專利名稱：微生物農(nóng)藥的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及以耐托酚酮(環(huán)庚三烯酚酮)和不產(chǎn)生托酚酮為指標從植物體、土壤、種子或種子的浸出液等篩選抗禾本科植物育苗中發(fā)生的細菌性病原體的抗性菌的方法。本發(fā)明還涉及以耐托酚酮和不產(chǎn)生托酚酮為特征的、對禾本科植物育苗中發(fā)生的細菌性病原體有抗性作用的細菌及其芽胞作為有效成分的微生物農(nóng)藥。
現(xiàn)有技術禾本科植物育苗中發(fā)生的病害代表性的有真菌引起的水稻惡菌病、稻胡麻斑病和稻瘟病，細菌引起的稻穎枯病、立枯細菌病、褐條斑病等。在這些病害的防治上，據(jù)稱種子消毒劑、土壤混合劑、土壤灌注劑、綠化后莖葉散布劑等是有效的，可將這些藥劑單獨或復配使用。由真菌引起的病害近年用高效蘇云金桿菌(EBI)劑可高效地加以防治。而細菌引起的病害雖可用化學農(nóng)藥防治，但在細菌爆發(fā)的情況下化學農(nóng)藥通常效果差，而有難以充分防治的問題。在細菌病害爆發(fā)的情況下，目前只能放棄病苗。人們期望能開發(fā)預防或防治細菌病害爆發(fā)的農(nóng)藥。
本發(fā)明者等鑒于上述現(xiàn)狀，研究的課題為對禾本科植物的細菌病害防治效果優(yōu)于化學農(nóng)藥的生物防治劑的探索，注重稻苗立枯細菌病的病原毒素、通過從禾本植物篩選耐托酚酮的菌同時又是托酚酮非生產(chǎn)菌，來確立抗性微生物的篩選方法，對可用于防治細菌病害的微生物材料銳意研究的結果，從稻秧成功地分離出對病原菌具有抗性作用的細菌，從而完成了本發(fā)明。
發(fā)明的揭示本發(fā)明涉及以耐托酚酮和不產(chǎn)生托酚酮為指標從植物體、土壤、種子或種子的浸出液等篩選抗禾本科植物育苗中發(fā)生的細菌性病原體的抗性菌的方法。本發(fā)明還涉及以耐托酚酮和不產(chǎn)生托酚酮為特征的、對禾本科植物育苗中發(fā)生的細菌性病原體有抗性作用的細菌及其芽胞作為有效成分的微生物農(nóng)藥。具體地說，涉及以選自屬于假單胞菌屬、芽胞桿菌屬、腸桿菌屬的細菌作為對禾本科植物特別是其育苗中發(fā)生的細菌性病害有抗性作用的抗性菌的微生物農(nóng)藥。還涉及混合使用其中2種以上的微生物農(nóng)藥。具體地說，涉及具有如下特征的防治禾本科植物的細菌性病害的微生物農(nóng)藥即將對禾本科植物特別是其育苗中發(fā)生的細菌性病害有抗性作用的選自屬于假單胞菌屬、芽胞桿菌屬、腸桿菌屬的細菌或其中2種以上的混合物對種子進行處理，或使育苗土壤中含有該菌，或將該菌體添加在浸種液中，或將該菌液散布在大田的禾本科植物體上。
發(fā)明的最佳實施方式本發(fā)明的篩選方法系將水稻等植物的碎片、磨碎提取液、土壤、種子、種子的浸種液等涂抹或置于已添加托酚酮的適當?shù)墓腆w培養(yǎng)基上，將所得的耐托酚酮菌的菌落接種于添加鐵離子的適當?shù)呐囵B(yǎng)基上，選擇在此含鐵培養(yǎng)基上不呈紅色的菌株，在適當?shù)呐囵B(yǎng)基上培養(yǎng)增殖，收集細菌細胞，將菌體制成制劑或直接以活菌懸浮液處理患病的稻谷，檢測防治效果，選擇有效菌株。本發(fā)明的篩選中，也可用托酚酮衍生物代替托酚酮。
可用本發(fā)明的篩選方法篩選、對禾本科植物育苗中發(fā)生的細菌病原體有抗性作用的細菌或其芽胞作為有效成分，用作微生物農(nóng)藥。本發(fā)明中所用的生物防治材料可用上述篩選方法得到，為選自屬于假單胞菌屬、芽胞桿菌屬、腸桿菌屬的細菌，或也可混合使用其中2種以上細菌。屬于假單胞菌屬細菌可有例如致金色假單胞菌種的細菌，更具體地有致金色假單胞菌B5。芽胞桿菌屬細菌有例如多粘芽胞桿菌種的細菌，更具體地有多粘芽胞桿菌B36。屬于腸桿菌屬的細菌有例如腸桿菌屬cloacae種細菌，更具體地有腸桿菌屬cloacaeB51。致金色假單胞菌B5、多粘芽胞桿菌B36和腸桿菌屬cloacae B51的細菌學諸性質如下
表1 致金色假單胞菌B5的性質試驗項目 試驗結果形態(tài)桿菌革蘭氏染色性 -孢子 -運動性 +鞭毛 極多毛對氧的需求 需氧性氧化酶 +過氧化氫酶 +O/F O菌株的顏色 不生成特殊的顏色熒光色素的生成 +水溶性色素的生成 +(橙色系)PHP累積 -41℃繁殖 -果聚糖的生成 -精氨酸二水解酶 +脫氮反應 -硝酸鹽的還原 -明膠的液化 +淀粉的水解 -吐溫80的分解 +碳源同化作用葡萄糖 +海藻糖 +2-酮葡糖酸 +肌醇 +牻牛兒醇(Geraniol) -L-纈氨酸 +β-丙氨酸+DL-精氨酸+核糖醇 -山梨糖醇 -苯醌系 Q-9菌體內(nèi)DNA的GC含量(mol％) 63
表2多粘芽胞桿菌B36的性質

表3腸桿菌屬cloacae B51的性質

<p>這三種細菌是本發(fā)明者等從稻秧分離到的，參考Bergy的《系統(tǒng)細菌學手冊》第一卷、第二卷和Bergy的從以上性質《系統(tǒng)細菌學手冊》(第9版)，從以上性質將它們鑒定為致金色假單胞菌、多粘芽胞桿菌和腸桿菌屬cloacae。各細菌分別命名為致金色假單胞菌B5、多粘芽胞桿菌B36和腸桿菌屬cloacae B51。這些細菌分別以BP-6067、FERM BP-6068和FERM BP-6069保藏號保藏于國立生命科學和人體技術研究所。
這些細菌是耐托酚酮的、并且是非托酚酮產(chǎn)生菌，對于主要引起禾本科植物細菌性病害的病原菌具有抗性作用。其有效防治的病害有例如禾本科植物籽枯細菌病(Pseudomonas plantarii)、水稻枯細菌病(Pseudomonasglumae)、水稻褐條病(燕麥假單胞菌，Pseudomonas avenae)、水稻白葉枯病(Xanthomonas campestris)、水稻桿枯病(丁香假單胞菌，Pseudomonassyringae pv.oryzae)、水稻根腐病(Erwunia chrysanthemi pv.zeae)、水稻內(nèi)稃褐變病(Erwinia herbcola)、水稻葉鞘褐變病(Pseudomnasfuscovaginae)、水稻惡菌病(Gibberella fujikuroi)、水稻長蠕孢菌葉斑病(Cochliobolas miyabeanus)稻瘟病(Pyricularia oryzae)、大麥/小麥黑節(jié)病(Peudomonas syringae pv.jaonica)、燕麥暈圈疫(Pseudomonassyringae pv.coronafaciens)、燕麥葉脈枯萎病(Pseudomonas syringaepv.striafaciens)、玉米褐條病(Pseudomonae avenae)、玉米倒伏細菌病(Erwinia chrysanthemi pv.zeae)羊茅草/黑麥草暈圈疫(Pseudomonassyringae pv.atropurprea)高粱條斑細菌病(Pseudomonas andropogonis)、纈縷草葉枯病(Rhizoctonia solani)、纈縷草葉枯腐病(Rhizoctonia)等。
本發(fā)明的微生物農(nóng)藥以這些細菌和/或其芽胞為有效成分。例如，可將上述細菌的懸浮液散布、噴灑、涂抹在禾本科植物或其種子上，或將禾本科植物種子浸于這些細菌的懸浮液中，或將這些細菌的菌體加到浸種液中，灌注、混合到育苗土壤(床土或覆蓋土)中，或將這些細菌的懸浮液散布到大田中的禾本科植物體上。細菌懸浮液的合適濃度隨上述施用方法的不同而不同，例如，在作水稻種子外殼浸漬處理時，這些細菌的濃度為1×1011～1×102/ml，以1×1010～1×105/ml為佳，溫度為5℃～40℃，以15℃～30℃為佳，處理1～2天左右。這種情況下，懸浮液可以是培養(yǎng)菌液，或將培養(yǎng)菌液通過離心分離等除去培養(yǎng)基，將菌體用水或生理鹽水、緩沖液等再懸浮形成的懸浮液。也可采用直接或以適當分散劑分散后冷凍干燥等穩(wěn)定保存的細菌再懸浮所得的液體。
本發(fā)明的微生物農(nóng)藥可以是將對禾本科植物育苗中發(fā)生的細菌性病原體具有抗性作用的上述抗性細菌和/或其芽胞直接制成懸浮液加以使用，也可與諸如固體載體、液體載體等各種載體混合，必要時可加添加劑、其它佐劑，制成可濕性粉劑、懸浮液、粉劑、顆粒劑、糊劑和微膠囊劑加以使用。
制劑中所用的固體載體可用例如高嶺土、葉蠟石、膨潤土、蒙脫土、硅藻土、酸性白土、蛭石和珍珠巖等礦物質載體，硫酸銨、磷酸銨、硝酸銨、尿素、氯化銨和碳酸鈣等無機鹽。還可用小麥粉、麥麩、米糠等有機物微粉。液體載體可用大豆油、棉籽油等植物油、甘油、乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、聚丙二醇等。
粘合劑、分散劑等制劑可有酪蛋白、明膠、淀粉、阿拉伯樹膠、藻酸、纖維素衍生物等多糖類、木素衍生物、糖類、植物油、礦物油、合成水溶性高分子等。
必要時，其它作為制劑用的助劑可用防凍劑、消泡劑、增稠劑等。
另外，本發(fā)明的抗性細菌可與以真菌病害為對象的種子消毒劑或分散劑混合使用，如C18H24ClN3O(ipconazol)、稻瘟酯(pefurazoate)、氟菌唑(triflumizole)、丙氯靈(prochloraz)、氟咯菌腈(fludioxonil)、苯菌靈、甲基托布津(thiophanate-methyl)、四氯苯酞(phthalide)、三環(huán)唑(tricyclazol)、咯喹酮(pyroquilon)、KTU-3616(carpropamid)、嘧菌腙(ferimzone)、稻瘟靈(isoprothiolane)、敵瘟靈(EDDP)、萎銹靈(carboxine)等。
還可與殺蟲劑、殺線蟲劑、殺螨劑、殺菌劑、除草劑、植物生長調(diào)節(jié)劑、增效劑等混合、或不混合而同時使用。
在本發(fā)明的微生物農(nóng)藥制劑中，通常含本發(fā)明的抗性細菌(以濕重計)約0.1-95重量％。以每克制劑中含有約102-1010個菌落形成單位為佳。
實施例以下列舉篩選例、試驗例、制劑例對本發(fā)明進行說明。
篩選例 從稻苗分離抗性菌從貼地部約1cm切取患稻苗立枯細菌病的稻苗，加入少量滅菌水，在乳缽中磨碎，將此磨碎液用適量滅菌水稀釋，涂抹在添加100ppm托酚酮的PPGA培養(yǎng)基上，然后于30℃培養(yǎng)5天。將出現(xiàn)的菌落移植于已添加氯化鐵(Fe+++為50ppm)的PPGA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)5天。形成的菌落是稻苗立枯細菌病菌，如果產(chǎn)生托酚酮，則因與培養(yǎng)基中的Fe+++形成復合物而呈紅色。如果是非托酚酮產(chǎn)生菌，則不呈紅色。選取不呈紅色的菌落，在PPG培養(yǎng)基中30℃振搖培養(yǎng)2天，于5000×g離心分離30分鐘，分離除去培養(yǎng)基。
將所得的菌體再懸浮于滅菌水中，將患苗立枯細菌病的稻谷在菌體懸浮液中20℃浸漬24小時。將經(jīng)處理的稻谷在適當條件下浸種、催芽后進行播種、育苗。與未處理稻谷相比較而得到防治效果的菌株選作抗性菌。
試驗例1 對稻苗立枯細菌病的防治效果以開花期接種的稻苗立枯細菌病細菌的稻種(品種日本晴)和如上所述得到的耐托酚酮和非托酚酮產(chǎn)生菌致金色假單胞菌B5、多粘芽胞桿菌B36和腸桿菌屬cloacae B51作抗稻苗立枯細菌病的種子處理，研究其防治效果。
將抗性菌致金色假單胞菌B5、多粘芽胞桿菌B36和和腸桿菌屬cloacae B51分別用PPGA培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)24小時，離心分離除去培養(yǎng)基，用滅菌水再懸浮物作試驗。將患病種子以1∶1的體積比在抗性菌懸浮液(菌濃度1×109個/ml)中浸漬24小時，接著于30℃浸種(體積比1∶1)3天，然后，在鋪有市售水稻育苗用粒狀培養(yǎng)土(商品名組合公司粒狀培養(yǎng)土)的育苗用箱(10×15cm)中以每箱5克干種進行播種(1區(qū)3個重復)。然后，在出芽器中于32℃保持4天，使其出芽，以后在玻璃溫室中育苗。用如下指數(shù)評價播種15天后各試驗區(qū)的發(fā)病情況。為了作比較，用市售種子消毒劑Sporutak-Starner SE可濕性粉200倍稀釋液作同樣的試驗。結果見表4。
0不發(fā)病1可見白化苗的發(fā)生但無枯死苗2枯死苗25％以下3枯死苗25-50％4枯死秒50-80％5枯死苗80％以上(幾乎全部枯死)表4各菌株對稻苗立枯細菌病的效果菌株或藥劑名 發(fā)病指數(shù)致金色假單胞菌B50.0多粘芽胞桿菌B36 0.3腸桿菌屬cloacae B51 0.3Sportak-Starner SE可濕性粉劑(200倍稀釋) 2.3未處理 4.0試驗例2 對稻穎枯細菌病的防治效果采用在減壓下接種稻穎枯細菌病細菌懸浮液的稻種(品種日本晴)和以致金色假單胞菌B5作為抗性細菌，通過抗性細菌的種子處理進行防治效果研究。試驗按試驗例1同樣的方法進行。以播種15天后未處理區(qū)的枯死苗量為5，按目測指數(shù)評價。結果見表5。
表5 各菌株或藥劑對稻穎枯細菌病的效果菌株或藥劑名 發(fā)病指數(shù)致金色假單胞菌B5 1.5Sportak-Starner SE可濕性粉劑200倍2.4未處理 5.0制劑例將本發(fā)明的抗性細菌用適當?shù)囊后w培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)后，離心分離除去培養(yǎng)基成分，加入高嶺土和水或適當?shù)木彌_液，再懸浮，冷凍干燥。將其在乳缽中輕輕粉碎，按重量比，將粉碎物85％與聚氧化乙烯壬基苯基醚10％、木素磺酸鈉5％相混合，得到可濕性粉劑形式的制劑。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性以本發(fā)明篩選方法選出的細菌及其芽胞為有效成分的微生物農(nóng)藥可得到高于化學農(nóng)藥的防治效果，可望對特定化學農(nóng)藥抗性菌也有效。因而，代替以往的化學農(nóng)藥施用可減少化學物質在環(huán)境中釋放。按照本發(fā)明，可減輕禾本科植物細菌性病害的發(fā)生所致農(nóng)民的經(jīng)濟損失。
關于微生物1)保藏機構國立生命科學和人體技術研究所地址日本國茨城縣っくば市東1丁目1番3號保藏日1997年8月21日保藏號FERM BP-60672)保藏機構國立生命科學和人體技術研究所地址日本國茨城縣っくば市東1丁目1番3號保藏日1997年8月21日保藏號FERM BP-60683)保藏機構國立生命科學和人體技術研究所地址日本國茨城縣っくば市東1丁目1番3號保藏日1997年8月21日保藏號FERM BP-6069
權利要求
1.抗禾本科植物育苗中發(fā)生的細菌性病原菌的抗性菌的篩選方法，所述抗性菌從植物體、土壤、種子或種子的浸種液選出，其特征在于以耐托酚酮和不產(chǎn)生托酚酮為指標。
2.耐托酚酮和不產(chǎn)生托酚酮的抗性菌的篩選方法，其特征在于將植物體、土壤、種子或其粉碎提取物或種子的浸種液置于或涂抹添加了托酚酮的固體培養(yǎng)基上，將形成的菌落移植于含鐵固體培養(yǎng)基上，選擇不呈赤褐色或類似顏色的菌株。
3.微生物農(nóng)藥，以對禾本科植物育苗中發(fā)生的細菌性病原菌具有抗性作用的細菌、其芽胞作為有效成分，其特征在于所述抗性菌是耐托酚酮和不產(chǎn)生托酚酮的。
4.如權利要求3所述的微生物農(nóng)藥，其中以對禾本科植物育苗中發(fā)生的細菌性病原菌有抗性作用的選自假單胞菌屬、芽胞桿菌屬、腸桿菌屬的細菌為抗性菌。
5.如權利要求4所述的微生物農(nóng)藥，其中假單胞菌屬細菌為致金色假單胞菌。
6.如權利要求4所述的微生物農(nóng)藥，其中假單胞菌屬細菌為致金色假單胞菌B5。
7.如權利要求4所述的微生物農(nóng)藥，其中芽胞桿菌屬細菌為多粘芽胞桿菌。
8.如權利要求4所述的微生物農(nóng)藥，其中芽胞桿菌屬細菌為多粘芽胞桿菌B36。
9.如權利要求4所述的微生物農(nóng)藥，其中腸桿菌屬細菌為腸桿菌屬cloacae。
10.如權利要求4所述的微生物農(nóng)藥，其中腸桿菌屬細菌為腸桿菌屬cloacae B51。
全文摘要
以耐托酚酮和不產(chǎn)生托酚酮為指標、篩選對禾本科植物育苗中發(fā)生的細菌性病原體有抗性作用的細菌的方法,以及以該方法篩選出的耐托酚酮和不產(chǎn)生托酚酮的細菌或其芽胞為有效成分的微生物農(nóng)藥。
文檔編號A01N63/00GK1271382SQ98809453
公開日2000年10月25日 申請日期1998年9月22日 優(yōu)先權日1997年9月26日
發(fā)明者豎石秀明 申請人:吳羽化學工業(yè)株式會社