專利名稱：“試管?！奔夹g(shù)產(chǎn)業(yè)化工藝流程的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)，特別涉及動物的繁殖方法。
“試管家畜”技術(shù)，也叫家畜體外受精技術(shù)(In Vitro Fertilization,IVF)，是指通過人工操作使家畜的卵子和精子在體外條件下成熟和受精，并能夠發(fā)育為早期胚胎的技術(shù)。這項技術(shù)在家畜最早取得成功的是在1982年，美國的Brackett等(Bio.Reprod.,27:147-158)用高滲溶液處理牛精子，得到了世界首例體外受精的小牛。但他們所采用的精子獲能方法重復(fù)性很差，包括他們自己也未能得到重復(fù)的結(jié)果。1984年本專利申請者(旭日干)和日本學(xué)者花田章，首次利用鈣離子載體Ionophore A23187和咖啡因等化學(xué)藥物誘導(dǎo)山羊、綿羊及牛精子獲能均獲得成功，并利用此方法培育出世界首胎體外受精山羊(Bull Nippon Vet.and Zootech.Coll.,33:219-221)。后來這一方法在日本、英國、美國、中國和俄羅斯等多國的實驗室，在綿羊、牛和豬等多種家畜的實驗中取得成功，并在此基礎(chǔ)上逐步發(fā)展成為比較成熟的，可開發(fā)利用的生物高技術(shù)。
申請者自1987年起主持國家“863”高技術(shù)計劃項目“牛體外受精技術(shù)的研究與開發(fā)”，經(jīng)過“七五”基礎(chǔ)研究、“八五”應(yīng)用研究和“九五”中試開發(fā)研究取得了重大進展。于1989年培育出了國內(nèi)首胎、首批“試管綿羊”(1989，內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報，20:564-569)和“試管?！?1990，中國科學(xué)通報，21:1666-1667)。同時創(chuàng)造性地提出了利用屠宰家畜卵巢卵母細(xì)胞工廠化生產(chǎn)“試管胚胎”的技術(shù)路線，提出了牛體外受精技術(shù)產(chǎn)業(yè)化工藝流程，提出了利用羔羊卵子進行“試管內(nèi)雜交育種”的新概念，新技術(shù)。
本發(fā)明的目的是利用“試管牛”技術(shù)產(chǎn)業(yè)化工藝流程，可以批量引進國外良種家畜的遺傳資源，在國內(nèi)進行規(guī)?；兎N繁殖，從而迅速擴大良種畜群的規(guī)模，以推動我國養(yǎng)牛業(yè)，特別是肉牛養(yǎng)殖業(yè)的良種化、產(chǎn)業(yè)化進程。這一技術(shù)過程的主要特點是成本低、速度快、數(shù)量大和效果好，因此該項技術(shù)具有任何一項常規(guī)技術(shù)都不可替代的優(yōu)勢。
本發(fā)明的內(nèi)容在國外利用不同優(yōu)良品種牛的資源，大批量生產(chǎn)純種肉牛和奶牛試管胚胎，運回國內(nèi)進行大規(guī)模胚胎移植，從而達(dá)到國內(nèi)牛品質(zhì)的迅速改良，滿足國內(nèi)對高檔肉牛和奶牛的需求，這就是本項技術(shù)的主要目的。這一技術(shù)路線及其生產(chǎn)規(guī)模目前在國際上尚無前例。
(1)從國外屠宰場中采集優(yōu)良品種純種牛卵巢，帶回實驗室后從卵巢表面回收卵母細(xì)胞。將卵母細(xì)胞在體外成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)成熟后進行體外受精處理，受精用精子采用與卵巢相同品系的種公牛精子。體外受精卵在體外培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)繼續(xù)被體外發(fā)育培養(yǎng)至囊胚期，然后將發(fā)育良好的優(yōu)質(zhì)胚胎經(jīng)冷凍保存處理后儲存于液氮罐中。在整個體外受精培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液中添加的任何成分均確定不含有任何病原體，從而保證批量生產(chǎn)出的良種牛試管胚胎為不帶有病原體的胚胎。
(2)將保存于液氮罐中的胚胎運回國內(nèi)。胚胎解凍后移植到國內(nèi)遺傳品質(zhì)較差的受體牛子宮內(nèi)。
(3)受體牛受孕后產(chǎn)下優(yōu)良品種的純種牛犢。
(4)良種犢牛經(jīng)18個月的飼養(yǎng)發(fā)育至育成期小牛。
(5)優(yōu)良品種的育成期小牛經(jīng)3-5個月的育肥飼養(yǎng)后成為育肥牛。
(6)將育肥牛送至屠宰場屠宰可以得到高品質(zhì)的牛肉。
(7)屠宰得到的高品質(zhì)的牛肉可直接供應(yīng)市場。
(8)屠宰過程中得到的卵巢又可用于生產(chǎn)良種牛試管胚胎。
(9)選擇發(fā)育狀況優(yōu)秀的育成期小牛，經(jīng)飼養(yǎng)后可成為種牛。良種母牛經(jīng)超數(shù)胚卵處理后可以獲得優(yōu)質(zhì)良種胚胎，用于胚胎移植。
(10)沒有受孕的受體母?？梢岳脙?yōu)良品種牛的精液進行人工授精，生產(chǎn)出具有較高經(jīng)濟價值的雜交一代小牛，經(jīng)育肥后屠宰。這樣既可以得到較高質(zhì)量的牛肉，又可避免了受體?？諔言斐傻慕?jīng)濟損失。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果1．采用此項工藝可以工廠化、大規(guī)模生產(chǎn)牛試管胚胎。利用本技術(shù)從屠宰場采集的卵巢卵母細(xì)胞的30％以上可以發(fā)育至可供胚胎移植的囊胚期胚胎，然后將這些胚胎進行冷凍保存。在此條件下兩名研究人員在國外一年可以生產(chǎn)近萬枚胚胎，這一生產(chǎn)量是其他任何技術(shù)不能達(dá)到的。試管胚胎的大規(guī)模生產(chǎn)可以充分保證國內(nèi)大規(guī)模胚胎移植所用胚胎的供應(yīng)，從而為這一技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化提供保障。
2．采用此項工藝可以短時間內(nèi)大批量繁殖良種肉牛。利用運回國內(nèi)的牛試管胚胎可以在國內(nèi)大規(guī)模開展胚胎移植工作，目前牛試管胚胎的移植妊娠率為40％左右，一名胚胎移植工作人員一天可移植幾十頭牛，因此只要受體牛充足，每年可以獲得大批試管牛犢。因為生產(chǎn)的試管牛胚胎均為純種胚胎，因此胚胎移植得到的牛犢均為純種牛犢，實現(xiàn)了牛遺傳品種的一步改良。如果采用傳統(tǒng)的牛遺傳品種改良方法(如人工授精)，一個品種的改良往往需要20年以上的時間，而且得到的改良品種仍不是純種，如果管理不善很容易造成品種的退化。由此可以看出采用本工藝可以在短時間內(nèi)得到大量的純種牛，具有周期短，效果好的特點。
3．采用此項工藝可以極大地降低良種牛引進的成本。在此之前良種牛的引入主要采取活牛引入和從國外購買超排處理胚胎(體內(nèi)受精胚胎)的方法。從國外購買一頭純種牛往往需要幾萬元人民幣，而且很容易造成疾病的傳播，運輸也十分不方便。從國外購買超排處理胚胎防止了疾病的傳播，胚胎的運輸也十分便利，但每枚胚胎的價格都在200-300美元以上，價格十分昂貴，增加了引進牛的成本，不容易大規(guī)模推廣。本項工藝避免了上述兩種方法的缺陷，在國外生產(chǎn)的無病原體胚胎可以大批量運回國內(nèi)，而且胚胎的成本十分低。兩名研究人員一年在國外的實驗費用及生活費用只需人民幣十多萬元，卻可以生產(chǎn)出近萬枚胚胎，這樣每枚胚胎的成本只需人民幣幾十元。這樣低成本的胚胎十分適合我國的國情，完全可以在國內(nèi)大規(guī)模推廣應(yīng)用。
從以上幾點可以看出，目前在國外良種牛的引進方法中，采用“試管?！奔夹g(shù)在國外生產(chǎn)試管胚胎，然后運回國內(nèi)進行大規(guī)模胚胎移植是最有效的技術(shù)途徑。
附圖
為“試管牛”技術(shù)產(chǎn)業(yè)化工藝流程實施例在國外從屠宰場采集純種牛卵巢。將采自屠宰場的卵巢帶回實驗室，從卵巢表面的卵泡內(nèi)回收卵母細(xì)胞，采卵液為BSA+3mg/mlBSA。將卵母細(xì)胞置于Hepes緩沖的TCMl99+10％FCS+HCG+E2內(nèi)成熟培養(yǎng)20-24小時，培養(yǎng)箱內(nèi)條件為39℃,5％CO2。將與卵巢相同品種的種公牛冷凍精液置于37℃BO+10mM咖啡因內(nèi)，以3000轉(zhuǎn)/分離心洗滌2次，然后將精子移入BO+5mM咖啡因+10mg/mlBSA+5μg/ml肝素的受精培養(yǎng)液中，使精子濃度達(dá)到2×106ml。將成熟培養(yǎng)后的卵母細(xì)胞移入該精子懸液中，共同培養(yǎng)7小時進行受精處理。
將受精后的受精卵移入發(fā)育培養(yǎng)液中進行體外發(fā)育培養(yǎng)。受精卵在Hepes緩沖的TCM199+10％FCS+0.12mg/ml丙酮酸鈉的培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)48小時，將發(fā)育至8細(xì)胞期的胚胎移入含有卯丘細(xì)胞或輸卵管上皮細(xì)胞的共同培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)至桑椹胚或囊胚階段，然后進行冷凍保存。體外受精胚胎的冷凍保存方法為將囊胚期胚胎移入PBS+20％FCS+10％乙二醇+0.25M蔗糖的冷凍液中平衡15分鐘，裝入冷凍管中進行冷凍。冷凍程序為-7℃下停留10分鐘，5分鐘時進行植冰，然后以0.3℃/分的速度降溫至-30℃，投入液氮中保存。
將保存于液氮罐中的胚胎運回國內(nèi)，在旭日生物高科技有限公司牧場(位于呼和浩特市托克托縣)和其他胚胎移植基地(大連，呼倫貝爾盟)進行胚胎移植。胚胎移植時先將保存于液氮罐中的胚胎進行解凍處理，解凍時將含有胚胎的冷凍管置于30℃水浴中解凍，然后將胚胎移入PBS+20％FCS+0.7M蔗糖的解凍液中停留10分鐘，最后移入PBS+20％FCS中待移植。選擇營養(yǎng)狀況良好、發(fā)情后6-7天的受體母牛，利用非手術(shù)方法將解凍后的胚胎移入受體牛子宮內(nèi)，觀察受體牛妊娠情況。對妊娠母牛需加強管理，防止流產(chǎn)發(fā)生。母牛妊娠十個月后即可產(chǎn)下純種牛犢。
采用上述工藝流程，在澳大利亞用三年的時間生產(chǎn)出了一萬七千余枚胚胎。在胚胎的生產(chǎn)過程中，卵母細(xì)胞受精后的卵裂率為80％以上，囊胚的發(fā)育率為40％左右，冷凍胚胎解凍后的形態(tài)正常率為80％以上。通過國內(nèi)的胚胎移植工作，現(xiàn)已獲得純種試管牛70多頭，最好的移植受胎率可達(dá)40％以上。目前國內(nèi)的胚胎移植工作正在大規(guī)模地開展中。與此同時在加拿大建成了第二個良種牛“試管胚胎”生產(chǎn)實驗室，用以進一步擴大胚胎來源和良種牛的品種資源。
權(quán)利要求
1.試管牛技術(shù)產(chǎn)業(yè)化工藝流程，其特征是下列步驟組成(1)從屠宰場中采集優(yōu)良品種純種牛卵巢，從卵巢表面回收卵母細(xì)胞，采卵液為PBS+3mg/mlBSA，將卵母細(xì)胞在體外成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)成熟后進行體外受精處理，受精用精子采用與卵巢相同品系的種公牛精子，體外受精卵在體外培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)繼續(xù)體外發(fā)育培養(yǎng)至囊胚期，然后將發(fā)育良好的優(yōu)質(zhì)胚胎經(jīng)冷凍保存處理后儲存于液氮罐中，在體外受精培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液添加的任何成分均確定不含有任何病原體；(2)將保存于液氮罐中的胚胎解凍后移殖到遺傳品質(zhì)較差的受體牛子宮內(nèi)；(3)受體牛受孕后產(chǎn)下優(yōu)良品種的純種牛犢；(4)良種犢牛經(jīng)18個月的飼養(yǎng)發(fā)育至育成期小牛；(5)優(yōu)良品種的育成期小牛經(jīng)3-5個月的育肥飼養(yǎng)后成為育肥牛；(6)將育肥牛送至屠宰場屠宰可以得到高品質(zhì)的牛肉；(7)屠宰得到的高品質(zhì)的牛肉可直接供應(yīng)市場；(8)屠宰過程得到的卵巢又可用于生產(chǎn)良種牛試管胚胎；(9)選擇發(fā)育狀況優(yōu)秀的育成期小牛，經(jīng)飼養(yǎng)后可成為種牛，良種母牛經(jīng)超數(shù)排卵處理后可以獲得優(yōu)質(zhì)良種胚胎，用于胚胎移植；(10)沒有受孕的受體母?？梢岳脙?yōu)良品種牛的精液進行人工受精，生產(chǎn)出具有較高經(jīng)濟價值的雜交一代小牛，經(jīng)育肥后屠宰，可以得到較高質(zhì)量的牛肉。
2.如權(quán)利要求1所述的試管牛技術(shù)產(chǎn)業(yè)化工藝流程，其特征是步驟(1)中的培養(yǎng)液為Hepes緩沖的TCM199+10％FCS+HCG+E2，培養(yǎng)時間為20-24小時，培養(yǎng)箱條件為39℃、5％CO2，與卵巢相同品種的種公牛冷凍精液置于37℃BO+10mM咖啡因內(nèi)，以3000轉(zhuǎn)/分離心洗滌2次，然后將精子移入BO+5mM咖啡因+10mg/mlBSA+5μg/ml肝素的受精培養(yǎng)液中，使精子濃度達(dá)到2×106ml，培養(yǎng)7小時，受精后的受精卵在Hepes緩沖的tcm199+10％fcs+0.12mg/ml丙酮酸鈉的培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)48小時，將發(fā)育至8細(xì)胞期的胚胎移入含有卵母細(xì)胞或輸卵管上皮細(xì)胞的共同培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)至桑椹胚或囊胚階段，然后冷凍保存。冷凍程序為-7℃下停留10分鐘，5分鐘進行植冰，然后以0.3℃/分的速度降溫至-30℃，投入液氮中保存。
3.如權(quán)利要求1所述的試管牛技術(shù)產(chǎn)業(yè)化工藝流程；其特征是步驟(2)胚胎解凍時將含有胚胎的冷凍管呈于30℃水浴中解凍，然后將胚胎移入PBS+20％FCS+0.7M蔗糖的解凍液中停留10分鐘，最后移入PBS+20％FCS待移植，選擇營養(yǎng)狀況良好，發(fā)情后6-7天的受體母牛利用非手術(shù)方法將解凍后的胚胎移入受體牛子宮內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明屬生物工程技術(shù),利用優(yōu)良品種純種牛卵巢回收卵母細(xì)胞,經(jīng)體外成熟、體外受精、體外發(fā)育及胚胎冷凍和解凍后的移植,利用我國現(xiàn)有母牛做為受體牛,借腹懷胎,從而得到大批的優(yōu)良品種純種牛犢,本發(fā)明的優(yōu)點是可以短時間內(nèi)大批量繁殖良種肉牛,同時可以極大地降低良種牛引進的成本。
文檔編號A01K67/02GK1226377SQ9910329
公開日1999年8月25日 申請日期1999年4月1日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月1日
發(fā)明者旭日干 申請人:旭日干