專利名稱：生物菌劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種多株菌混合發(fā)酵制成的生物菌劑及制備方法。
現(xiàn)代農(nóng)業(yè)依賴化肥，但化肥的利用率低于40％，更多的化肥經(jīng)淋溶(損失約10％)、地面沖刷(損失約15％)、揮發(fā)(損失約20％)及反硝化脫氮(損失約15％)等進入土壤及周圍環(huán)境，造成多種不良后果一是給人類帶來許多嚴(yán)重的污染問題；二是農(nóng)作物特別是瓜果、蔬菜等品質(zhì)顯著下降；三是土壤板結(jié)，無機養(yǎng)分不易分解，造成地力下降。后者又迫使農(nóng)民年復(fù)一年的加大化肥用量，不僅費用加大，而且加重了上述弊端，形成了惡性循環(huán)。
本發(fā)明的目的旨在提供一種防止土地板結(jié)，保護自然生態(tài)環(huán)境，促進農(nóng)業(yè)大幅度增產(chǎn)，防止病蟲害，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)綠色食品創(chuàng)造條件的微生物肥料及制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是制備方法中所使用的八株菌種均來自國家菌庫，具體如下1、固 氮 菌 (AS.1.222 Azotobater)、2、巨大芽孢桿菌 (AS.1.151 Bacillus megaterium de Bary)、3、膠凍樣芽孢桿菌(AS.1.153 Bacillus mucilaginosus)、4、枯草芽孢桿菌 (AS.1.108 Bacillus subtilis)、5、產(chǎn)黃纖維單胞菌(AS.1.102 Cellulomonas flaxigera)、6、熒光假單胞菌 (AS.1.867 Pseudomonas fluorescens)、7、惡臭假單胞菌 (AS.1.870 Pseudomonas putida)、8、蘇云金芽孢桿菌松躅亞種(AS.1.294 Bacillus thuringiensis)。
生產(chǎn)工藝路線首先，八株菌種分別經(jīng)原始菌種→斜面菌種→三角瓶搖床深層發(fā)酵三步工藝制成所需要的擴大菌種，其中，各種斜面培養(yǎng)基配比如下(1)固氮菌斜面培養(yǎng)基配比KH2PO40.1—0.4克、K2HPO40.5—1.2克、MgSO4·7H2O 0.05—0.4克、CaSO4·2H2O 0.005—0.02克、FeCl3微量、Na2MoO4·2H2O微量、酵母膏0.2—0.8克、甘露醇15—25克、瓊脂18—25克、葡萄糖2％、PH7.2的蒸餾水1升，滅菌121℃/30min，培養(yǎng)溫度30℃。
(2)巨大芽孢桿菌斜面培養(yǎng)基配比蛋白胨4—6克、牛肉膏2—4克、NaCl4—6克、瓊脂18—25克、PH7.0—7.1的水1升，滅菌121℃/30min。
(3)膠凍樣芽孢桿菌斜面培養(yǎng)基配比同上。
(4)枯草芽孢桿菌斜面培養(yǎng)基配比同上。
(5)產(chǎn)黃纖維單胞菌斜面培養(yǎng)基配比NaCl4—8克、MgSO4·7H2O 0.05—0.2克、KH2PO40.4—0.6克、CaCl20.05—0.2克、K2HPO41—3克、(NH4)2SO41—4克、酵母膏0.5—2克、濾紙條1片、PH7.0—7.5的蒸餾水1升、滅菌121℃/30min。
(6)熒光假單胞菌斜面培養(yǎng)基配比同(2)。
(7)惡臭假單胞菌斜面培養(yǎng)基配比同上。
(8)蘇云金芽孢桿菌松躅亞種斜面培養(yǎng)基配比同上。
各種生產(chǎn)菌的三角瓶搖床發(fā)酵培養(yǎng)基配比同斜面培養(yǎng)基配比減去瓊脂即可。
第三步三角瓶搖床深層發(fā)酵的溫度為30℃，時間是48小時。
然后，把經(jīng)過深層發(fā)酵的八株菌種混合再經(jīng)過一級種子罐發(fā)酵→二級種子罐發(fā)酵→三級種子罐發(fā)酵→四級種子罐發(fā)酵四步工藝，最后第四級發(fā)酵罐放罐標(biāo)準(zhǔn)含菌數(shù)為20—150×108個/ml。其中四步發(fā)酵工藝的參數(shù)如下(1)發(fā)酵溫度30℃±1℃；(2)PH7.0—7.2；(3)無菌空氣通入量
M3/min；(4)發(fā)酵時間連續(xù)48小時；(5)罐壓控制0.3—0.5Kg/cm2左右；(6)接種量10％(含菌數(shù)10×108—15×108個/ml)。
一級到四級發(fā)酵罐培養(yǎng)液的配比如下一級發(fā)酵罐培養(yǎng)液的配比是重過磷酸鈣28—34克、氯化鉀28—34克、尿素56—64克、用玉米糖漿調(diào)糖度至4°—5°(依糖度代調(diào)整)、自來水26—30千克、滅菌108℃/40min；以下各級發(fā)酵罐培養(yǎng)液逐步以10倍量放大，其培養(yǎng)參數(shù)相同。
最后拌載體(礦粉)制成本發(fā)明的產(chǎn)品。
本發(fā)明的積極效果是具有固氮，解磷、鉀，分解纖維素、木質(zhì)素，分解蛋白質(zhì)及有害有機酸和酸素，抑制和殺滅病原菌，克服連作障礙等多種功能?？梢云鸬酱龠M增根、促早熟、防蟲抗病、改善品質(zhì)、改良土壤、提高產(chǎn)量、增加效益等綜合作用。另外，施用有益的微生物菌群與土壤微生物協(xié)同作用，能夠促進植物(農(nóng)作物)生長，保證動物(主要是人類)生存、生活條件，維護自然界生態(tài)平衡(以物質(zhì)交換、能量交換為基礎(chǔ))，構(gòu)成了農(nóng)業(yè)戰(zhàn)線上的綠色工程。
以下是本發(fā)明應(yīng)用效果的實施例一、本發(fā)明的生物菌劑在玉米上應(yīng)用效果的實施例(一)試驗材料與方法1、供試土壤黑土，肥力中等，PH值近中性。
2、試驗處理處理1—常規(guī)施肥＋菌劑250克/畝作底肥一次性施入土壤；處理2—常規(guī)施肥＋菌劑500克/畝作底肥一次性施入土壤；處理3—常規(guī)施肥。
3、試驗設(shè)計試驗采用小區(qū)試驗，小區(qū)面積20平方米，三次重復(fù)，三次處理，隨機區(qū)組排列。
(二)試驗結(jié)果與分析1、在玉米生長期，對不同處理的玉米生育情況進行調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明處理的玉米，改善了玉米的生長發(fā)育性狀，與對照相比，株高增高7—12cm，葉色深綠，穗長增長2.1—3.5cm，每穗粒數(shù)增加20—35個，百粒重增加2.3—3.8克。(見表1)表1玉米生育性狀調(diào)查表
2、試驗中對玉米的生育時期進行了調(diào)查，調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，施用本發(fā)明的玉米，比對照早出苗2—3天，拔節(jié)、抽穗期提前2—3天，成熟期提前4—5天。(見表2)表2 玉米生育時間調(diào)查表
、施用本發(fā)明的生物菌劑對玉米產(chǎn)量的影響進行統(tǒng)計分析。(見表3)表3玉米產(chǎn)量調(diào)查表 Kg/小區(qū)
4、對建設(shè)鄉(xiāng)玉米的增產(chǎn)調(diào)查結(jié)果進行差異顯著性檢驗，以驗證其可靠性。
表4 資料的方差分析
二、本發(fā)明的生物菌劑在蔬菜上應(yīng)用效果的實施例(一)試驗材料與方法1、試驗土壤草甸土，肥力中等，PH值7.5。
2、試驗作物黃瓜。
3、試驗處理處理1—常規(guī)施肥＋生物菌劑250克/畝作底肥一次性施入土壤；處理2—常規(guī)施肥＋生物菌劑500克/畝作底肥一次性施入土壤；處理3—常規(guī)施肥。
4、試驗設(shè)計本試驗采取小區(qū)試驗法，小區(qū)面積20平方米，三次重復(fù)，隨機區(qū)組排列。
(二)試驗結(jié)果與分析1、通過觀查與分析，施用本發(fā)明的生物菌劑的黃瓜葉色明顯比對照濃綠，單果重增加，單株果數(shù)增加，增產(chǎn)效果顯著。(見表5)表5黃瓜生育性狀調(diào)查表
2、選取紅旗鄉(xiāng)的試驗數(shù)據(jù)對施用本發(fā)明的生物菌劑的黃瓜產(chǎn)量性狀影響進行統(tǒng)計分析，增產(chǎn)率達(dá)8.3％。(見表6)
這四種含添加劑的柴油燃料被裝入到四個250cm3的試管中。
將這四個試管密封塞好，在-20℃下靜置于一個冷室24小時。24小時后，用每支試管中所觀察到的相數(shù)和它們的性質(zhì)來評價含添加劑的柴油燃料的均勻性，然后測定上層和下層相的濁點溫度。
上層相的性質(zhì)對添加劑組合物的抗沉降效果是關(guān)鍵的。當(dāng)上層相是混濁的，則大部分蠟都保持懸浮狀態(tài)，而當(dāng)這一相是澄清的，所有的蠟實際上都已沉降下去，也就是說已經(jīng)在試管底部結(jié)塊。
試管中不同相所占的體積百分比和上層相與下層相的濁點溫差，這些定量結(jié)果列于下面的表Ⅲ表
可以發(fā)現(xiàn)，將一種抗沉降劑加入到已加入FLT的柴油燃料中時(樣品1和2)，柴油燃料的均勻性得到了改進，這一點可從試管中上層相和下層相濁點差的下降看出。
當(dāng)按本發(fā)明的穩(wěn)定分散劑加入到只有可濾性添加劑(FLT)的柴油燃料中時，柴油燃料的均勻性并沒有改進，上層相和下層相的濁點溫差基本保持不變(樣品1和3)。
(6)熒光假單胞菌斜面培養(yǎng)基配比同(2)。
(7)惡臭假單胞菌斜面培養(yǎng)基配比同上。
(8)蘇云金芽孢桿菌松躅亞種斜面培養(yǎng)基配比同上。
然后，把八株斜面菌種再分別放到裝有200ml各自的培養(yǎng)基的500ml容量的三角瓶中，進行深層發(fā)酵，各種生產(chǎn)菌的三角瓶搖床發(fā)酵培養(yǎng)基配比同斜面培養(yǎng)基配比減去瓊脂即可，發(fā)酵溫度為30℃，經(jīng)過48小時以后，分別取出八株菌種混合依次放進一級種子罐、二級種子罐、三級種子罐、四級種子罐里發(fā)酵，最后第四級發(fā)酵罐，放罐標(biāo)準(zhǔn)含菌數(shù)為20—150×108個/ml。其中發(fā)酵參數(shù)如下(1)發(fā)酵溫度303±1℃；(2)PH7.0—7.2；(3)無菌空氣通入量
M3/min；(4)發(fā)酵時間連續(xù)48小時；(5)罐壓控制0.3—0.5Kg/cm2左右；(6)接種量10％(含菌數(shù)10×108—15×108個/ml)。
一級發(fā)酵罐培養(yǎng)液的配比是重過磷酸鈣30克、氯化鉀30克、尿素60克、用玉米糖漿調(diào)糖度至4°—5°(依糖度代調(diào)整)、自來水28千克、滅菌108℃/40min；以下各級發(fā)酵罐培養(yǎng)液逐步以10倍量放大，其培養(yǎng)參數(shù)相同。
最后經(jīng)拌載體沸石∶蛭石粉(80—100目)＝9∶2，制成本發(fā)明所述的產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.一種生物菌劑及制備方法，其特征在于制備方法中所使用的八株菌種是(1)固 氮 菌(AS.1.222 Azotobater)、(2)巨大芽孢桿菌(AS.1.151 Bacillus megaterium de Bary)、(3)膠凍樣芽孢桿菌(AS.1.153 Bacillus mucilaginosus)、(4)枯草芽孢桿菌(AS.1.108 Bacillus subtilis)、(5)產(chǎn)黃纖維單胞菌(AS.1.102 Cellulomonas flaxigera)、(6)熒光假單胞菌(AS.1.867 Pseudomonas fluorescens)、(7)惡臭假單胞菌(AS.1.870 Pseudomonas putida)、(8)蘇云金芽孢桿菌松躅亞種(AS.1.294 Bacillus thuringiensis)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物菌劑及制備方法，其特征在于生產(chǎn)工藝路線首先，八株菌種分別經(jīng)原始菌種→斜面菌種→三角瓶搖床深層發(fā)酵三步工藝制成所需要的擴大菌種，其中，各種斜面培養(yǎng)基配比如下(1)固氮菌斜面培養(yǎng)基配比KH2PO4 0.1-0.4克、K2HPO4 0.5-1.2克、MgSO4·7H2O 0.05-0．4克、CaSO4-2H2O 0.005-0.02克、FeCl3微量、Na2MOO4·2H2O微量、酵母膏0.2-0.8克、甘露醇15-25克、瓊脂18-25克、葡萄糖2％、PH7.2的蒸餾水1升，滅菌121C/30min，培養(yǎng)溫度30C。(2)巨大芽孢桿菌斜面培養(yǎng)基配比蛋白胨4-6克、牛肉膏2-4克、NaCl 4-6克、瓊脂18-25克、PH7.0-7.1的水1升，滅菌121℃/30min。(3)膠凍樣芽孢桿菌斜面培養(yǎng)基配比同上。(4)枯草芽孢桿菌斜面培養(yǎng)基配比同上。(5)產(chǎn)黃纖維單胞菌斜面培養(yǎng)基配比NaCl 4-8克、MgSO4．7H2O0.05-O.2克、KH2PO4 0.4-0.6克、CaCl2 0.05-0．2克、K2HPO4 1-3克、(NH4)2SO4 1-4克、酵母膏O.5-2克、濾紙條1片、PH7.0-7.5的蒸餾水1升、滅菌121℃/30min。(6)熒光假單胞菌斜面培養(yǎng)基配比同(2)。(7)惡臭假單胞菌斜面培養(yǎng)基配比同上。(8)蘇云金芽孢桿菌松躅亞種斜面培養(yǎng)基配比同上。各種生產(chǎn)菌的三角瓶搖床發(fā)酵培養(yǎng)基配比同斜面培養(yǎng)基配比減去瓊脂即可。第三步三角瓶搖床深層發(fā)酵的溫度為30℃，時間是48小時。然后，把經(jīng)過深層發(fā)酵的八株菌種混合再經(jīng)過一級種子罐發(fā)酵→二級種子罐發(fā)酵→三級種子罐發(fā)酵→四級種子罐發(fā)酵四步工藝，最后第四級發(fā)酵罐，放罐標(biāo)準(zhǔn)含菌數(shù)為20-150×108個/ml。其中四步發(fā)酵工藝的參數(shù)如下(1)發(fā)酵溫度30℃±1℃；(2)PH7.0-7.2；(3)無菌空氣通入量÷M3／min；(4)發(fā)酵時間連續(xù)48小時；(5)罐壓控制0.3-0.5Kg/cm2左右；(6)接種量10％(含菌數(shù)10×108-15×108個/ml)；一級到四級發(fā)酵罐培養(yǎng)液的配比如下一級發(fā)酵罐培養(yǎng)液的配比是重過磷酸鈣28-34克、氯化鉀28-34克、尿素56-64克、用玉米糖漿調(diào)糖度至4°-5°(依糖度代調(diào)整)、自來水28千克、滅菌108℃/40min；以下各級發(fā)酵罐培養(yǎng)液逐步以10倍量放大，其培養(yǎng)參數(shù)相同。最后經(jīng)拌載體(礦石粉)，制成本發(fā)明所述的產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所生產(chǎn)的產(chǎn)品。
全文摘要
一種生物菌劑及制備方法屬于農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物技術(shù)領(lǐng)域，其特點是利用國家菌庫提供的八株菌種經(jīng)斜面菌種培養(yǎng)、三角瓶發(fā)酵、一、二、三、四級種子罐混合發(fā)酵、混載體而制成本發(fā)明，其優(yōu)點是具有固氮，解磷、鉀，分解纖維素、木質(zhì)素，分解蛋白質(zhì)及有害有機酸和酸素，抑制和殺滅病原菌，克服連作障礙等多種功能?？梢云鸬酱龠M增根、促早熟、防蟲抗病、改善品質(zhì)、改良土壤、提高產(chǎn)量、增加效益等綜合作用。另外，施用有益的微生物菌群與土壤微生物協(xié)同作用，能夠促進植物(農(nóng)作物)生長，保證動物(主要是人類)生存、生活條件，維護自然界生態(tài)平衡(以物質(zhì)交換、能量交換為基礎(chǔ))，構(gòu)成了農(nóng)業(yè)戰(zhàn)線上的綠色工程。
文檔編號C05F11/00GK1227829SQ9911270
公開日1999年9月8日 申請日期1999年2月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月14日
發(fā)明者王景迢 申請人:王景迢