專(zhuān)利名稱：大豆花粉管通道轉(zhuǎn)基因及其品種改良技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于在大豆上轉(zhuǎn)移外源基因以及大豆種質(zhì)改良技術(shù)。
將外源DNA(基因)轉(zhuǎn)至受體農(nóng)作物，使農(nóng)作物產(chǎn)生新的、人們期望的性狀的技術(shù)，被稱之為轉(zhuǎn)基因技術(shù)。它不同于常規(guī)的有性雜交，使雙親的遺傳組成在染色體水平進(jìn)行交換重組，而是在分子水平即在載有遺傳信息的DNA分子水平進(jìn)行重組和交換、使基因發(fā)生改變。迄今為止，國(guó)際上現(xiàn)有的轉(zhuǎn)移外源基因的方法按技術(shù)的屬性分有三類(lèi)①物理法，如基因槍、電激、顯微注射、激光、超聲波、碳化硅纖維；②化學(xué)法，如磷酸鈣-DNA共沉淀、聚乙二醇(PEG)、脂質(zhì)體等；③生物學(xué)法，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移、花粉攜帶、花粉管通道。綜合分析國(guó)際文獻(xiàn)，農(nóng)桿菌法及基因槍法目前在應(yīng)用上占主導(dǎo)地位，其它方法也有利用。評(píng)價(jià)一個(gè)轉(zhuǎn)基因技術(shù)好與否，要考慮其是否高效，是否易于重復(fù)，難易程度及其適用范圍。一個(gè)成熟的、實(shí)用性廣泛的轉(zhuǎn)基因技術(shù)系統(tǒng)，必須具備高效、重復(fù)性高、簡(jiǎn)易、快速、適用性廣等特點(diǎn)。其中最重要的是轉(zhuǎn)化頻率要高，易于重復(fù)，以及沒(méi)有基因型依賴性?；蛐偷囊蕾囆砸约澳承┲匾r(nóng)作物的轉(zhuǎn)化效率低被公認(rèn)為是目前植物基因工程發(fā)展的主要限制因素。下面對(duì)幾個(gè)主要方法作一分析(一)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，是借助于農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)自有的Ti質(zhì)?？梢韵蛑参锛?xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移并可插進(jìn)植物細(xì)胞基因組內(nèi)復(fù)制增殖的特性，人為地將重組DNA裝至Ti質(zhì)粒上，再讓農(nóng)桿菌侵染植物，把人們所需要的基因通過(guò)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。這個(gè)技術(shù)一般需要建立植物組織培養(yǎng)再生系統(tǒng)，農(nóng)桿菌侵染經(jīng)培養(yǎng)的外植體，然后在選擇壓力下，篩選出轉(zhuǎn)化愈傷組織，再經(jīng)再生獲得轉(zhuǎn)基因(DNA)植株。其優(yōu)點(diǎn)相對(duì)簡(jiǎn)單易于操作，對(duì)大多數(shù)雙子葉植物的各種器官或組織均適合，但存在基因型依賴性，特別是對(duì)一些不易于再生的作物，轉(zhuǎn)化效率很低，大豆屬于此類(lèi)。
(二)基因槍轉(zhuǎn)化法基因槍技術(shù)的基本原理是以火藥爆炸、高壓放電或高壓氣作驅(qū)動(dòng)力，將載有外源DNA的鎢、金等金屬顆粒加速，射擊真空室中的靶細(xì)胞或組織，從而達(dá)到將外源DNA分子導(dǎo)入靶細(xì)胞中的目的。其步驟包括微粒子彈裝備、裝槍、轟擊、過(guò)渡培養(yǎng)和選擇培養(yǎng)。
此技術(shù)可用于雙子葉和單子葉植物，受體靶可以是組織也可以是細(xì)胞，與農(nóng)桿菌法相比，克服了一些基因型對(duì)農(nóng)桿菌不敏感的缺欠，特別是可用于單子葉植物，因而是繼農(nóng)桿菌介導(dǎo)法之后又一廣泛應(yīng)用的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。其不足之處轉(zhuǎn)化效率比農(nóng)桿菌還低；基因槍的造價(jià)高，轉(zhuǎn)化成本也高，而且也必須有一個(gè)組織培養(yǎng)再生系統(tǒng)。
(三)PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、電擊穿孔轉(zhuǎn)化、顯微注射、激光微束、超聲波、脂質(zhì)體介導(dǎo)等這些方法的前提都建立在有成功的植物細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)系統(tǒng)基礎(chǔ)上，由于原生質(zhì)體培養(yǎng)相對(duì)于組織培養(yǎng)更困難，因此應(yīng)用受到限制。
(四)花粉管通道法花粉管通道法的原理是植物在開(kāi)花授粉受精過(guò)程中，在從柱頭到胚囊之間形成可使大分子通過(guò)的通道，而胚囊此時(shí)又呈部分無(wú)壁的原生質(zhì)體狀態(tài)，外源DNA分子可進(jìn)入細(xì)胞參與受體基因組DNA的合成復(fù)制。本方法可在室外操作，在植株開(kāi)花的某一時(shí)刻，將DNA分子溶液在合適的受精生理時(shí)期，采取合適的方法注入胚囊，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化目的。此技術(shù)不需要組織培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)化儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)便，易于掌握，而且可克服基因型的限制。此技術(shù)需針對(duì)不同作物采用不同方法細(xì)則操作。棉花是此技術(shù)首先成功的對(duì)象。
本發(fā)明的目的是建立一個(gè)適用于大豆的轉(zhuǎn)DNA(基因)技術(shù)，并用此技術(shù)向大豆轉(zhuǎn)移各種來(lái)源的DNA分子，以達(dá)到改變大豆遺傳DNA分子組成，創(chuàng)造大豆新種質(zhì)，改良大豆品種。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種大豆花粉管通道轉(zhuǎn)基因方法，包括外源基因的提取純化，選擇受體大豆并種植至開(kāi)花，對(duì)花器官進(jìn)行處理，注入DNA導(dǎo)入液，對(duì)種子及后代進(jìn)行鑒定篩選；選擇受體大豆當(dāng)日開(kāi)的花，去除翼瓣、龍骨瓣，留中央旗瓣，露出柱頭，用眼科小剪從雌蕊靠近子房處剪去柱頭；在切口處滴15～20ulDNA導(dǎo)入液，在幼胚至種子成熟時(shí)，或取幼胚進(jìn)行組織培養(yǎng)篩選或取成熟種子對(duì)其進(jìn)行種子處理篩選，得到轉(zhuǎn)基因大豆。
DNA導(dǎo)入液以0.1×SSC、TE、或ddH2O溶解外源DNA，濃度為25-150ug/ml質(zhì)粒DNA，100-500ug供體基因組總DNA。
外源基因?yàn)榇蠖够蛘叻谴蠖够?，?lái)源可為種間，屬間，科間以至微生物。
外源基因?yàn)楦鞣N抗性、品質(zhì)及其它有益性狀基因。
受體為大豆品種、品系或者中間材料。
受體大豆當(dāng)日開(kāi)花的生理時(shí)間為其自花受粉后6-14小時(shí)。
幼胚組織培養(yǎng)篩選是將選擇劑配制到培養(yǎng)基中，將轉(zhuǎn)基因幼胚用該培養(yǎng)基培養(yǎng)，從培養(yǎng)的幼胚愈傷組織再生苗中選擇抗選擇劑植株。
種子處理篩選為將收獲的轉(zhuǎn)基因大豆種子無(wú)菌接在具有選擇劑的培養(yǎng)基上使其萌發(fā)根系發(fā)育正常者為抗性陽(yáng)性苗；用選擇劑浸泡后，播于營(yíng)養(yǎng)缽、珍珠巖或者河沙內(nèi)，根系正常生長(zhǎng)株為抗選擇劑單株，將抗選擇劑單株轉(zhuǎn)于田間或者大盆栽培繼續(xù)做分子生物學(xué)鑒定和農(nóng)藝性狀鑒定。
選擇劑根據(jù)載體上所具有的選擇標(biāo)記基因而定，如Bar基因選用Basta除草劑，Npt II基因選用卡那霉素；Basta、卡那霉素，選擇濃度為50-1000PPM，處理時(shí)間組織培養(yǎng)為培養(yǎng)期間，種子浸泡為6-12小時(shí)。
種子處理篩選為將收獲的轉(zhuǎn)基因大豆種子，播于盤(pán)中或者田間，在幼苗期，取葉片提取DNA做PCR分析，陽(yáng)性者用于繼續(xù)鑒定和培養(yǎng)。
對(duì)改良目標(biāo)品種導(dǎo)入含目標(biāo)性狀的共體DNA，從導(dǎo)入后代中選擇目標(biāo)變異或轉(zhuǎn)化株，通過(guò)農(nóng)藝性狀鑒定篩選，株系品系培育，獲得含目標(biāo)性狀的優(yōu)良種質(zhì)、品系或品種，實(shí)現(xiàn)種質(zhì)創(chuàng)新和改良。
下面詳細(xì)敘述本發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明可分為兩部份一是外源DNA(基因)轉(zhuǎn)化的花粉管通道技術(shù)；二是應(yīng)用于大豆種質(zhì)創(chuàng)新與品種改良的方法與結(jié)果。
第一部分包括幾個(gè)步驟①外源DNA的提取純化；②受體大豆的種植，培育至開(kāi)花；③轉(zhuǎn)化操作；④培育大豆至結(jié)實(shí)，并收獲；⑤于田間或?qū)嶒?yàn)室種植種子，進(jìn)行篩選和分子檢測(cè)。
分解描述如下1.外源DNA(基因)的提取與純化此步操作方法參照發(fā)表過(guò)的書(shū)刊雜志介紹的方法進(jìn)行。外源DNA供體包括任何來(lái)源的動(dòng)植物以及微生物，包括提取總DNA和通過(guò)從細(xì)菌克隆的重組DNA。
2.受體大豆材料的種植，在適合其正常生長(zhǎng)開(kāi)花的環(huán)境下種植，培育至開(kāi)花。受體大豆可是以任何品種和品系。
3.實(shí)施導(dǎo)入。其細(xì)則如下①選擇當(dāng)日開(kāi)的花，生理時(shí)間為其自花受粉后6～14小時(shí)，(每節(jié)選2-3朵其余去除)；②去除翼瓣、龍骨瓣，留中央旗瓣，露出柱頭，用眼科小剪從雌蕊靠近子房處剪去柱頭；③在切口處滴15～20ulDNA導(dǎo)入液。導(dǎo)入液可用0.1×SSC、TE、或ddH2O配制，濃度為25-150ug/ml(質(zhì)粒DNA)、50～300ug/ml(供體總DNA)。
4.在胚成熟至種子成熟的任何時(shí)期取下籽粒進(jìn)行如下任何方式的鑒定篩選1)取下幼胚，進(jìn)行幼胚組織培養(yǎng)，培養(yǎng)期間進(jìn)行抗生素等選擇標(biāo)記篩選；2)待種子成熟后，取出籽粒，用選擇劑處理篩選，可以有幾種方法a.用高濃度選擇劑浸泡種子，然后將種子播于營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，正常生長(zhǎng)者移栽于田間或大盆中栽培；濃度范圍需根據(jù)基因載體中篩選標(biāo)記種類(lèi)及受體材料的不同事先做臨界濃度的確定試驗(yàn)，如對(duì)NPT II基因卡那霉素的濃度可在500-1000PPM，處理時(shí)間可在6-12小時(shí)。
b.用高濃度(濃度選擇及處理方法與上述a相同)選擇劑浸泡種子，然后播于珍珠巖或河沙中萌發(fā)后觀查根系發(fā)育情況，正常者為初選轉(zhuǎn)化株；c.用低濃度(卡那霉素的濃度可在50-200PPM)的選擇劑配制培養(yǎng)基，將種子無(wú)菌接在培養(yǎng)基上，抗選擇劑正常生長(zhǎng)者為初選轉(zhuǎn)基因株。
3)將種子播于盆中或田間，幼苗期，取葉片提取DNA做PCR分析，陽(yáng)性者留下培育成苗獲得后代，陰性者淘汰。
4)將種子種于盆中或田間，用選擇劑處理幼苗，抗性者為初選轉(zhuǎn)基因植株。
5)將種子種于盆中或田間，觀查農(nóng)藝目標(biāo)性狀選擇變異株。
第二部分，利用花粉管通道技術(shù)向大豆導(dǎo)入外源總DNA和重組DNA進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良。
1.選擇生產(chǎn)上正在推廣的或正欲推廣的高世代優(yōu)良品系，作為改良對(duì)象；2.針對(duì)改良對(duì)象尚存的缺欠選擇具相應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)的品種間、種間、屬間、科間、以至更遠(yuǎn)緣材料為供體，提取總DNA或經(jīng)人工重組的基因載體DNA，配成導(dǎo)入液。
3.將受體材料種植于田間或其它可使大豆植株正常生長(zhǎng)的環(huán)境，培育至開(kāi)花后，進(jìn)行各種組合的導(dǎo)入操作。
4.收獲操作種子，種植，根據(jù)期望目標(biāo)，選擇變異后代。
5.對(duì)變異后代進(jìn)行常規(guī)育種程序的鑒定、株系培育、品系培育、生產(chǎn)試驗(yàn)，最后成為可利用資源或成為品種，可以按下面方式進(jìn)行不同世代的處理。
D1、D2代選擇變異→D2、D3代抗逆性鑒定兼豐產(chǎn)株系篩選→D3、D4抗逆高產(chǎn)品比試驗(yàn)→D5進(jìn)入?yún)^(qū)域生產(chǎn)試驗(yàn)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下
1.轉(zhuǎn)化率高。迄今為止現(xiàn)有用于大豆的轉(zhuǎn)化技術(shù)主要是農(nóng)桿菌技術(shù)和基因槍技術(shù)，這兩個(gè)技術(shù)都依賴于大豆組織培養(yǎng)再生技術(shù)，而大豆組織培養(yǎng)技術(shù)還未達(dá)到十分成熟完善程度，也存在很大的基因型差異(即依賴性)。雖有一些轉(zhuǎn)化成功的報(bào)道消息，但轉(zhuǎn)化頻率不高，而且僅限于少數(shù)品種?；驑屧O(shè)備價(jià)值昂貴，轟擊一槍的成本也在30.00元(人民幣)以上。而本發(fā)明不需組織培養(yǎng)再生過(guò)程，基因型依賴性很小，轉(zhuǎn)化率在3％左右，有時(shí)可達(dá)10％，當(dāng)年操作，當(dāng)年獲得種子，第二年即可有大量T2群體供遺傳篩選分析。
2.易于操作，適用性好。由于不必在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作，因此常規(guī)育種家也可進(jìn)行。只要有外源DNA(基因)分子(可以通過(guò)自己提取或從其它來(lái)源索取)即可自己在田間進(jìn)行，勿需生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)人員，適用于各種生態(tài)區(qū)域和各級(jí)大豆育種單位育種人員，可以廣泛利用。
3.本技術(shù)可通過(guò)導(dǎo)入各種來(lái)源的DNA分子，因此可擴(kuò)大生物基因資源的利用率和范圍，創(chuàng)造種質(zhì)，培育品系，周期短，常規(guī)方法要獲得穩(wěn)定的品系需5-6代甚至更多，本技術(shù)2-3年即可得到純系，提高了育種效率。
下面敘述
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1Bar基因載體為質(zhì)粒PDM 803，按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》所示提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)電泳和分光光度計(jì)分析測(cè)定質(zhì)量純度OD260/OD230≥2.0，OD260/OD280≥1.8，用TE緩沖液配成100ug/ml濃度導(dǎo)入液，冷凍保存。將品系D9202-1種于田間。當(dāng)開(kāi)花盛期，于下午1500以后，選新開(kāi)的花，去除龍骨瓣、翼辨，留旗瓣，用眼科小剪剪下柱頭，用微量移液管或注射器，將DNA液滴在子房斷面上，每花20ul，共做150朵花。收獲100多個(gè)莢，200多粒種子。于當(dāng)年秋冬取100粒播于直徑10cm的營(yíng)養(yǎng)缽中，每缽一粒。待幼苗真葉展開(kāi)后，用除草劑Basta(4.5ppm)溶液200ul滴在真葉上(為使溶液不流失，在葉片上釘0.8～1cm兩層濾紙)，5天后觀查傷害情況，敏感者出現(xiàn)黃斑，逐漸擴(kuò)大，最后枯萎落掉，抗者不出現(xiàn)黃斑。從此100株中選得10株不同抗性表現(xiàn)的幼苗，按抗性程度依次移栽于田間。在成苗期再以90ppm的除草劑溶液噴施，觀查，獲得抗性植株。再將抗株于第二年種成株行于苗期用涂抹葉片的方法再次進(jìn)行除草劑抗性鑒定篩選，淘汰不抗者留抗者。第三年于田間種株行，用超出市售除草劑說(shuō)明書(shū)最高劑量的0.5、1.5、3倍的濃度噴施，結(jié)果不抗的株行植株枯死，而抗株未死。從而選出抗除草劑大豆6個(gè)株系，其中2個(gè)株系最為突出，以Bar基因兩端序列為引物經(jīng)PCR分析，呈陽(yáng)性，對(duì)其作Gus染色分析也表現(xiàn)陽(yáng)性。
實(shí)施例2質(zhì)粒pSKRSSGNAI含雪花蓮?fù)庠茨谿NA基因。按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)電泳和紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)量和純度O.D260/O.D230≥2，O.D260/O.D280≥1.8，用重蒸水配成100ug/ml導(dǎo)入液，按實(shí)施例1方法，轉(zhuǎn)化品種吉20和吉30。取一部分操作種子先種于田間，待3片復(fù)葉時(shí)，每株接2-3齡蚜蟲(chóng)10頭，扣上網(wǎng)罩，任其繁殖，從中選擇抗蚜植株。一個(gè)月后抗蚜株莖桿葉片較干凈，植株生長(zhǎng)較正常，危害癥狀輕，而感蚜株葉片皺縮枯萎，植株矮小，受害嚴(yán)重。收獲抗株種子，于下年種株行，與對(duì)照受體同時(shí)接蚜鑒定，抗株抑制蚜口數(shù)達(dá)30～80％，表現(xiàn)出GNA基因?qū)ρ料x(chóng)的抑制作用。PCR分析呈陽(yáng)性。另一部分種子，當(dāng)年種于室內(nèi)盆栽，取葉片先做大量PCR鑒定，選出陽(yáng)性者。再對(duì)陽(yáng)性后代進(jìn)行抗蚜性鑒定，也表現(xiàn)出抗性，最好的抑制蚜口數(shù)也達(dá)80％，PCR呈陽(yáng)性。Southern blot與western blot分析得到驗(yàn)證?？偟霓D(zhuǎn)化頻率為1-3％。
實(shí)施例3以皂角樹(shù)為DNA供體，按有關(guān)書(shū)籍資料介紹的方法取皂角葉片和種子胚芽提取DNA，用0.1×SSC緩沖液配成100-300ug/ml濃度的導(dǎo)入液。以吉林25、吉林27、吉林20品種為受體，按照實(shí)施例2所述時(shí)間方法導(dǎo)入，秋后收取種子。于下年播種田間，從中選出變異株。變異表現(xiàn)為植株莖桿強(qiáng)度增加，生長(zhǎng)旺盛，株型收斂，莢皮和莢形有與皂角莢相似之處，粗糙，放寬。將變異株的后代種于田間，接蚜蟲(chóng)鑒定篩選，經(jīng)4年的連續(xù)篩選，從以吉25為受體的后代中選出一株系表現(xiàn)明顯抗蚜性。蚜蟲(chóng)繁殖率下降30％，危害指數(shù)與對(duì)照比下降33％；減產(chǎn)幅度，比對(duì)照少70％以上，對(duì)照減產(chǎn)47％，而抗性變異株系僅減產(chǎn)5％，培育成抗蚜品系。
實(shí)施例4以大豆吉27為受體，以農(nóng)家品種“國(guó)育100-4”為DNA供體，(國(guó)育100-4抗蚜蟲(chóng))，按實(shí)施例2的方法導(dǎo)入DNA及鑒定篩選，同樣也選出一品系NY-181，對(duì)蚜蟲(chóng)耐受性比對(duì)照有明顯的提高，危害指數(shù)NY-181為25，而對(duì)照為69.7，減產(chǎn)幅度NY-181為17％，而對(duì)照為28.8％。
實(shí)施例5以大豆吉20為受體，以鷹咀豌豆為DNA供體，按實(shí)施例2的方法導(dǎo)入DNA及鑒定篩選選出品系D2011，葉片增厚，變硬，柵欄細(xì)胞增多，排列緊密整齊，因此而耐蚜。同時(shí)其莖桿韌性彈性增強(qiáng)，抗倒耐密，籽粒蛋白質(zhì)含量提高4個(gè)百分點(diǎn)。通過(guò)增加密度栽培，公頃產(chǎn)量提高20％以上，已在生產(chǎn)示范。
權(quán)利要求
1.一種大豆花粉管通道轉(zhuǎn)基因方法，包括外源基因的提取純化，選擇受體大豆并種植至開(kāi)花，對(duì)花器官進(jìn)行處理，注入DNA導(dǎo)入液，對(duì)種子及后代進(jìn)行鑒定篩選；其特征在于選擇受體大豆當(dāng)日開(kāi)的花，去除翼瓣、龍骨瓣，留中央旗瓣，露出柱頭，用眼科小剪從雌蕊靠近子房處剪去柱頭；在切口處滴15～20ulDNA導(dǎo)入液，在幼胚至種子成熟時(shí)，或取幼胚進(jìn)行組織培養(yǎng)篩選或取成熟種子對(duì)其進(jìn)行種子處理篩選，得到轉(zhuǎn)基因大豆。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于DNA導(dǎo)入液以0.1×SSC、TE、或ddH2O溶解外源DNA，濃度為25-150ug/ml質(zhì)粒DNA，100-500ug供體基因組總DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于外源基因?yàn)榇蠖够蛘叻谴蠖够颉?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于外源基因?yàn)楦鞣N抗性、品質(zhì)及其它有益性狀基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于受體為大豆品種、品系或者中間材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于受體大豆當(dāng)日開(kāi)花的生理時(shí)間為其自花受粉后6-14小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于幼胚組織培養(yǎng)篩選是將選擇劑配制到培養(yǎng)基中，將轉(zhuǎn)基因幼胚用該培養(yǎng)基培養(yǎng)，從培養(yǎng)的幼胚愈傷組織再生苗中選擇抗選擇劑植株。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于種子處理篩選為將收獲的轉(zhuǎn)基因大豆種子無(wú)菌接在具有選擇劑的培養(yǎng)基上使其萌發(fā)根系發(fā)育正常者為抗性陽(yáng)性苗；或用選擇劑浸泡后，播于營(yíng)養(yǎng)缽、珍珠巖或者河沙內(nèi)，根系正常生長(zhǎng)株為抗選擇劑單株，將抗選擇劑單株轉(zhuǎn)于田間或者大盆栽培繼續(xù)做分子生物學(xué)鑒定和農(nóng)藝性狀鑒定。
9.根據(jù)權(quán)利要求7、8所述的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于選擇劑根據(jù)載體上所具有的選擇標(biāo)記基因而定，如Bar基因選用Basta除草劑，Npt II基因選用卡那霉素；Basta、卡那霉素，選擇濃度為50-1000PPM，處理時(shí)間組織培養(yǎng)為培養(yǎng)期間，種子浸泡為6-12小時(shí)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于種子處理篩選為將收獲的轉(zhuǎn)基因大豆種子，播于盤(pán)中或者田間，在幼苗期，取葉片提取DNA做PCR分析，陽(yáng)性者用于繼續(xù)鑒定和培養(yǎng)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于對(duì)改良目標(biāo)品種導(dǎo)入含目標(biāo)性狀的共體DNA，從導(dǎo)入后代中選擇目標(biāo)變異或轉(zhuǎn)化株，通過(guò)農(nóng)藝性狀鑒定篩選，株系品系培育，獲得含目標(biāo)性狀的優(yōu)良種質(zhì)、品系或品種，實(shí)現(xiàn)種質(zhì)創(chuàng)新和改良。
全文摘要
一種大豆花粉管通道轉(zhuǎn)基因方法,包括外源基因的提純,選擇受體大豆并種植至開(kāi)花;選擇當(dāng)日開(kāi)的花,在授粉后合適的生理時(shí)間,用眼科小剪從雌蕊靠近子房處剪去柱頭;在切口處滴15～20u1DNA導(dǎo)入液,在幼胚至種子成熟時(shí),取幼胚進(jìn)行組織培養(yǎng)水平篩選或者對(duì)種子及幼苗處理和田間篩選,得到轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)而進(jìn)行品種培育。本發(fā)明導(dǎo)入外源DNA分子,擴(kuò)大基因資源的利用率和范圍,創(chuàng)造種質(zhì),培育品系;有周期短,轉(zhuǎn)化率高等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1251862SQ9912370
公開(kāi)日2000年5月3日 申請(qǐng)日期1999年11月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月16日
發(fā)明者劉德璞, 袁鷹, 周正平, 王成武, 鄭培和, 王丙旭, 王興智, 唐克軒 申請(qǐng)人:吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院