，因?yàn)榫酆戏肿右鸬目臻g阻礙更不突出。此外，與偶聯(lián)了更大/重的聚合分子的相應(yīng)偶聯(lián)物相比，具有更小/輕的聚合分子的多肽-聚合物偶聯(lián)物其穩(wěn)定性更有改善，因?yàn)閷⒍嚯慕Y(jié)構(gòu)不同方向拉扯的重量更小，使多肽結(jié)構(gòu)的變形達(dá)到最小。
使用小聚合分子的另一優(yōu)點(diǎn)是它們的價(jià)格更便宜，因?yàn)榫酆衔锸钦撉Э顺鍪鄣?。這樣可降低制備本發(fā)明偶聯(lián)物時(shí)的成本。
變應(yīng)原性評價(jià)可以通過吸入檢驗(yàn)，并比較氣管內(nèi)施用親本多肽的效果與施用本發(fā)明相應(yīng)的被修飾多肽的效果來評價(jià)變應(yīng)原性。
現(xiàn)有幾種用于多肽變應(yīng)原性評價(jià)的體內(nèi)動(dòng)物模型。某些這樣的模型為人類中的危險(xiǎn)評價(jià)提供了合適的依據(jù)。適合的模型包括豚鼠模型和小鼠模型。這些模型設(shè)法將呼吸性變應(yīng)原表示為在以前致敏的動(dòng)物中所誘導(dǎo)的刺激反應(yīng)的函數(shù)。按照這些模擬，將所宣稱的變應(yīng)原通過氣管內(nèi)引入動(dòng)物。
豚鼠的一個(gè)適合品系(Dunkin Hartley品系)不會(huì)因變應(yīng)性應(yīng)答而產(chǎn)生IgE抗體，這一點(diǎn)與人類不同。然而，它們產(chǎn)生另一種類型的抗體IgG1A與IgG1B(參見，例如，Prentφ，ATLA，19，P.8-14，1991)，這些抗體造成了對所吸入的多肽(包括酶)產(chǎn)生變應(yīng)原性應(yīng)答。因此，當(dāng)使用Dunkin Hartley動(dòng)物模型時(shí)，IgG1A和IgG1B的相對量可以表示變應(yīng)原性水平。
適合于氣管內(nèi)接觸多肽(例如酶)的大鼠品系是Brown Norway品系。Brown Norway大鼠產(chǎn)生IgE作為變應(yīng)性應(yīng)答。在舉例說明本發(fā)明的實(shí)施例4和5的實(shí)驗(yàn)中使用了Brown Norway大鼠。
在豚鼠和小鼠中評價(jià)呼吸性變應(yīng)原的更多細(xì)節(jié)由Kimber等(1996)，基礎(chǔ)與應(yīng)用毒理學(xué)，33，P.1-10描述。
其它動(dòng)物(如兔子)也可以用于類似研究中。
聚合分子偶聯(lián)到多肽上的聚合分子可以是具有本發(fā)明所限定分子量的任何適合的聚合分子，包括天然和合成的均聚物[如聚醇(即poly-OH)、聚胺(即poly-NH2)以及聚羧酸(即poly-COOH)]以及雜聚物，即包含一種或多種不同偶聯(lián)基團(tuán)(如羥基與胺基)的聚合物。
適合的聚合分子的例子包括選自含有下述各類分子的組中的聚合分子聚亞烷基氧化物(PAO)，如聚亞烷基二醇(FAG)，包括聚乙二醇(PEG)，甲氧基聚乙二醇(mPEG)以及聚丙二醇、PEG-縮水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)、分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚D，L-氨基酸、乙烯-馬來酸酐共聚物、苯乙烯-馬來酸酐共聚物，葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖、肝素、同源的白蛋白、纖維素，包括甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羧乙基纖維素以及羥丙基纖維素，聚氨基葡糖的水解產(chǎn)物、淀粉(如羥乙基淀粉和羥丙基淀粉)、糖原、瓊脂糖及其衍生物、瓜爾膠、支鏈淀粉、菊粉、黃原酸膠(xanthangum)、角叉菜膠(carrageenan)、果膠、藻酸水解產(chǎn)物和生物聚合物。
優(yōu)選的聚合分子是無毒性的聚合分子，如(m)聚乙二醇(mPEG)，還要求這些分子共價(jià)偶聯(lián)到酶表面連接基團(tuán)上的化學(xué)方法相對比較簡單。
一般看來，聚亞烷基氧化物(PAO)(如聚氧乙烯，如PEG，特別是mPEG)是優(yōu)選的聚合分子，因?yàn)檫@些聚合分子與多糖(如葡聚糖、支鏈淀粉等)相比，它們所具有的能交聯(lián)的活性基團(tuán)(并不合乎需要)很少。
按照本發(fā)明，盡管可以使用所有上述的聚合分子，但優(yōu)選地使用甲氧基聚乙二醇(mPEG)和雙羥基聚乙二醇。
聚合物的活化如果將與目的多肽偶聯(lián)的聚合分子沒有活性，就必須使用適合方法使其活化。根據(jù)本發(fā)明，聚合分子也可通過連接子與多肽偶聯(lián)。適合的連接子對熟練技術(shù)人員是熟知的。
用于活化聚合分子以及用于偶聯(lián)多肽的方法和化學(xué)原理在文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述。一般用于活化不溶性聚合物的方法包括用下列化合物活化官能團(tuán)溴化氰、高碘酸、戊二醛、雙環(huán)氧化合物(biepoxides)、環(huán)氧氯丙烷、二乙烯基砜、碳二亞胺、磺?；u化物、三氯三嗪等(參見R.F.Taylor，(1991)，“蛋白質(zhì)固定，基礎(chǔ)和應(yīng)用”，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，“蛋白質(zhì)偶聯(lián)和交聯(lián)的化學(xué)”，CRC出版社，Boca Raton；G.T.Hermanson等，(1993)，“固定的親和性配體技術(shù)”，學(xué)院出版社，N.Y.)。其中一些方法涉及不溶性聚合物的活化，但是也適用于可溶性聚合物(如高碘酸，三氯三嗪、磺酰基鹵化物、二乙烯基砜、碳二亞胺等)的活化。在選擇活化與偶聯(lián)化學(xué)方法中必須考慮聚合物上的官能團(tuán)氨基、羥基、巰基、羧基、醛或硫氫基以及蛋白質(zhì)上選定的連接基團(tuán)，活化與偶聯(lián)化學(xué)方法通常包括i)聚合物的活化，ii)偶聯(lián)，iii)剩余活性基團(tuán)的封閉。
下面簡要描述許多適合的聚合物活化方法。然而，應(yīng)該理解也可以使用其它方法。
將聚合分子偶聯(lián)到多肽的游離酸基團(tuán)上可以借助于二酰亞胺和，例如氨基-PEG或肼基-PEG(Pollak等，(1976)，J.Amr.Chem.Soc.，98，289-291)或重氮基乙酸酯/酰胺(Wong等，(1992)，“蛋白質(zhì)偶聯(lián)和交聯(lián)化學(xué)”，CRC出版社)進(jìn)行。
將聚合分子偶聯(lián)到羥基上通常是非常困難的，因?yàn)檫@必須在水中進(jìn)行。而通常水解反應(yīng)比與羥基的反應(yīng)更占優(yōu)勢。
將聚合分子偶聯(lián)到游離硫氫基上可以用特定基團(tuán)(如馬來酰亞胺或鄰吡啶基二硫化物)達(dá)到。乙烯基砜(美國專利no.5,414,135，(1995)，Snow等)優(yōu)先偶聯(lián)于硫氫基上，但是不象提到的其它化合物那樣有選擇性。
可以通過包含兩個(gè)鄰近羰基的基團(tuán)靶向多肽鏈中的可及精氨酸殘基。
涉及將親電子性地活化的PEG偶聯(lián)到賴氨酸的氨基上的技術(shù)也可能有用。醇的許多常規(guī)離去基團(tuán)形成胺鍵。例如，可以使用烷基磺酸鹽，如tresylates(Nilsson等，(1984)，酶學(xué)方法，104卷，Jacoby W.B.編，學(xué)院出版社Orlando，P.56-66；Nilsson等，(1987)，酶學(xué)方法，135卷，Mosbach K.編，學(xué)院出版社Orlando，P.65-79；Scouten等，(1987)，酶學(xué)方法，135卷，Mosbach K.編，學(xué)院出版社Orlando，P.79-84；Crossland等，(1971)，J.Amr.Chem.Soc.1971，93，pp.4217-4219)、甲磺酸鹽(Harris，1985，同上；Harris等，(1984)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.22，pp 341-352)、芳基磺酸鹽(如甲苯磺酸鹽)以及對硝基苯磺酸鹽。
有機(jī)磺酰氯(例如Tresyl氯化物)可有效地將許多聚合物(例如PEG)中的羥基轉(zhuǎn)化成良好的離去基團(tuán)(磺酸鹽)，當(dāng)與多肽中的親核基團(tuán)(如氨基)進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，該離去基團(tuán)使得可以在聚合物和多肽之間形成穩(wěn)定的鍵。除了要有高的偶聯(lián)產(chǎn)率之外，反應(yīng)條件通常還要求比較溫和(中性或微堿性pH值，以避免變性和活性極少或沒有破壞)，并且滿足多肽需要的非破壞性條件。
甲苯磺酸鹽比甲磺酸鹽反應(yīng)性更強(qiáng)，而且更不穩(wěn)定地分解成PEG、二噁烷和磺酸(Zalipsky，(1995)，生物偶聯(lián)物化學(xué)，6，150-165)。環(huán)氧化合物也可以用于產(chǎn)生胺鍵，但是活性比上述基團(tuán)弱得多。
用碳酰氯將PEG轉(zhuǎn)化成氯甲酸酯將產(chǎn)生與賴氨酸的氨基甲酸酯鍵。這一轉(zhuǎn)變可以多種變化形式進(jìn)行，如用N-羥基琥珀酰亞胺(美國專利no.5,122,614，(1992)；Zalipsky等，(1992)，生物技術(shù)應(yīng)用和生物化學(xué)，15，P.100-114；Monfardini等，(1995)，生物偶聯(lián)物化學(xué)，6，62-69)、用咪唑(Allen等，(1991)，Carbohydr.Res.，213，pp309-319)、用對硝基苯酚、DMAP(EP 632 082 A1，(1993)，Looze，Y.)等替代氯。通常通過使氯甲酸酯與所需的離去基團(tuán)反應(yīng)來制備衍生物。所有這些基團(tuán)均產(chǎn)生與肽的氨基甲酸酯鍵。
此外，可以分別使用異氰酸鹽和異硫氰酸鹽來產(chǎn)生脲和硫脲。
使用如上所述的相同的離去基團(tuán)和環(huán)狀亞胺thrones，可以從PEG酸(美國專利no.5,349,001，(1994)，Greenwald等)獲得酰胺。這些化合物的反應(yīng)活性十分高，但是可能會(huì)使水解太快。
也可以使用從與琥珀酸酐反應(yīng)制備的PEG琥珀酸酯。由此所形成的酯基使偶聯(lián)物對水解更加敏感得多(美國專利no.5,122,614，(1992)，Zalipsky)。這一基團(tuán)可以用N-羥基琥珀酰亞胺活化。
此外，可以引入一個(gè)特殊的連接子。最古老的是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1977)，生物化學(xué)雜志，252，3578-3581；美國專利no.4,179,337，(1979)，Davis等；Shafer等，(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.，24，375-378)。
將PEG偶聯(lián)到芳香族胺上，隨后重氮化，將產(chǎn)生非?；钴S的重氮鹽，其在原位可與肽反應(yīng)。通過使PEG的吖內(nèi)酯衍生物(美國專利no.5,321,095，(1994)，Greenwald，R.B.)反應(yīng)，也可以形成酰胺鍵，因此引入又一個(gè)酰胺鍵。
由于一些肽不包含許多賴氨酸，因此，將多于一個(gè)PEG連接到相同的賴氨酸上有可能是有利的。這可以通過例如使用1，3-二氨基-2-丙醇進(jìn)行。
也可以將PEG通過氨基甲酸酯鍵連接到酶的氨基上(WO95/11924，Greenwald等)。賴氨酸殘基也可以用作主鏈。
偶聯(lián)的聚合分子的位置實(shí)際上，所有離子化基團(tuán)(如賴氨酸殘基的氨基)均位于多肽分子的表面(參見例如Thomas E.Creighton，(1993)，“蛋白質(zhì)”，W.H.Freeman和Company，紐約)。因此，在多肽的表面上容易達(dá)到的連接基團(tuán)(即氨基)數(shù)目等于多肽一級結(jié)構(gòu)中的賴氨酸殘基加N-末端氨基的數(shù)目。
根據(jù)本發(fā)明，可以有1-100個(gè)聚合分子、優(yōu)選4-50個(gè)聚合分子、5-35個(gè)聚合分子偶聯(lián)到親本多肽上。
親本多肽可以在親本多肽、通常是分子量為5-100kDa、優(yōu)選15-60kDa的親本多肽基礎(chǔ)上，利用本領(lǐng)域已知的任何合適技術(shù)制備本發(fā)明的被修飾多肽。
術(shù)語“親本”多肽是指任何未偶聯(lián)的多肽(即要修飾的多肽)。該多肽優(yōu)選地可以是微生物來源的，如細(xì)菌、絲狀真菌或酵母來源的。
親本多肽可以是天然存在的(或野生型)多肽或其變體。
優(yōu)選多肽是具有抗微生物活性的酶和多肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述酶是適用于皮膚護(hù)理組合物和產(chǎn)品的酶，它在皮膚護(hù)理產(chǎn)品中所用的pH范圍內(nèi)具有顯著的酶促活性。
選擇親本多肽時(shí)，最好使用具有多個(gè)連接基團(tuán)的多肽。
另外，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合分子廣泛分布于多肽的表面上。對于酶，優(yōu)選在活性位點(diǎn)附近的區(qū)域不偶聯(lián)聚合分子。
在本發(fā)明的上下文中，“廣泛分布于”是指其所處的位置能使得偶聯(lián)到多肽連接基團(tuán)的聚合分子能遮蔽多肽表面的不同部分(優(yōu)選地是整個(gè)表面或接近于整個(gè)表面)，以確?？勺R別的有關(guān)表位受到遮蔽，由此不被免疫系統(tǒng)的抗體識別。人們相信多肽和抗體之間相互作用的表面積大約為5002(26×19)(參見Sheriff等，(1987)，美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)，84卷，p.8075)。
優(yōu)選地，多肽上的兩個(gè)或多個(gè)連接基團(tuán)應(yīng)不相互靠近，因?yàn)檫B接基團(tuán)相互鄰近很可能會(huì)導(dǎo)致僅能偶聯(lián)一個(gè)聚合分子。
對于酶，為了確保酶促活性的損失最小，優(yōu)選地不將聚合分子偶聯(lián)到活性位點(diǎn)的近距離范圍內(nèi)。通常看來以距離活性位點(diǎn)5、優(yōu)選地10的范圍內(nèi)沒有聚合分子偶聯(lián)為佳。
而且，按照本發(fā)明，在免疫系統(tǒng)可識別的已知表位或接近于所說的表位偶聯(lián)了聚合分子的多肽也被視為很有好處。如果表位的位置是未知的，則將許多聚合分子偶聯(lián)到多肽表面可及的連接基團(tuán)上是頗為有利的。優(yōu)選的是所說的連接基團(tuán)以離活性位點(diǎn)適合的距離廣泛分布于多肽的表面。
按照本發(fā)明，優(yōu)選的是符合上述有關(guān)偶聯(lián)聚合分子在多肽表面分布要求的被修飾多肽。
對于酶，尤其優(yōu)選沒有或只有極少數(shù)聚合分子(即0-2個(gè))偶聯(lián)到距離活性位點(diǎn)0-5范圍內(nèi)、優(yōu)選地0-10范圍內(nèi)的酶。
酶活性親本酶可以具有已知用于皮膚護(hù)理的任何活性。所涉及的酶包括氧化還原酶(E.C.1，“酶命名法，(1992)，學(xué)院出版公司)，如漆酶和超氧化物歧化酶(SOD)；水解酶E.C.3，包括蛋白酶，特別是絲氨酸蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶，以及脂類分解酶；轉(zhuǎn)移酶，(E.C.2)，如轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG酶)；異構(gòu)酶(E.C.5)，如蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)。
水解酶蛋白水解酶所涉及的蛋白水解酶包括選自下列組、具有上述性質(zhì)(即連接基團(tuán)的數(shù)目，連接基團(tuán)的位置等)的蛋白酶酸性天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶，或金屬蛋白酶。
具有適合數(shù)目偶聯(lián)基團(tuán)的合適親本蛋白酶的特定例子示于表1中
表
外，諸賴氨酸殘基在該酶的表面上廣泛分布(即遠(yuǎn)離活性位點(diǎn))。
枯草桿菌蛋白酶DY具有27 kDa的分子量，在其表面上有12個(gè)氨基(即賴氨酸殘基)，還有一個(gè)N末端氨基(參見SEQ ID NO.3)。
親本蛋白酶Lion Y具有46 kDa的分子量，在其表面上有14個(gè)氨基(即賴氨酸殘基)，還有一個(gè)N末端氨基(參見SEQ ID NO.4)。
中性金屬蛋白酶嗜熱菌蛋白酶具有34 kDa的分子量，并在其表面上有11個(gè)氨基(即賴氨酸殘基)，還有一個(gè)N末端氨基(參見SEQ IDNO.5)。
脂類分解酶所涉及的脂類分解酶包括柔毛腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶(如在EP 258 068和EP 305 216中描述的那一種)，Humicolainsolens、Rhizomucor miehei脂肪酶(如EP 238 023所述)，犁頭酶脂類分解酶(WO 96/13578)，假絲酵母屬脂肪酶(如C.antarctica脂肪酶，例如在EP 214 761中描述的C.antarctica脂肪酶A或B)，假單胞菌屬脂肪酶(例如產(chǎn)堿假單胞菌、類產(chǎn)堿假單胞菌脂肪酶，如EP 218 272中所述；洋蔥假單孢菌脂肪酶，如EP 331 376中所述；WO95/14783中所公開的假單孢菌脂肪酶)，芽孢桿菌脂肪酶(例如枯草芽孢桿菌脂肪酶(Dartois等，(1993)Biochemica et Biophysicaacta，1131，253-260)、嗜熱脂肪芽孢桿菌脂肪酶(JP 64/744992)和短小芽孢桿菌脂肪酶(WO 91/16422))。其它類型的脂類分解酶包括角質(zhì)酶，例如源自柔毛腐質(zhì)霉或門多薩假單胞菌的角質(zhì)酶(WO88/09367)，或源自Fusarium solanipisi的角質(zhì)酶(WO 90/09446)。
氧化還原酶漆酶所涉及的漆酶包括在Novo Nordisk的WO 96/00290與WO95/33836中所公開的漆酶。
其它氧化還原酶包括過氧化氫酶、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶和脂肪氧化酶。
轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶適合的轉(zhuǎn)移酶包括在WO 96/06931(Novo Nordisk A/S)和WO96/22366(Novo Nordisk A/S)中所公開的任何轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
異構(gòu)酶蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶適合的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶包括在WO 95/01425(Novo NordiskA/S)中描述的那些PDI，但并不限于此。工業(yè)組合物本發(fā)明又一方面涉及含有變應(yīng)原性有所降低的被修飾多肽的“工業(yè)組合物”。
在本發(fā)明上下文中，“工業(yè)多肽”指不打算導(dǎo)入循環(huán)系統(tǒng)的組合物。換句話說，指的是不打算經(jīng)皮內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用的組合物。
如上所述，對于工業(yè)應(yīng)用中的多肽(例如酶)來說，主要問題是可能會(huì)因呼吸系統(tǒng)吸入，即氣管內(nèi)或鼻內(nèi)接觸而導(dǎo)致呼吸性變態(tài)反應(yīng)。
“工業(yè)多肽”的例子是組合物或產(chǎn)品如洗滌劑中所用的多肽，特別是酶，所述洗滌劑包括衣物和碗碟洗滌劑，家用清潔產(chǎn)品，農(nóng)用化學(xué)品，個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品如皮膚護(hù)理產(chǎn)品，包括美容和沐浴產(chǎn)品，口服和經(jīng)皮藥物，處理/加工紡織品所用的組合物，硬表面清潔組合物，食品和飼料生產(chǎn)中所用的組合物，包括食品或飼料添加劑，如制備面包等的添加劑，等等。特別包括在本發(fā)明中的是皮膚護(hù)理產(chǎn)品和洗滌劑。
皮膚護(hù)理產(chǎn)品本發(fā)明中，“皮膚護(hù)理產(chǎn)品”涵蓋機(jī)體皮膚清潔、護(hù)理和/或美容所用的所有個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品，還包括其它產(chǎn)品，如頭發(fā)護(hù)理產(chǎn)品，它們在使用中可能會(huì)接觸皮膚或呼吸系統(tǒng)。用于動(dòng)物的相應(yīng)產(chǎn)品也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
所涉及的本發(fā)明皮膚護(hù)理產(chǎn)品的具體例子有肥皂、化妝品、護(hù)膚膏、護(hù)膚凝膠、護(hù)膚奶、潔膚洗液、清潔霜、清潔露、潔膚奶、冷霜、皂膏、化妝基料、清潔乳、面膜、含鋅化妝水、T區(qū)精華素、潤手香脂、香粉、增白粉、皂粉、塊皂、透明皂、唇膏、口紅、營養(yǎng)素、粉底霜、搽臉粉、眼影粉、粉底、指甲油清潔劑、生發(fā)油、美發(fā)液、發(fā)乳、發(fā)用凝膠、滋發(fā)劑、頭發(fā)定形制品、染發(fā)劑、頭發(fā)著色劑、頭皮滋潤劑(scalp treatment)、香波、香膏、護(hù)發(fā)素、發(fā)膠、曬黑油(sun oil)、防曬品、剃須泡沫與凝膠、剃須膏、嬰兒油、防治粉刺制品、止汗劑、驅(qū)蟲劑、祛臭劑等。適于皮膚護(hù)理的酶活性本發(fā)明的皮膚護(hù)理組合物包含變應(yīng)原性有所降低的被修飾酶和已知用于皮膚護(hù)理組合物的諸成分。
已知許多酶活性可用于皮膚護(hù)理組合物。
蛋白酶蛋白酶是潔膚產(chǎn)品中的有效成分。蛋白酶能除去皮膚死亡角質(zhì)細(xì)胞的上層，由此使皮膚看上去更有光澤、更為柔嫩。而且，蛋白酶也能提高皮膚的光滑性。
蛋白酶可用于盥洗用品、盆浴和淋浴產(chǎn)品，包括香波、調(diào)理劑、洗劑、乳膏、肥皂塊、香皂以及液態(tài)肥皂。
脂肪酶脂肪酶可作為潔膚產(chǎn)品和抗痤瘡產(chǎn)品中的有效成分用于化妝品用途中，以除去過多的皮膚脂類，也可作為皮膚護(hù)理有效成分用于盆浴和淋浴產(chǎn)品(如乳膏和洗劑)中。
脂肪酶也可以用于頭發(fā)清潔產(chǎn)品(例如香波)中，以有效地從頭發(fā)表面除去皮脂和其它脂肪物質(zhì)。
氧化還原酶用于個(gè)人護(hù)理用途的最常用的氧化還原酶是與底物(如葡萄糖)一起能確保產(chǎn)生H2O2的氧化酶(通常是葡糖氧化酶)，然后H2O2可起始過氧化物酶(通常是乳過氧化物酶)對例如SCN-或I-的氧化，形成抗微生物試劑(SCNO-或I2)。已知這一酶促復(fù)合物天然存在于例如乳汁和唾液中。
商業(yè)上，過氧化物酶在口腔護(hù)理產(chǎn)品(漱口液、牙粉、口香糖)中一直用作抗微生物體系，在這些產(chǎn)品中，它也可以與淀粉葡糖苷酶結(jié)合使用，以產(chǎn)生葡萄糖。已知這些體系也用于化妝品中，以利于保存。
氧化還原酶另一個(gè)應(yīng)用是使用氧化酶、過氧化物酶和漆酶進(jìn)行氧化性染發(fā)(參見例如Novo Nordisk的WO 96/00290或WO95/33836)。
已知在皮膚(和頭發(fā))表面形成的自由基與皮膚的老化過程(頭發(fā)的損壞)相關(guān)。
自由基會(huì)激活能導(dǎo)致脂膜、膠原以及細(xì)胞受到破壞的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
自由基清除劑(如超氧化物歧化酶)在化妝品中的應(yīng)用是眾所周知的(R.L.Goldemberg，DCI，Nov.93，P.48-52)。
蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)也是一種氧化還原酶。它可以用于燙發(fā)(使頭發(fā)中的二硫鍵還原和再氧化)和修復(fù)受損頭發(fā)(其中損傷主要是原有二硫鍵發(fā)生了還原)。
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶用于皮膚、頭發(fā)或指甲的皮膚護(hù)理組合物包含(a)氨基有功能的活性成分，(b)催化活性成分與皮膚、頭發(fā)或指甲交聯(lián)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，以及(c)在美國專利NO.5,490,980中已知的載體。
適合用于哺乳動(dòng)物皮膚、頭發(fā)或指甲的化妝品組合物包含(a)量足以在所說的皮膚、頭發(fā)或指甲上形成保護(hù)層的至少一種角質(zhì)細(xì)胞(corneocyte)包膜蛋白；(b)量足以使得在角質(zhì)細(xì)胞包膜蛋白和所說皮膚、頭發(fā)或指甲角質(zhì)層中暴露于外部的角質(zhì)細(xì)胞蛋白質(zhì)之間形成共價(jià)鍵的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；(c)量足以激活轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的鈣離子；以及(d)化妝上可接受的載體，其中所說的組合物包含具有兩相的乳化劑，其中所說的角質(zhì)細(xì)胞包膜蛋白質(zhì)包含在該兩相中的一相內(nèi)，而轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶包含在另一相內(nèi)(參見美國專利NO.5,525,336)。
JP 3083908描述了一種皮膚化妝品材料，其中含有用水溶性物質(zhì)修飾過的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。該修飾物質(zhì)是例如聚乙二醇、乙二醇、丙二醇、甘油、聚乙烯醇、葡萄糖、蔗糖、海藻酸、羧甲基纖維素、淀粉以及羥丙基纖維素中的一種或多種。這種修飾是通過例如導(dǎo)入活性基團(tuán)并與酶鍵合完成的。這樣提供了一種對皮膚比較溫和、隨時(shí)間褪色和變味的程度較小、并具有良好的醫(yī)治粗糙皮膚、保溫性以及美化調(diào)理皮膚效果的物質(zhì)。
本發(fā)明的皮膚護(hù)理產(chǎn)品本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及包含本發(fā)明皮膚護(hù)理組合物的皮膚護(hù)理產(chǎn)品。術(shù)語“皮膚護(hù)理產(chǎn)品”如上定義。
本發(fā)明的皮膚護(hù)理產(chǎn)品可以包含有效量的本發(fā)明的被修飾酶。本領(lǐng)域熟練人員所知的這種有效量常占最終皮膚護(hù)理產(chǎn)品的0以上-5％。
所涉及的本發(fā)明皮膚護(hù)理產(chǎn)品包括但不限于下列產(chǎn)品肥皂、化妝品、護(hù)膚膏、護(hù)膚凝膠、護(hù)膚奶、潔膚洗液、清潔霜、清潔露、潔膚奶、冷霜、皂膏、化妝基料、清潔乳、面膜、含鋅化妝水、T區(qū)精華素、潤手香脂、香粉、增白粉、皂粉、塊皂、透明皂、唇膏、口紅、營養(yǎng)素、粉底霜、搽臉粉、眼影粉、粉底、指甲油清潔劑、生發(fā)油、美發(fā)液、發(fā)乳、發(fā)用凝膠、滋發(fā)劑、頭發(fā)定形制品、染發(fā)劑、頭發(fā)著色劑、頭皮滋潤劑、香波、香膏、護(hù)發(fā)素、發(fā)膠、曬黑油、防曬品、剃須泡沫、剃須膏、嬰兒油、防治粉刺制品、止汗劑、驅(qū)蟲劑、祛臭劑等。
常規(guī)皮膚護(hù)理產(chǎn)品配方術(shù)語“用于皮膚護(hù)理產(chǎn)品的成分”是指包括已知用于皮膚護(hù)理產(chǎn)品配方中的所有有效成分。這種成分的例子可參見“化妝品和盥洗用品”(由Wilfried Umbach編輯，由Ellis Horwood有限公司出版，英國，(1991))以及“消費(fèi)品中的表面活性劑”(由J.Falbe編輯，由Spring-Verlag出版，(1987))。
下面非窮盡性地列出了一些指導(dǎo)性配方，概述了本發(fā)明所涉及的重要皮膚護(hù)理產(chǎn)品配方。
香皂成分 例子 ％表面活性劑肥皂(鈉鹽) 83-87螯合劑乙二胺四乙酸鹽 0.1-0.3稠度調(diào)節(jié)劑氯化鈉 大約0.5染料 ＜0.1光學(xué)增白劑 ＜0.1抗氧化劑 2，6-雙(1，1-二甲基乙基)-4-甲 0.1-0.3基苯酚(BHT)增白劑二氧化鈦 0.1-0.3香料 1.0-2.0酶蛋白酶/脂肪酶 0-5水分 差額合成洗滌劑成分 例子 ％表面活性劑月桂基硫酸鹽 30-50月桂基磺基琥珀酸鹽 1-12加脂劑 脂肪醇 10-20成形劑 單/二硬脂酰甘油酯 0-10填料 淀粉 0-10活性劑 水楊酸 0-1染料 ＜0.2香料 0-2酶 蛋白酶/脂肪酶 0-5水分 差額泡沫浴和淋浴成分 例子 ％泡沫浴 ％淋浴表面活性劑 月桂基醚硫酸鹽 10-2010-12椰油酰胺丙基二甲基甜菜堿 2-4 2-4乙氧基化脂肪酸 0.5-2-加脂劑 脂肪醇 0.5-3乙氧基化脂肪醇 0.5-50-4酶 蛋白酶/脂肪酶0-5 0-5成分 例子 ％泡沫浴 ％淋浴泡沫穩(wěn)定劑 脂肪酸鏈烷醇酰胺 0.2-20-4調(diào)理劑 季銨化羥丙基纖維素 -0-0.5增稠劑 氯化鈉 0-3 0-3珠光劑 乙二醇硬脂酸酯 0-2 -活性劑 蔬菜提取物 0-1 0-1防腐劑 5-溴-5-硝基-1，3-二噁烷 0.1 0.1染料 0.1-0.2 0.1香料 0.3-30.3-2酶 蛋白酶/脂肪酶0-5 0-5水分 差額 差額護(hù)膚膏(油包水型和水包油型)成分例子 ％油包水型/水包油型乳化劑 脫水山梨醇倍半油酸酯 3-5 -硬脂酸鋁 1-2 -三乙醇胺硬脂酸 -1-2十六烷醇/十八烷醇聚二醇醚-1-3脂肪衍生棕櫚酸異丙酯 1-5 0-3物十六烷醇/十八烷醇-0-22-辛基十二烷醇 2-10 3-7硬脂酸/棕櫚酸-0-3辛酸/癸酸甘油三酯5-10 -甘油硬脂酸酯 -0-5濕潤劑 甘油 1-5 1-5山梨糖醇 1-5 1-5聚(羥基羧酸) 0.5-2-丙二醇 -0-3穩(wěn)定劑 硫酸鎂 0-0.8-防腐劑 對羥基苯甲酸酯 0.2-0.4 0.2-0.4酶 蛋白酶/脂肪酶0-5 0-5水分 差額 差額用于濕潤皮膚的爽身水(水包油型)和爽膚水成分例子 ％爽身水 ％爽膚水乳化劑 十六烷醇/十八烷醇聚二醇醚1-3-脫水山梨醇單月桂酸酯 0.5-1 -硬脂酸鈉 - 1-2月桂基醚硫酸鈉 - 0.5-2脂肪衍生 2-辛基十二烷醇1-3 0-5物石蠟油(paraflin oils) - 20-25蜂蠟 0.5-1 -硬脂酸異辛酯 3-7 -棕櫚酸異丙酯 - 2-5濕潤劑 甘油 3-5 5-10山梨糖醇 - 0-5增稠劑 聚丙烯酸酯0-0.3 0-1甲基羥丙基纖維素 0-0.3 0-0.5防腐劑 對羥基苯甲酸酯0.2-0.4 0.2-0.4酶 蛋白酶/脂肪酶 0-5 0-5水分 差額差額潤面露成分 例子 ％表面活性劑 月桂基醚硫酸鎂 0.2-0.5加脂劑 己二酸二正丁基酯 1-2增溶劑 蓖麻油聚二醇醚 0.1-1清潔和清爽組分 乙醇 0-15濕潤劑 甘油 0-5山梨醇 0-5防腐劑 對羥基苯甲酸酯 0.2-0.4收斂劑 蔬菜提取物 1-5抗刺激劑 泛酰醇 0-1尿囊素 0-0.2蔬菜提取物 0.5-3酶 蛋白酶/脂肪酶 0-5水分差額洗發(fā)香波成分 例子 ％表面活性劑 月桂基醚硫酸鹽 12-16椰油脂肪酸酰氨丙基二甲 2-5基甜菜堿脂肪酸聚二醇酯 0-2增泡劑 脂肪酸乙醇酰胺 0.5-2.5調(diào)理劑 季銨化羥乙基纖維素 0.4-1蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物 0.2-1加脂劑 乙氧基化的羊毛脂醇 0.2-1添加劑 去頭屑劑 0-1防腐劑 5-溴-5-硝基-1，3-二噁烷 0.1-0.3珠光劑 乙二醇硬脂酸酯 0-2染料＜0.1pH調(diào)節(jié)劑 酸/堿0.1-1香料0.3-0.5酶 蛋白酶/脂肪酶0-5水分差額護(hù)發(fā)素和頭發(fā)調(diào)理劑成分 例子 ％護(hù)發(fā)素％頭發(fā)調(diào)理劑表面活性劑 脂肪醇聚二醇醚 0.1-0.21.5-2.5十六烷基三甲基銨氯化物 0.5-1 -二甲基芐基硬脂基銨氯化物 - 0.5-1加脂劑 甘油的單/二鯨蠟酸/硬脂 0.5-1.51.5-2.5酸酯稠度調(diào)節(jié)劑 脂肪醇 1-2.5 2.5-3.5增稠劑 甲基羥丙基纖維素 0.3-0.60.4-0.8調(diào)理劑 季銨化羥乙基纖維素 0.1-0.3 0.3-0.4防腐劑 對羥基苯甲酸酯 0.1-0.3 0.1-0.3染料＜0.1＜0.1pH調(diào)節(jié)劑 酸/堿 0.1-10.1-1香料0.2-0.5 0.2-0.5酶 蛋白酶/脂肪酶 0-5 0-5水分差額 差額染發(fā)劑成分 例子％組分1 堿性染發(fā)膏表面活性劑 月桂基醚硫酸鹽 1-4乙氧基化的蓖麻油1-2稠度調(diào)節(jié)劑 脂肪醇 8-10還原劑 亞硫酸鈉0.8-1.2緩沖液 氯化銨 0.5-1螯合劑 1-羥基乙烷-1，1-二膦酸 0.1-0.2堿性劑 氨 1.2-2氧化染料 顯色劑(Developing agent)1偶聯(lián)劑 1酶 漆酶0-5水分 差額組分II 過氧化氫分散物表面活性劑 月桂基醚硫酸鹽 0.5-1氧化劑 過氧化氫6-9穩(wěn)定劑 1-羥基乙烷-1，1-二膦酸 1-1.5增稠劑 聚丙烯酸酯 3-5酶 漆酶0-5水分 差額剃須膏成分 例子 ％肥皂 棕櫚酸/硬脂酸30-40氫氧化鉀 5-7氫氧化鈉 1-2脂肪組分 椰子油 5-10聚乙二醇 0-2穩(wěn)定劑四硼酸鈉 0-0.5硅酸鈉 0-0.5山梨醇 0-3酶蛋白酶 0-5水分 差額剃須液成分 例子 ％消毒劑乙醇 40-80加脂劑己二酸二正丁基酯 1-2增溶劑乙氧基化的蓖麻油 0.5-1收斂劑蔬菜提取物 1-10抗刺激劑 泛酰醇 0-0.5蔬菜提取物 0-2穩(wěn)定劑甘油 0-5山梨醇 0-5丙二醇 0-3酶蛋白酶 0-5水 差額發(fā)油成分例子 ％稠度調(diào)節(jié)劑 脂肪醇4-5乙氧基化的羊毛脂醇3-6礦物脂 凡士林45-52支鏈?zhǔn)? 10-18抗氧化劑2，6-雙(1，1-二甲基乙基)- 0.5-14-甲基苯酚(BHT)香料 0.2-0.4染料 0.1酶 脂肪酶0-5潤膚劑 甘油 差額定型水成分例子 ％溶劑異丙醇12-20成膜組分乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯 2-3.5酯共聚物軟化劑 乙烯基吡咯烷酮/二甲基氨 0.2-1基乙基異丁烯酸酯調(diào)理劑 蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物0.2-0.5抗靜電劑十六烷基三甲基銨氯化物0.1-0.5乳化劑 乙氧基化的蓖麻油 0.1-0.5香料 0.1-0.2染料 ＜0.1酶 脂肪酶0-5水分 差額本發(fā)明的又一方面涉及本發(fā)明的被修飾多肽在降低上述工業(yè)組合物和產(chǎn)品變應(yīng)原性方面的用途。
本發(fā)明最后涉及降低多肽呼吸性變應(yīng)原性的方法，該方法包括偶聯(lián)這一步驟。
洗滌劑公開內(nèi)容本發(fā)明的洗滌組合物例如可以制成手洗和機(jī)洗組合物，包括洗滌添加劑組合物和適于臟織物預(yù)處理的組合物，漂洗添加的織物柔順劑組合物，適于普通家用硬表面清洗操作和碗碟洗滌操作的組合物。
本發(fā)明的洗滌劑組合物包含本發(fā)明的偶聯(lián)物和表面活性劑。此外還可任選地包含助洗劑，其它酶，泡沫抑制劑，柔順劑，染料轉(zhuǎn)移抑制劑，以及洗滌劑中習(xí)慣上使用的其它成分，如污垢懸浮劑、污垢除去劑、熒光增白劑、磨料、殺菌劑、晦暗抑制劑、著色劑和/或包覆或未包覆的香料。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是液體、膏狀、凝膠、條狀或粒狀形式。pH(在使用濃度的水溶液中測得的)通常是中性或者堿性，如pH7-11范圍內(nèi)。本發(fā)明的粒狀組合物也可以是“致密形式”的，即它們具有比常規(guī)的粒狀洗滌劑相對高的密度，即550-950g/l。
按組合物重量計(jì)，一般以0.00001-2％，優(yōu)選0.0001-1％，更優(yōu)選0.001-0.5％，最優(yōu)選0.01-0.2％酶蛋白的量將本發(fā)明的酶偶聯(lián)物或摻入洗滌劑組合物中的其它任選酶摻入到本發(fā)明的洗滌劑組合物中。
表面活性劑體系表面活性劑體系可包括非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑和/或兩性離子表面活性劑。表面活性劑體系優(yōu)選由陰離子表面活性劑或者陰離子表面活性劑和非離子表面活性劑的混合物組成，如陰離子表面活性劑占50-100％，非離子表面活性劑占0-50％。衣物洗滌組合物中還可含有陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑、兩性離子表面活性劑和半極性表面活性劑，以及本文并未述及的非離子表面活性劑和/或陰離子表面活性劑。表面活性劑一般以0.1-60％重量的量存在。下面介紹表面活性劑的一些例子。
非離子表面活性劑表面活性劑可包含烷基酚的聚環(huán)氧烷(如聚氧乙烯)縮合物。這些烷基可包含約6-14個(gè)碳原子，可以是直鏈或支鏈構(gòu)型。環(huán)氧乙烷存在的量可相當(dāng)于每摩爾烷基酚約2-25摩爾。
表面活性劑也可包含伯和仲脂族醇與約1-25摩爾環(huán)氧乙烷的縮合物。該脂族醇的烷基鏈可以是直鏈或支鏈，并且通常含有約8-22個(gè)碳原子。
此外，非離子表面活性劑可包括烷基酚的聚氧乙烯縮合物、伯和仲脂族醇與約1-25摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物、烷基多糖和其混合物。最優(yōu)選的是具有3-15個(gè)乙氧基的C8-C14烷基酚乙氧基化物和具有2-10個(gè)乙氧基的C8-C18(優(yōu)選平均為C10)醇乙氧基化物和其混合物。
陰離子表面活性劑合適的陰離子表面活性劑包括式RO(A)mSO3M的水溶性鹽或酸這樣的烷基烷氧基化硫酸或其鹽，其中R是未取代的C10-C24烷基或具有C10-C24烷基部分的羥基烷基，優(yōu)選C12-C20烷基或羥基烷基，更優(yōu)選C12-C18烷基或羥基烷基，A是乙氧基或丙氧基單元，m大于0，一般為約0.5-6，更優(yōu)選約0.5-3，M是H或陽離子，該陽離子可以是例如金屬陽離子(如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂離子等)、銨或取代銨陽離子。本文中預(yù)計(jì)使用烷基乙氧基化硫酸鹽以及烷基丙氧基化硫酸鹽。取代銨陽離子的具體例子包括甲基、二甲基、三甲基銨陽離子和季銨陽離子如四甲基銨和二甲基哌啶鎓陽離子和從烷基胺如乙胺、二乙胺、三乙胺、其混合物衍生的那些陽離子等。
其它合適的陰離子表面活性劑包括式ROSO3M的水溶性酸或鹽這樣的烷基硫酸或其鹽表面活性劑，其中R優(yōu)選為C10-C24烴基，優(yōu)選有C10-C20烷基部分的烷基或羥基烷基，更優(yōu)選是C12-C18烷基或羥基烷基，M是H或陽離子，如堿金屬陽離子(如鈉、鉀、鋰離子)或者銨或取代銨離子。
其它陰離子表面活性劑包括皂的鹽(包括，例如鈉、鉀、銨、和取代的銨如單、二和三乙醇胺鹽)、C8-C22伯或仲烷烴磺酸鹽、C8-C24烯烴磺酸鹽、通過堿土金屬檸檬酸鹽熱解產(chǎn)物的磺化制備的磺化多羧酸。烷基苯磺酸鹽比較合適，特別是線性(直鏈)烷基苯磺酸鹽(LAS)，其中該烷基優(yōu)選含有10-18個(gè)碳原子。
衣物洗滌組合物中通常含有約1-40％、優(yōu)選約3-20％的這類非離子表面活性劑。
助洗劑體系本發(fā)明的組合物還可包含助洗劑體系。任何常規(guī)助洗劑體系都適用于本文中，其包括硅鋁酸鹽材料、硅酸鹽、多羧酸鹽和脂肪酸、諸如乙二胺四乙酸鹽(EDTA)的材料、金屬離子螯合劑例如氨基多膦酸鹽。本文中也可以使用磷酸鹽助洗劑。
合適的助洗劑可以是無機(jī)離子交換材料，通常是無機(jī)水合的硅鋁酸鹽材料，更具體地是水合的合成沸石，例如水合的沸石A、X、B、HS或MAP。
洗滌助洗劑鹽的量通常為組合物重量的5-80％。用于液體洗滌劑的助洗劑的優(yōu)選量是5-30％。
其它洗滌酶活性除了含有具特異活性的本發(fā)明偶聯(lián)物之外，本發(fā)明洗滌組合物還可含有提供清洗性能和/或織物護(hù)理益處的其它酶活性(例如也是本發(fā)明上述酶偶聯(lián)物的形式)，例如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、纖維素酶、過氧化物酶、氧化酶(例如漆酶)。
所涉及的酶的具體例子列于上文“酶活性”部分。
漂白劑洗滌劑組合物(特別是粒狀洗滌劑的情況下)中也可含有漂白劑，如氧型漂白劑或鹵素型漂白劑。氧型漂白劑可以是過氧化氫釋放劑，例如過硼酸鹽(如PB1或PB4)或過碳酸鹽，或者可以是例如過羧酸，其粒徑可以是400-800微米。當(dāng)存在氧型漂白化合物時(shí)，其存在的量一般是約1-25％。
可以將過氧化氫釋放劑與漂白活化劑一起使用，該漂白活化劑是例如四乙?；叶?TAED)、壬?；u苯磺酸鹽(NOBS)、3，5-三甲基己?；u苯磺酸鹽(ISONOBS)或五乙?；咸烟?PAG)。
鹵素型漂白劑可以是例如次鹵酸鹽漂白劑，如三氯異氰脲酸，以及二氯異氰脲酸的鈉和鉀鹽，和N-氯代和N-溴代烷烴磺酰胺。這樣的材料通常以最終產(chǎn)品重量的0.5-10％、優(yōu)選1-5％的量加入。紡織品應(yīng)用蛋白酶蛋白酶用于對絲綢進(jìn)行脫膠和砂洗處理。脂肪酶在紡織品的整理過程中，脂肪酶被用來除去含疏水性酯(如甘油三酯)的脂類物質(zhì)(參見例如Novo Nordisk A/S的WO93/13256)。氧化還原酶在紡織品的漂白劑吸收中，過氧化氫酶可以用來除去多余的過氧化氫。糖酶(cabbohydrase)在粗斜紋棉布服裝的整理中，纖維素分解酶被廣泛使用，以使織物色度局部改變(酶促進(jìn)“石洗”)。
纖維素分解酶也可用于生物拋光加工中。生物拋光是對紗線表面所進(jìn)行的一項(xiàng)特殊處理，可改善織物手感和外觀方面的性質(zhì)，但不會(huì)使織物可濕性受到損失?？蓱?yīng)用WO93/20278所述的方法進(jìn)行生物拋光。
在紡織品的紡織過程中，絲線通常會(huì)受到不小的機(jī)械力。為避免斷裂，常常用凝膠類物質(zhì)(漿料)對它們上漿。最普遍使用的上漿劑是天然或修飾形式的淀粉。只有在除去了織物上的漿料(即所謂的脫漿)后，才完成了均勻持久的整理。用含有淀粉或被修飾淀粉的漿料上漿過的織物的脫漿過程優(yōu)選利用淀粉分解酶來促進(jìn)。食品和飼料應(yīng)用在食品和飼料生產(chǎn)中使用本發(fā)明的偶聯(lián)酶或多肽可能比較有利。蛋白酶面粉中的面筋是面粉能用于烘烤食品的必需成分。有時(shí)需要蛋白分解酶來改變生面團(tuán)的面筋形態(tài)，例如使用蛋白酶可以軟化硬面粉。
Neutrase是一種市售中性金屬蛋白酶，可用來確保獲得均勻面團(tuán)和面包結(jié)構(gòu)以及改善風(fēng)味。面筋或者被適度降解或者被進(jìn)一步降解為肽，因此有必要嚴(yán)格控制以避免面團(tuán)過度軟化。
還可利用蛋白酶來改變牛奶蛋白質(zhì)。
為了在生產(chǎn)乳酪時(shí)使牛奶中的酪蛋白凝集，可以使用諸如粗制凝乳酶或凝乳酶之類蛋白酶。
在釀造業(yè)中常采用蛋白酶來用未發(fā)芽谷物釀酒以及控制氮含量。
在動(dòng)物飼料產(chǎn)品中，據(jù)說可利用蛋白酶來擴(kuò)張動(dòng)物的消化系統(tǒng)。脂肪酶在烘烤業(yè)中使用脂肪酶比較新。添加脂肪酶能改善生面團(tuán)性質(zhì)，提高面包加工質(zhì)量(使體積更大)，改善面包屑結(jié)構(gòu)并使面包更白。觀察到的這些效果可用以下機(jī)制解釋即脂肪酶能改變生面團(tuán)混合過程中面筋與一些脂類片段之間的相互作用，從而改善面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。
Blue roan乳酪(如Danablue)、某些意大利乳酪和含有黃油的其它乳品的香味產(chǎn)生有賴于乳類脂肪降解為游離脂肪酸。可使用脂肪酶使這些產(chǎn)品具有香味。
在油類和脂肪類制備業(yè)中，脂肪酶被用來盡量減少不需要的副產(chǎn)品，通過酯交換使脂肪改性以及合成酯。氧化還原酶此外，在食品和飼料加工過程中使用本發(fā)明變應(yīng)原性有所降低的氧化還原酶可能也比較有利。
有幾種氧化還原酶可用于烘烤面包，例如葡萄糖氧化酶，脂類氧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶及其混合物。傳統(tǒng)上面包烘烤師是通過添加抗壞血酸和溴酸鉀來強(qiáng)化面筋的?？衫靡恍┭趸€原酶代替生面團(tuán)體系中的溴酸鹽，通過氧化谷蛋白中的游離巰基單元起作用，由此形成二硫鍵，得到更強(qiáng)力、更有彈性并具更大耐力的面團(tuán)。
Gluzyme(Novo Nordisk A/S)是具有過氧化氫酶活性的一種葡萄糖氧化酶制劑，可用來代替溴酸鹽，生面團(tuán)的強(qiáng)化測定為對機(jī)械震動(dòng)耐受力更強(qiáng)、面包烘烤膨脹更好和面包體積更大。糖酶面粉有不同含量的淀粉酶，使得烘烤性質(zhì)有所不同。為使面粉標(biāo)準(zhǔn)化，加入淀粉酶可能是必要的。淀粉酶和戊聚糖酶通?？蔀榻湍赴l(fā)酵提供糖類，改善面包體積，延緩老化，降低變陳速率和因戊聚糖膠所致的粘著性。下面給出糖酶的一些例子。
某些麥芽糖源淀粉酶可用來延長面包的保存期兩天或更多天，并不使面包變得更粘稠。通過從淀粉分子、低分子量糖類和糊精的非還原末端裂解，可以選擇性修飾凝膠化淀粉。對淀粉進(jìn)行修飾，使其更不可能發(fā)生老化，所產(chǎn)生的低分子量糖類可改善烘烤產(chǎn)品的水保持能力，而不會(huì)產(chǎn)生中間長度的糊精，使終產(chǎn)品更加粘稠。酶在面包烘烤過程中被滅活，因此可將其視為加工助劑，不需要在標(biāo)簽上明確標(biāo)出。幾乎可以排除Novamyl過量使用這種可能性。
用真菌α-淀粉酶可以改善面包體積，為面包屑更進(jìn)一步提供均勻良好的結(jié)構(gòu)。所述α-淀粉酶是能產(chǎn)生麥芽糖、糊精和葡萄糖的內(nèi)切酶。谷物和一些細(xì)菌α-淀粉酶只在高于淀粉凝膠化溫度的溫度下被滅活，因此將其添加到小麥面團(tuán)中時(shí)，會(huì)使面包體積小，面包內(nèi)部比較粘。Fungamyl具有不耐熱的優(yōu)點(diǎn)，在低于凝膠化的溫度下即被滅活。
有一些戊聚糖酶和半纖維素酶活性的酶制劑可以改善面團(tuán)的手感和穩(wěn)定性，并改善面包的新鮮度、體積和面包屑結(jié)構(gòu)。
對面粉中的戊聚糖水解后，會(huì)使其結(jié)合水的能力喪失大部分，因此淀粉和面筋可得到水。面筋變得易于揉和、延伸性好，淀粉則更易于凝膠化。可以結(jié)合乳化劑或作為其替代物使用戊聚糖酶。
此外，在從淀粉生產(chǎn)糖漿的方法中可使用糖酶，該酶被廣泛用于軟飲料、糖果、肉制品、乳制品、面包制品、冰激淋、嬰兒食品、果醬中。
淀粉的轉(zhuǎn)化通常經(jīng)由三個(gè)步驟完成。
首先是使用α-淀粉酶液化淀粉，得到主要由寡糖和糊精組成的麥芽糖糊精。
然后用淀粉葡萄糖苷酶處理該混合物，以便將寡糖和糊精水解為葡萄糖。這樣即獲得了甜味劑產(chǎn)品。如果需要得到高麥芽糖含量的糖漿，可以單獨(dú)或者與支鏈淀粉酶(脫支酶)結(jié)合使用β-淀粉酶。
通過將葡萄糖混合物異構(gòu)化為果糖，可以使其變得更甜。為此，可以使用固定化的葡萄糖異構(gòu)酶。
在制糖業(yè)中，常常會(huì)促進(jìn)苷蔗汁中淀粉的降解，由此降低粗制糖中的淀粉含量，便于精煉廠內(nèi)進(jìn)行過濾。
此外，還使用葡聚糖酶降解粗制糖汁和糖漿中的葡聚糖。
在醇工業(yè)中，使用α-淀粉酶使麥芽汁中的淀粉變稀薄一些比較有利。
在釀酒業(yè)中，α-淀粉酶被用來輔助液化。
在乳品業(yè)中，為了生產(chǎn)低乳糖牛奶供乳糖吸收障礙之人享用，常使用β-半乳糖苷酶(乳糖酶)。
由經(jīng)乳糖酶處理的牛奶中生產(chǎn)風(fēng)味乳飲料時(shí)，可降低糖的添加量而不影響產(chǎn)品的甜度。
生產(chǎn)濃縮牛奶時(shí)，經(jīng)乳糖酶處理可以避免乳糖結(jié)晶，因而使乳糖晶體內(nèi)酪蛋白凝集造成的粘稠問題得到緩解。
由經(jīng)乳糖酶處理的牛奶(或乳清)生產(chǎn)冰激淋時(shí)，不會(huì)形成乳糖晶體，因而可以避免沙質(zhì)感這一缺點(diǎn)。
此外，已知木聚糖酶可用于諸如WO 94/21785(Novo NordiskA/S)所述的多種食品/飼料工業(yè)應(yīng)用中。
可在動(dòng)物工業(yè)中使用α-淀粉酶，將其添加到含谷物的飼料中可以改善淀粉的消化力?？刮⑸锒嚯脑谌忸惣庸I(yè)中可以使用某些細(xì)菌分解酶以便例如清洗畜體(參見Novo Industri A/S的美國專利第5354681號)。轉(zhuǎn)移酶在食品和飼料加工中使用本發(fā)明變應(yīng)原性有所降低的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可能比較有利。
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶能夠交聯(lián)蛋白質(zhì)。
這一性質(zhì)可以用來使含有蛋白質(zhì)的水相凝膠化，當(dāng)生產(chǎn)膏類時(shí)可以利用該性質(zhì)(Novo Nordisk A/S的WO 96/08156)。
現(xiàn)正使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，通過修飾待用于制備蛋糕的小麥面粉而提高面粉的烘烤性質(zhì)，得到性質(zhì)有所改善的蛋糕，例如滋味、坍陷、口感有所改善并且體積更大(參見JP1-110147)。
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶還可用于生產(chǎn)膏型食品材料，在例如冰激淋、頂端配料、冷凍甜點(diǎn)、蛋黃醬和低脂膏等食品中用作脂肪替代品。
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶還可用于由牛奶和牛奶樣產(chǎn)品制備凝膠以用于酸乳酪、奶油煉、乳酪、布丁、桔汁中，用于結(jié)合碎肉產(chǎn)品，改善食物蛋白質(zhì)的味道和稠度(參見Novo Nordisk A/S的WO 94/21120和WO 94/21129)。肌醇六磷酸酶本發(fā)明的肌醇六磷酸酶用于加工食品(如早餐谷類食品、蛋糕、糖果、飲料、面包或湯等)和動(dòng)物飼料可能比較有利。
可以利用肌醇六磷酸酶來充分開發(fā)利用存在于植物蛋白來源中的肌醇六磷酸鹽/肌醇六磷酸上結(jié)合的磷，或者開發(fā)利用結(jié)合于肌醇六磷酸復(fù)合物上的重要營養(yǎng)礦物質(zhì)。
可以將微生物的肌醇六磷酸酶添加到單胃動(dòng)物的飼料中，以避免向飼料中添加無機(jī)磷(參見美國專利第3297548號)。
此外，肌醇六磷酸酶還可用于大豆加工中。大豆粉可能含有高水平的抗?fàn)I養(yǎng)因子肌醇六磷酸鹽，這使得該蛋白質(zhì)源不適合用于嬰兒食品和魚類、小牛及其它非反芻類動(dòng)物的飼料中，因?yàn)榧〈剂姿猁}會(huì)螯合其中的必需礦物質(zhì)(參見EP0 420 358)。
肌醇六磷酸酶還可用于烘烤目的。對含有小麥粉等及肌醇六磷酸酶的生面團(tuán)的小塊進(jìn)行烘烤可以制成性質(zhì)更優(yōu)良的面包(參見JP-0-3076529-A)。
已知具有高肌醇六磷酸酶活性的曲霉可以用來生產(chǎn)精煉清酒(參見JP-0-60707049-A)。材料和方法材料酶PD498WO 93/24623中所示的枯草桿菌蛋白酶類型的蛋白酶。PD498的序列在SEQ ID NO.1和2中顯示。
枯草桿菌蛋白酶DY分離自芽孢桿菌變種、示于SEQ ID NO3的枯草桿菌蛋白酶類型蛋白酶(Betzel等(1993)，生物物理學(xué)檔案，302卷，2，P.499-502)。
ELISA試劑辣根過氧化物酶標(biāo)記的豬抗兔Ig(Dako，DK，P217，稀釋度1∶1000)。
大鼠抗小鼠IgE(Serotec MCA419；稀釋度1∶100)。
小鼠抗大鼠IgE(Serotec MCA193；稀釋度1∶200)。
生物素標(biāo)記的小鼠抗大鼠IgG1單克隆抗體(Zymed03-9140；稀釋度1∶1000)生物素標(biāo)記的大鼠抗小鼠IgG1單克隆抗體(Serotec MCA336B；稀釋度1∶2000)鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(Kirkegard和Perry 14-30-00；稀釋度1∶1000).
緩沖液和溶液-PBS(pH7.2(1升))NaCl8.00gKCl 0.20gK2HPO41.04gKH2PO40.32g-洗滌緩沖液 PBS，0.05％(v/v)Tween20-封閉緩沖液 PBS，2％(wt/v)脫脂奶粉-稀釋緩沖液 PBS，0.05％(v/v)Tween20，0.5％(wt/v)脫脂奶粉-檸檬酸鹽緩沖液(0.1M，pH5.0-5.2(1升))檸檬酸鈉20.60g檸檬酸 6.30g-終止溶液(DMG緩沖液)-硼酸鈉，硼砂(Sigma)-3，3-二甲基戊二酸(Sigma)-CaCl2(Sigma)-Tween20聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯(Merck目錄號822184)
-N-羥基琥珀酰亞胺(Fluka art.56480)-碳酰氯(Fluka art.79380)-乳糖(Merck 7656)-PMSF(苯基甲基磺酰氟)Sigma-琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨?；鶎ο趸桨?Suc-AAPF-pNP)Sigma NO.S-7388，分子量624.6g/摩爾。
-mPEG(Fluka)著色底物OPD鄰苯二胺，(Kementec目錄號4260)試驗(yàn)動(dòng)物Brown Norway大鼠(得自Charles River，DE)設(shè)備XCEL II(Novex)ELISA讀數(shù)儀(UVmax，Molecular Devices)HPLC(Waters)PFLC(Pharmacia)Superdex-75柱，Mono-Q，Mono S(購自Pharmacia，SW.)SLT購自SLT LabInstruments的Fotometer。
大小排阻層析儀(Spherogel TSK-G2000 SW)。
大小排阻層析儀(Superdex 200，Pharmacia，SW)Amicon小槽方法Brown Norway大鼠的氣管內(nèi)(IT)刺激使用具有21/2英寸長度金屬探頭的一次性注射器進(jìn)行氣管內(nèi)施用分子。將這一探頭插入進(jìn)大鼠的氣管中大約在會(huì)厭下1cm，放置0.1ml的分子溶液。
試驗(yàn)動(dòng)物是每組10只的Brown Norway大鼠(BN)。在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)重量大于200克，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)重量大約450克。
確定Brown Norway大鼠中IgE抗體相對濃度的ELISA方法使用三層夾心ELISA(three layer sandwish ELISA)確定特異性IgE血清抗體的相對濃度。
1)用10mg小鼠抗大鼠IgE緩沖液1包被ELISA板。50μl/孔。在4℃下溫育過夜。
2)倒空板并以封閉緩沖液在室溫下封閉至少1/2小時(shí)。200μl/孔。輕微搖動(dòng)。用洗滌緩沖液洗滌板3次。
3)與大鼠血清一起溫育，從未稀釋的血清開始，并以2倍稀釋度連續(xù)稀釋。留一些孔僅用緩沖液4處理(空白)。50μl/孔。在室溫下溫育30分鐘。輕微搖動(dòng)。在洗滌緩沖液中洗滌板3次。
4)在稀釋緩沖液中將酶稀釋成適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)濃度。50μl/孔。在室溫下溫育30分鐘。輕微搖動(dòng)。在洗滌緩沖液中洗滌板3次。
5)用稀釋緩沖液稀釋特異性多克隆抗酶抗血清血清(pIg)以用于檢測結(jié)合抗體。50μl/孔。在室溫下溫育30分鐘。輕微搖動(dòng)。在洗滌緩沖液中洗滌板3次。
6)用稀釋緩沖液稀釋辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗pIg抗體。50μl/孔。在室溫下溫育30分鐘。輕微搖動(dòng)。用洗滌緩沖液洗滌板3次。
7)于底物緩沖液中混合0.6mg ODP/ml+0.4μl H2O2/ml。制備好該溶液后立即使用。溫育10分鐘。50μl/孔。
8)終止反應(yīng)加入終止溶液，50μl/孔。
9)在492nm對平板讀數(shù)，以620nm的讀數(shù)作為參照。數(shù)據(jù)用Lotus軟件計(jì)算并顯示。
測定分子量使用4-20％梯度的SDS聚丙烯酰胺凝膠(Novex)，通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行蛋白質(zhì)的電泳分離。蛋白質(zhì)通過銀染檢測。相對于Novex的Mark-12寬范圍分子量標(biāo)準(zhǔn)的遷移率測量分子量。
蛋白酶活性用Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa分析蛋白酶切割肽和對硝基苯胺之間的鍵，產(chǎn)生在405nm吸收的可見黃色。
緩沖液例如Britton和Robinson緩沖液pH8.3底物將100mg suc-AAPF-pNa溶解在1ml二甲基亞砜(DMSO)中。將100μl的這種溶液用Britton和Robinson緩沖液稀釋成10ml。
分析混合底物和蛋白酶溶液，在405nm下監(jiān)測作為時(shí)間和ABS405nm/min的函數(shù)的吸光度。應(yīng)該控制溫度(在20-50℃之間，取決于蛋白酶)。這測量的是樣品中的蛋白酶活性。
實(shí)施例實(shí)施例1用N-琥珀酰亞胺碳酸酯活化mPEG 350將mPEG 350溶解在甲苯中(4ml/g mPEG)，在正常壓力下蒸餾除去約20％以共沸干燥反應(yīng)物。當(dāng)溶液冷卻到20℃時(shí)，加入甲苯中的碳酰氯(1.93M 1.5摩爾/摩爾mPEG)，混合物在室溫下攪動(dòng)過夜?；旌衔餃p壓蒸發(fā)，所得的中間產(chǎn)物氯甲酸酯為油狀。
在蒸發(fā)之后，添加二氯甲烷和甲苯(1∶2，4ml/g干燥mPEG)以重新溶解該無色油。以固體形式加入N-羥基琥珀酰亞胺(1.5摩爾/摩爾mPEG)，然后加入0℃的三乙胺(1.1摩爾/摩爾mPEG)，可觀察到三乙胺鹽酸鹽(Et3N·HCl)立即沉淀下來。將混合物室溫下攪動(dòng)過夜。用多孔玻璃濾器(G5)過濾混合物以除去Et3N.HCl。將濾過液減壓蒸發(fā)至干燥，得到98％(mol/mol)的油。核磁共振表明有85-95％被活化和小于10o/o(mol/mol)HNEt3Cl。mPEG 350琥珀酰亞胺碳酸酯(CDCl3)的1H-NMR為d 1.42 t(I＝1.4 CH3，于HNEt3Cl)，2.68s(I＝3.4未反應(yīng)的NHS)，2.84s(I＝6.2琥珀酰亞胺)，3.10dq(I＝1.0 CH2i HNEt3Cl)，3.38s(I＝5.8 CH3i OMe)，3.64bs(I＝50主峰)，4.47t(I＝3.0，PEG中的CH2)。
實(shí)施例2PD498蛋白酶與活化的mPEG 350的偶聯(lián)在6ml的終體積內(nèi)，于50mM硼酸鈉(pH9.7)中，將62mg PD498與20mg(約200μl)用N-琥珀酰亞胺碳酸酯活化的mPEG350(按照實(shí)施例1制備)一起溫育。通過磁性攪拌，在室溫下進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)間是2小時(shí)。通過添加0.5M琥珀酸至終pH為6.0來終止反應(yīng)。所得衍生物的分子量大約是33kDa，相當(dāng)于每摩爾PD498偶聯(lián)了大約11摩爾mPEG。
與親本酶比較，修飾多肽對肽底物(琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe?；鶎ο趸桨?的剩余活性接近100％。
實(shí)施例3枯草桿菌蛋白酶DY蛋白酶和活化的mPEG 350使用與實(shí)施例2中所述相同的方法，將枯草桿菌蛋白酶DY蛋白酶與經(jīng)N-琥珀酰亞胺碳酸酯活化的mPEG350進(jìn)行偶聯(lián)。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，參照前述公開內(nèi)容，在本發(fā)明的實(shí)施中可以作很多修改和變化而不偏離其精神和范圍，因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)理解為是下述權(quán)利要求所定義的內(nèi)容。
實(shí)施例4小mPEG聚合物的PD498偶聯(lián)物的Brown Norway大鼠氣管內(nèi)(IT)實(shí)驗(yàn)將已知蛋白質(zhì)濃度(由衍生物的光密度和氨基酸序列分析測定)的PD498樣品稀釋至0.75μg蛋白質(zhì)/ml。
將稀釋樣品等分成1.5ml組分以用于各個(gè)免疫接種。將這些組分儲(chǔ)存于-20的穩(wěn)定條件下備用。在研究開始和結(jié)束時(shí)進(jìn)行分析。每次免疫和分析均取用一個(gè)新組分。
如上述實(shí)施例所述將酶偶聯(lián)物偶聯(lián)上N-琥珀酰亞胺活化的mPEG350、550、750。用相應(yīng)的親本酶作對照。
檢測以下樣品組1PD498(未偶聯(lián)的親本酶-對照)組2PD498-SPEG 750組3PD498-SPEG 550組4PD498-SPEG 350用0.9％(wt/vol)NaCl溶液100μl(對照組)或者上述PD498蛋白質(zhì)稀釋液100μl免疫大鼠，每周一次，共15次。
每組有10只Brown Norway大鼠。每隔一次免疫之后一周、但在下次免疫之前從眼部取血樣(2ml)，通過凝血和離心得到血清。
用上述特異于大鼠IgE的ELISA試驗(yàn)檢測特異IgE水平，從血清未稀釋液開始測定各1/2稀釋度的滴度，測定492/620nm的光密度。
IT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于下述表中，顯示研究結(jié)束時(shí)在用相應(yīng)PD498衍生物處理的Brown Norway大鼠中觀察到的每100μl血清的總光密度值。
從表1可以看出，與氣管內(nèi)暴露于未修飾親本酶的大鼠相比，氣管內(nèi)暴露于偶聯(lián)了小聚合物的PD498偶聯(lián)物的大鼠其特異性IgE應(yīng)答水平降低，因此變應(yīng)原性有所降低。
實(shí)施例5枯草桿菌蛋白酶DY偶聯(lián)物的Brown Norway大鼠氣管內(nèi)(IT)實(shí)驗(yàn)重復(fù)實(shí)施例4所述的Brown Norway大鼠IT研究，對枯草桿菌蛋白酶DY-SPEG750偶聯(lián)物和相應(yīng)的親本枯草桿菌蛋白酶DY(見SEQID NO3)作一比較
鯨蠟醇 5gTween80 7g水相一丙二醇(MPG) 10g0.4％檸檬酸緩沖液*pH5.842.9g對羥基苯甲酸甲酯0.1gPD498-SPEG550**10mg(以酶蛋白計(jì))分開混合油相和水相，并加熱至80℃。一邊攪拌一邊將油相緩慢倒入水相中，將混合物冷卻到約35℃，加入PD498-SPEG550偶聯(lián)物，使護(hù)膚蜜快速冷卻。*0.4％檸檬酸一水合物，pH調(diào)至5.9**通常以添加有MPG的制劑提供。應(yīng)根據(jù)酶制劑中MPG的量調(diào)節(jié)水相中的MPG。護(hù)膚膠(制成100g)MPG 20g*H2O 約100g檸檬酸0.4g**Carbapol 940 1gPD498-SPEG350 10mg(以酶蛋白計(jì))按以上順序混合各成分，在加入carbapol之前調(diào)節(jié)pH至5.6。加入carbapol之后再調(diào)節(jié)pH。*根據(jù)酶制劑中的量進(jìn)行調(diào)節(jié)。**pH5.6
序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsveard(E)國家丹麥(F)郵區(qū)代碼(ZIP)DK-2880(G)電話45 4444 8888(H)傳真45 4449 3256(ii)發(fā)明名稱一種被修飾多肽(iii)序列數(shù)5(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，版本#1.30(EPO)(2)關(guān)于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度840個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(vi)原始來源(B)菌株芽孢桿菌PD498，NCIMB No.40484(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..840(xi)序列描述SEQ ID NO1TGG TCA CCG AAT GAC CCT TAC TAT TCT GCT TAC CAG TAT GGA CCA CAA 48Trp Ser Pro Asn Asp Pro Tyr Tyr Ser Ala Tyr Gln Tyr Gly Pro Gln1 5 10 15AAC ACC TCA ACC CCT GCT GCC TGG GAT GTA ACC CGT GGA AGC AGC ACT 96Asn Thr Ser Thr Pro Ala Ala Trp Asp Val Thr Arg Gly Ser Ser Thr20 25 30CAA ACG GTG GCG GTC CTT GAT TCC GGA GTG GAT TAT AAC CAC CCT GAT 144Gln Thr Val Ala Val Leu Asp Ser Gly Val Asp Tyr Asn His Pro Asp35 40 45CTT GCA AGA AAA GTA ATA AAA GGG TAC GAC TTT ATC GAC AGG GAC AAT 192Leu Ala Arg Lys Val Ile Lys Gly Tyr Asp Phe Ile Asp Arg Asp Asn50 55 60AAC CCA ATG GAT CTT AAC GGA CAT GGT ACC CAT GTT GCC GGT ACT GTT 240Asn Pro Met Asp Leu Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val65 70 75 80GCT GCT GAT ACG AAC AAT GGA ATT GGC GTA GCC GGT ATG GCA CCA GAT 288Ala Ala Asp Thr Asn Asn Gly Ile Gly Val Ala Gly Met Ala Pro Asp85 90 95ACG AAG ATC CTT GCC GTA CGG GTC CTT GAT GCC AAT GGA AGT GGC TCA 336Thr Lys Ile Leu Ala Val Arg Val Leu Asp Ala Asn Gly Ser Gly Ser100 105 110CTT GAC AGC ATT GCC TCA GGT ATC CGC TAT GCT GCT GAT CAA GGG GCA 384Leu Asp Ser Ile Ala Ser Gly Ile Arg Tyr Ala Ala Asp Gln Gly Ala115 120 125AAG GTA CTC AAC CTC TCC CTT GGT TGC GAA TGC AAC TCC ACA ACT CTT 432Lys Val Leu Asn Leu Ser Leu Gly Cys Glu Cys Asn Ser Thr Thr Leu130 135 140AAG AGT GCC GTC GAC TAT GCA TGG AAC AAA GGA GCT GTA GTC GTT GCT 480Lys Ser Ala Val Asp Tyr Ala Trp Asn Lys Gly Ala Val Val Val Ala145 150 155 160GCT GCA GGG AAT GAC AAT GTA TCC CGT ACA TTC CAA CCA GCT TCT TAC 528Ala Ala Gly Asn Asp Asn Val Ser Arg Thr Phe Gln Pro Ala Ser Tyr165 170 175CCT AAT GCC ATT GCA GTA GGT GCC ATT GAC TCC AAT GAT CGA AAA GCA 576Pro Asn Ala Ile Ala Val Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asp Arg Lys Ala180 185 190TCA TTC TCC AAT TAC GGA ACG TGG GTG GAT GTC ACT GCT CCA GGT GTG 624Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Thr Trp Val Asp Val Thr Ala Pro Gly Val195 200 205AAC ATA GCA TCA ACC GTT CCG AAT AAT GGC TAC TCC TAC ATG TCT GGT 672Asn Ile Ala Ser Thr Val Pro Asn Asn Gly Tyr Ser Tyr Met Ser Gly210 215 220ACG TCC ATG GCA TCC CCT CAC GTG GCC GGT TTG GCT GCT TTG TTG GCA 720Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Leu Leu Ala225 230 235 240AGT CAA GGT AAG AAT AAC GTA CAA ATC CGC CAG GCC ATT GAG CAA ACC 768Ser Gln Gly Lys Asn Asn Val Gln Ile Arg Gln Ala Ile Glu Gln Thr245 250 255GCC GAT AAG ATC TCT GGC ACT GGA ACA AAC TTC AAG TAT GGT AAA ATC 816Ala Asp Lys Ile Ser Gly Thr Gly Thr Asn Phe Lys Tyr Gly Lys Ile260 265 270AAC TCA AAC AAA GCT GTA AGA TACAsn Ser Asn Lys Ala Val Arg Tyr 840275 280(2)關(guān)于SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度280個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Trp Ser Pro Asn Asp Pro Tyr Tyr Ser Ala Tyr Gln Tyr Gly Pro Gln1 5 10 15Asn Thr Ser Thr Pro Ala Ala Trp Asp Val Thr Arg Gly Ser Ser Thr20 25 30Gln Thr Val Ala Val Leu Asp Ser Gly Val Asp Tyr Asn His Pro Asp35 40 45Leu Ala Arg Lys Val Ile Lys Gly Tyr Asp Phe Ile Asp Arg Asp Asn50 55 60Asn Pro Met Asp Leu Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val65 70 75 80Ala Ala Asp Thr Asn Asn Gly Ile Gly Val Ala Gly Met Ala Pro Asp85 90 95Thr Lys Ile Leu Ala Val Arg Val Leu Asp Ala Asn Gly Ser Gly Ser100 105 110Leu Asp Ser Ile Ala Ser Gly Ile Arg Tyr Ala Ala Asp Gln Gly Ala115 120 125Lys Val Leu Asn Leu Ser Leu Gly Cys Glu Cys Asn Ser Thr Thr Leu130 135 140Lys Ser Ala Val Asp Tyr Ala Trp Asn Lys Gly Ala Val Val Val Ala145 150 155 160Ala Ala Gly Asn Asp Asn Val Ser Arg Thr Phe Gln Pro Ala Ser Tyr165 170 175Pro Asn Ala Ile Ala Val Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asp Arg Lys Ala180 185 190Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Thr Trp Val Asp Val Thr Ala Pro Gly Val195 200 205Asn Ile Ala Ser Thr Val Pro Asn Asn Gly Tyr Ser Tyr Met Ser Gly210 215 220Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Leu Leu Ala225 230 235 240Ser Gln Gly Lys Asn Asn Val Gln Ile Arg Gln Ala Ile Glu Gln Thr245 250 255Ala Asp Lys Ile Ser Gly Thr Gly Thr Asn Phe Lys Tyr Gly Lys Ile260 265 270Asn Ser Asn Lys Ala Val Arg Tyr275 280(2)關(guān)于SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度274個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來源(B)菌株芽孢桿菌變種(xi)序列描述SEQ ID NO3Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val1 5 10 15Gln Ala Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Gly Ile Ile Asp20 25 30Thr Gly Ile Ala (Ala/Ser) Ser His Thr Asp Leu Lys Val Val Gly Gly Ala3540 45Ser Phe Val Ser Gly Glu Ser Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly50 55 60Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val65 70 75 80Leu Gly Val Ala Pro Asn Val Ser Leu Tyr Ala Ile Lys Val Leu Asn85 90 95Ser Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Ser Ala Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp100 105 110Ala Thr Gln Asn Gly Leu Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro115 120 125Ser Gly Ser Thr Ala Leu Lys Gln Ala Val Asp Lys Ala Tyr Ala Ser130 135 140Gly Ile Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Ser145 150 155 160Gln Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val165 170 175Gly Ala Val Asp Ser Asn Lys Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly180 185 190(Ala/Ser) Glu Leu Glu Val Met Ala Pro Gly Val Ser Val Tyr Ser Thr Tyr195 200 205Pro Ser Asn Thr Tyr Thr Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro210 215 220His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys Tyr Pro Thr Leu225 230 235 240Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Asn Leu245 250 255Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala260 265 270Ala Gln(2)關(guān)于SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度433個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來源(B)菌株芽孢桿菌Y種(xi)序列描述SEQ ID NO4Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Asn Asn1 5 10 15Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Leu Val Ala Val Ala Asp Thr Gly20 25 30Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly35 40 45Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Ser Asp50 55 60Pro Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Ala65 70 75 80Leu Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile85 90 95Met Asp Ser Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Asn Thr100 105 110Leu Phe Ser Gln Ala Trp Asn Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser115 120 125Trp Gly Ala Pro Val Asn Gly Ala Tyr Thr Ala Asn Ser Arg Gln Val130 135 140Asp Glu Tyr Val Arg Asn Asn Asp Met Thr Val Leu Phe Ala Ala Gly145 150 155 160Asn Glu Gly Pro Asn Ser Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys165 170 175Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Tyr Arg Pro Ser Phe Gly180 185 190Ser Ile Ala Asp Asn Pro Asn His Ile Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly195 200 205Ala Thr Arg Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Thr Ala Pro Gly Thr210 215 220Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp225 230 235 240Ala Asn Tyr Asn Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala245 250 255Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Ile260 265 270Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Ile Lys Ala Ala Leu275 280 285Ile Ala Gly Ala Thr Asp Val Gly Leu Gly Tyr Pro Ser Gly Asp Gln290 295 300Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val305 310 315 320Asn Glu Ala Thr Ala Leu Ala Thr Gly Gln Lys Ala Thr Tyr Ser Phe325 330 335Gln Ala Gln Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Thr Asp340 345 350Ala Pro Gly Ser Thr Thr Ala Ser Tyr Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp355 360 365Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Gln Lys Tyr Val Gly Asn Asp Phe370 375 380Ser Tyr Pro Tyr Asp Asn Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn385 390 395 400Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Ile Ile Glu Val Gln405 410 415Ala Tyr Asn Val Pro Ser Gly Pro Gln Arg Phe Ser Leu Ala Ile Val420 425 430His(2)關(guān)于SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度316個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來源(B)菌株Bacillus Thermoproteolyticus(xi)序列描述SEQ ID NO5Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly Asp1 5 10 15Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu Gln Asp20 25 30Asn Thr Arg Gly Asp Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys Tyr Arg Thr35 40 45Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn Gln Phe Phe Ala50 55 60Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Ala His Tyr Tyr Ala Gly Val Thr65 70 75 80Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg Leu Ser Tyr Asp Gly Asn85 90 95Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val His Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn100 105 110Ala Phe Trp Asn Gly Ser Glu Met Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln115 120 125Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly Gly Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu130 135 140Thr His Ala Val Thr Asp Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu145 150 155 160Ser Gly Ala Ile Asn Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val165 170 175Glu Phe Tyr Ala Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val180 185 190Tyr Thr Pro Gly Ile Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro195 200 205Ala Lys Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr210 215 220Gln Asp Asn Gly Gly Val His Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala225 230 235 240Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val Val245 250 255Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala Leu Thr260 265 270Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg Ala Ala Ala275 280 285Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser Gln Glu Val Ala290 295 300Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val Lys305 310 31權(quán)利要求
1.一種被修飾多肽，其特征在于，其上有分子量為100-750Da的聚合分子共價(jià)偶聯(lián)到分子量為5-100kDa的親本多肽上。
2.按照權(quán)利要求1的被修飾多肽，其特征在于該親本多肽，尤其是酶的分子量為15-60kDa。
3.按照權(quán)利要求1或2中任何一項(xiàng)的被修飾多肽，其中有1-100個(gè)聚合分子、優(yōu)選地4-50個(gè)聚合分子、尤其是5-35個(gè)聚合分子共價(jià)偶聯(lián)到親本酶上。
4.按照權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的被修飾多肽，其中所述聚合分子選自包含天然或合成均聚物和雜聚物的組。
5.按照權(quán)利要求4的被修飾多肽，其中所述聚合物分子選自包含合成聚合分子的組，所述合成聚合分子包括分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸、聚(乙烯吡咯烷酮)以及聚D，L-氨基酸。
6.按照權(quán)利要求4的被修飾多肽，其中所述聚合分子選自包含天然存在的聚合分子的組，所述天然存在的聚合分子包括葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖；纖維素，如甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素；以及聚氨基葡糖的水解產(chǎn)物；淀粉，如羥乙基淀粉、羥丙基淀粉；糖原，瓊脂糖，瓜爾膠，菊粉，支鏈淀粉，黃原酸膠，角叉菜膠，果膠以及藻酸。
7.按照權(quán)利要求1-10中任何一項(xiàng)的被修飾多肽，其中所述多肽是微生物來源的，如細(xì)菌、絲狀真菌或酵母來源的。
8.按照權(quán)利要求1-7中任何一項(xiàng)的被修飾多肽，其中所述多肽是一種水解酶，包括蛋白酶，含絲氨酸蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶和金屬蛋白酶，或者脂肪酶，或者氧化還原酶，如漆酶，或者超氧化物歧化酶。
9.按照權(quán)利要求8的被修飾多肽，其中所述親本蛋白酶選自包括PD498、Savinase、蛋白酶K、蛋白酶R、Thermitase、枯草桿菌蛋白酶DY、Lion Y、Alcalase、蛋白酶T和JA16的組。
10.按照權(quán)利要求9的被修飾多肽，其中所述酶是SEQ ID NO.1所示的PD498，或SEQ ID NO.3所示的枯草桿菌蛋白酶類型的枯草桿菌蛋白酶DY，或SEQ ID NO.4所示的Lion Y。
11.按照權(quán)利要求8的被修飾多肽，其中所述金屬蛋白酶是SEQID NO.5所示的嗜熱菌蛋白酶。
12.一種工業(yè)組合物，其中含有偶聯(lián)了分子量為100-5000Da、優(yōu)選100-2000Da、尤其是100-1000Da的聚合分子的被修飾多肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的工業(yè)組合物，其中聚合分子的分子量為100-750Da，例如100-500Da，比如300Da左右。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的工業(yè)組合物，其中包含已知用于個(gè)人護(hù)理組合物、尤其是皮膚護(hù)理組合物的諸多成分。
15.包含按照權(quán)利要求14的組合物的一種皮膚護(hù)理產(chǎn)品，所述護(hù)理產(chǎn)品選自下組肥皂、化妝品、護(hù)膚膏、護(hù)膚凝膠、護(hù)膚奶、潔膚洗液、清潔霜、清潔露、潔膚奶、冷霜、皂膏、化妝基料、清潔乳、面膜、含鋅化妝水、T區(qū)精華素、潤手香脂、香粉、增白粉、皂粉、塊皂、透明皂、唇膏、口紅、營養(yǎng)素、粉底霜、化妝底粉、眼影粉、粉底、指甲油清潔劑、生發(fā)油、美發(fā)液、發(fā)乳、發(fā)用凝膠、滋發(fā)劑、頭發(fā)定形制品、染發(fā)劑、頭發(fā)著色劑、頭皮滋潤劑、香波、香膏、護(hù)發(fā)素、發(fā)膠、曬黑油、防曬品、剃須泡沫與凝膠、剃須膏、嬰兒油、防治粉刺制品、止汗劑、驅(qū)蟲劑、祛臭劑等。
16.根據(jù)權(quán)利要求12或13的工業(yè)組合物，它是洗滌劑，例如衣物洗滌組合物、碗碟洗滌組合物或者硬表面清潔組合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求12或13的工業(yè)組合物，它是諸如食品或飼料添加劑、特別是用于制面包等的添加劑之類的組合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求12或13的工業(yè)組合物，它是用于處理紡織品的組合物。
19.多肽上偶聯(lián)了分子量為100-5000Da、優(yōu)選100-2000Da、尤其是100-1000Da、如100-750Da或100-500Da或300Da左右的聚合分子的被修飾多肽用于降低權(quán)利要求12-14、16-18中任一項(xiàng)的工業(yè)組合物和權(quán)利要求15的產(chǎn)品之呼吸性變應(yīng)原性的用途。
20.降低多肽變應(yīng)原性的方法，包括將多肽偶聯(lián)上分子量為100-5000Da、優(yōu)選100-2000Da、尤其是100-1000Da、如100-750Da或100-500Da或300Da左右的聚合分子。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述多肽是權(quán)利要求8-11的具有活性的酶或者其混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及在分子量為5—100kDa的親本多肽上共價(jià)偶聯(lián)了分子量為100—750Da的聚合分子、呼吸性變應(yīng)原性有所降低的被修飾多肽,含有呼吸性變應(yīng)原性有所降低的被修飾多肽的工業(yè)組合物,皮膚護(hù)理產(chǎn)品,被修飾多肽用于降低工業(yè)組合物和產(chǎn)品的變應(yīng)原性的用途,還涉及降低多肽變應(yīng)原性的方法。
文檔編號A23K1/16GK1265142SQ9880749
公開日2000年8月30日 申請日期1998年6月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月25日
發(fā)明者A·A·奧爾森, T·M·法特姆, H－J·德尤森, E·L·羅根 申請人:諾沃挪第克公司