專利名稱：具有改變的蛇菊糖苷組成的蛇菊的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提高蛇菊中所需的蛇菊糖苷的方法。具體地說，本發(fā)明涉及提高蛇菊葉子中新蛇菊苷A的方法。
世界范圍內(nèi)對高強度甜味劑的需求正在逐漸提高，通常是將不同的甜味劑進行混合，對替代品的需求也越來越迫切。巴拉圭甜草，甜葉菊(Stevia rebaudiana Bertoni)，產(chǎn)生一種可替代的甜味劑，其優(yōu)點是蛇菊甜味劑為天然的植物產(chǎn)品。此外，這種甜的蛇菊糖苷與許多其他的高強度甜味劑相比具有功能和感官性能。
甜葉菊是甜葉菊屬的154個成員之一，并且是僅兩個產(chǎn)生甜的蛇菊糖苷的成員之一。在日本以及一些其他國家曾試圖將甜葉菊培養(yǎng)成一種作物，但還未曾將其進行大規(guī)模的機械化生產(chǎn)，在世界上的許多國家甜葉菊甜味劑還沒有應用于主流食品。
甜葉菊是菊科的一個典型的成員。它是一種小型的多年生灌木，可生長至65厘米高，并且是自交不親和的。用8個親本進行完全雙列雜交的結(jié)果顯示自交的量為0和0．5％之間，而遠交為0．7至68．7％，表明一些形式的自交不親和系統(tǒng)在起作用(Katayama等1976)。甜葉菊是二倍體，具有11對染色體，這是這一屬中的許多南美成員的特征。
甜葉菊的甜雙萜糖苷已被表征，并鑒定出了8種甜的蛇菊的糖苷。這些糖苷在甜葉菊的葉子中積累，并占葉子干重的10至20％。以干重計，在甜葉菊的葉子中存在的四種主要的糖苷的典型的比例為0．3％半乳糖醇糖苷(dulcoside)，0．6％新蛇菊苷C，3．8％新蛇菊苷A和9．1％蛇菊苷。在甜葉菊中鑒定出的糖苷包括新蛇菊苷B，C，和E，和半乳糖醇糖苷A和B。新蛇菊苷B可能是在抽提過程中從新蛇菊苷A形成的假象，因為發(fā)現(xiàn)通過堿性裂解，新蛇菊苷A和新蛇菊苷D均可轉(zhuǎn)化成新蛇菊苷B。
在甜葉菊葉子中存在的這四種主要的雙萜糖苷甜味劑中，僅有兩種，蛇菊苷和新蛇菊苷A，其物理和感官性能得到表征。對蛇菊苷和新蛇菊苷A在碳酸飲料中的穩(wěn)定性進行了測試，發(fā)現(xiàn)其對熱和pH具有穩(wěn)定性(Chang和Cook，1983)。蛇菊苷的甜度比蔗糖高110至270倍。新蛇菊苷A的甜度比蔗糖高150至320倍，新蛇菊苷C的甜度比蔗糖高40至60倍。半乳糖醇糖苷A的甜度比蔗糖高30倍。新蛇菊苷A具有最小的澀味，最小的苦味，在品嘗后具有最小的后味，并被認為在這四種主要的蛇菊糖苷中具有最好的感官品質(zhì)(Phillips，1989和Tanaka，1997)。Dubois和Stephanson(1984)也證實了新蛇菊苷A比蛇菊苷具有較小的苦味，并且證明蛇菊苷和新蛇菊苷的苦味是這些化合物的固有屬性，并不一定是全植物提取物中的雜質(zhì)造成的。蛇菊苷和新蛇菊苷A的苦味隨著濃度的提高而提高。蛇菊苷和新蛇菊苷A當與其他的高強度甜味劑例如天冬甜素混合時具有協(xié)同效應，是包括在混合物中的優(yōu)良的候選者(Schiffman等1995)。
Haga等(JP 51-131900；1976)公開了使用溶劑從甜葉菊中提取糖苷化合物的方法，Ogawa(JP 55-111768；1980)公開了涉及使用溶劑加上一種脫色劑的方法，Itagaki和Ito(JP 54-041898；1979)公開了吸附色譜方法，Uneshi等(JP 54-030199；1977)公開了離子交換方法，Matsushita和Kitahara (JP 56-121454；1981)公開了各種糖苷的選擇沉淀方法，Tan和Ueki(JP 06-007108；1994)公開了基于超濾的方法。典型的抽提方法涉及水或溶劑抽提，然后離子交換，用濾器進行沉淀或凝聚，然后結(jié)晶并干燥(Phillips1989)。
在甜葉菊中的植物育種主要集中在改善葉子產(chǎn)量和新蛇菊苷A在葉子中的濃度。對栽培進行的描述表明，存在足夠的變異使葉子產(chǎn)量得到顯著提高，新蛇菊苷A的含量以及新蛇菊苷A與蛇菊苷的比率也得到提高(Brandle和Rosa 1992；Lee等1982；Shizhen 1995；Morita T JP 6-96025，1987)。據(jù)Nakamura和Tamura(1985)報道，半乳糖醇糖苷A和蛇菊苷和新蛇菊苷A，和C的水平相互之間成正相關(guān)，而蛇菊苷和新蛇菊苷A，以及半乳糖醇糖苷和新蛇菊苷C相互之間成負相關(guān)。在中國的一些品系中的甜的糖苷的濃度高達20．5％，并且據(jù)報道另外一些栽培品系中新蛇菊苷A與蛇菊苷的比率為9∶1(Shizhen，1995；Morita，1987)。但是，目前還沒有含有經(jīng)濟意義的總蛇菊糖苷水平(即高于約14％)并具有高新蛇菊苷A對蛇菊苷的比率(即高于約9．1∶1)的植物的報道。這種原料允許使用常規(guī)的抽提方法，不需要各個糖苷的重新結(jié)晶，可以制備出甜葉菊甜味劑，新蛇菊苷A高于85％。
現(xiàn)有的甜葉菊繁殖方法需要含有所需水平和比率的甜味劑的植物的無性繁殖。培育出了一種具有新蛇菊苷A與蛇菊苷的比率為0．96∶1(初始材料中的比率為0．36∶1)，總糖苷為22．4％的栽培種。但是，這些植物，除了具有很低的新蛇菊苷A與蛇菊苷的比率外，為自交不親和的，只能從其枝條進行無性繁殖(Lee等1982)。已培育出了其他的一些植物，其中新蛇菊苷A與蛇菊苷的比率高達9．1∶1，但總蛇菊糖苷為10．1％(Morita T，JP6-96025，1987)。也是由于自交不親和性，該栽培種也不能使用基于種子的繁殖系統(tǒng)進行繁殖。與無性繁殖相關(guān)的費用限制了甜葉菊植物的大規(guī)模生產(chǎn)，特別是在氣候溫和的北美洲，只能進行按年度的繁殖。
因而，需要培育出一種甜葉菊栽培種，它們富含新蛇菊苷A，高的總蛇菊糖苷含量并且能夠使用廉價的基于種子的方法進行繁殖。
本發(fā)明涉及一種提高甜葉菊中所需的蛇菊糖苷的比率的方法，以及含有高的糖苷水平的植物。更具體地說，本發(fā)明涉及提高甜葉菊葉子中新蛇菊苷A的水平的方法。
本發(fā)明提供了一種從甜葉菊植物制備具有高水平的總蛇菊糖苷和富含新蛇菊苷A的干甜葉菊葉子的方法，該甜葉菊植物是從甜葉菊種子生長的移植物。本文中公開的發(fā)明包括一種具有高的總糖苷水平和高的新蛇菊苷A比率的甜葉菊栽培種。這種栽培種與現(xiàn)有的landrace或可通過商業(yè)途徑獲得的植物材料相比具有較高的總蛇菊糖苷和高的新蛇菊苷A。優(yōu)選該栽培種種子是從至少兩種相互交配的基因型產(chǎn)生的。干燥的葉子是通過從種子生長植物，收獲植物并從葉子中抽提甜味素進行制備的。
本發(fā)明提供了一種甜葉菊植物，其特征在于，總蛇菊糖苷的水平至少為14％，并且新蛇菊苷A蛇菊苷的比率至少為約9．1∶1。而且，本發(fā)明涉及一種甜葉菊植物，其中，所說的總蛇菊糖苷為約14．4至18．8％，并且新蛇菊苷A蛇菊苷為約9．3∶1至約11．0∶1。本發(fā)明也涉及一種從上述的甜葉菊植物得到的種子。
本發(fā)明也涉及一種用于生產(chǎn)甜葉菊植物的方法(A)，其特征在于，總蛇菊糖苷的水平至少為約14％，并且新蛇菊苷A蛇菊苷的比率為至少約9．1∶1，該方法包括ⅰ)選擇至少兩個相互交配的甜葉菊基因型，其中每一個的特征為新蛇菊苷A蛇菊苷的比率為至少約9．1∶1，以及總蛇菊糖苷水平為至少約14％；ⅱ)使所說的至少兩個相互交配的基因型進行異花授粉，產(chǎn)生種子；ⅲ)收集所說的種子；和ⅳ)生長所說的甜葉菊植物。
本發(fā)明也包括上述的方法(A)，其中，所說的至少兩種相互交配的基因型中的每一個的特征為，總蛇菊糖苷的水平為約14．4至約18．8％，或者其中，所說的至少兩個相互交配的基因型中的每一個的特征為新蛇菊苷A蛇菊苷的比率為約9．3∶1至約11．0∶1，或者其中，所說的至少兩種相互交配的基因型中的每一個的特征為，總蛇菊糖苷的水平為約14．4至約18．8％，并且新蛇菊苷A蛇菊苷的比率為約9．3∶1至約15∶1。
本發(fā)明也涉及一種由上述的方法(A)生產(chǎn)的植物。
而且，本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)天然甜味劑的方法(B)，這種甜味劑的特征為其甜度比蔗糖高約150倍至約320倍，該方法包括從本發(fā)明的甜葉菊植物的葉子中提取所說的天然甜味劑。本發(fā)明包括如上所述的方法(B)，其中，甜味劑是新蛇菊苷A，并且其中所述的提取步驟涉及溶劑提取，離子交換，沉淀，凝聚，結(jié)晶，過濾，毫微過濾，超臨界液體提取，超過濾，或者它們的組合。
本發(fā)明也涉及在ATCC保藏的第一種子，保藏號為203340，保藏日為1998年10月9日，或者從這種第一種子產(chǎn)生的甜葉菊植物。而且，本發(fā)明涉及來源于甜葉菊植物的第二種子，所說的甜葉菊植物是從1998年10月9日保藏在ATCC，保藏號為203340的第一種子產(chǎn)生的。本發(fā)明也包括從上述的第二種子得到的甜葉菊植物。
本發(fā)明涉及提高蛇菊中所需的蛇菊糖苷的方法。具體地說，本發(fā)明涉及提高蛇菊葉子中新蛇菊苷的方法。
本發(fā)明公開了甜葉菊的合成栽培種的成分的培育，這種甜葉菊的特征在于具有經(jīng)濟意義水平的糖苷以及高的新蛇菊苷A對蛇菊苷的比率。本發(fā)明也公開了將這些成分裝配成合成的栽培種。結(jié)果，本發(fā)明使得Stebia葉子可低成本地生產(chǎn)，并用作具有高水平的新蛇菊苷A的高強度甜味劑的原料。
蛇菊糖苷是來源于中間產(chǎn)物香葉基香葉基焦磷酸酯(GGPP)的雙萜類天然產(chǎn)物，最終產(chǎn)生雙萜。從GGPP產(chǎn)生蛇菊糖苷的最初步驟與赤霉素生物合成的步驟相同。因而，GGPP通過CPP合成酶被轉(zhuǎn)化成ent-copalylpyrophosphate(CPP)，并且通過ent-貝殼杉烯合成酶從CPP產(chǎn)生ent-貝殼杉烯。然后這一產(chǎn)物在C-19位被氧化成ent-貝殼杉烯酸被認為是通過一個或多個P450單加氧酶的作用發(fā)生的。在這一點，蛇菊糖苷途徑和赤霉素途徑分開。通過ent-貝殼杉烯酸在C-13位的進一步的羥基化作用產(chǎn)生蛇菊苷的非糖部分。
蛇菊苷的非糖部分的兩個氧化了的功能團，C-19羧酸酯和C-13醇，提供了糖側(cè)鏈的連接位點，這決定迄今為止已經(jīng)鑒定的8個不同的糖苷的身份。這些聚糖側(cè)鏈主要由葡萄糖殘基組成，但也可含有鼠李糖(


圖1)。
以干重為基礎(chǔ)，在甜葉菊的葉子中存在的四種主要的糖苷在一般情況下的組成為0．3％半乳糖醇糖苷，0．6％新蛇菊苷C，3．8％新蛇菊苷A和9．1％蛇菊苷。這些和其它的雙萜和雙萜葡糖苷的結(jié)構(gòu)示于
圖1。已經(jīng)使用了很多的分析技術(shù)來評估在蛇菊中存在的甜的雙萜類糖苷的分布和水平。這些技術(shù)包括薄層層析(Metivier和Viana 1979)，過壓層析(Fullas等1989)，液滴反流層析(Kinghorn等1982)，和毛細電泳(Liu和Li1995)。也通過酶學方法(Mizukami等1982)和通過近紅外反射分光鏡法(Nishiyama等1992)確定了主要產(chǎn)生蛇菊苷的植物品系中的蛇菊苷的水平。但是，最常用的分析方法為高效液相色譜(Ahmed和Dobberstein 1982a，b)。雖然曾經(jīng)使用硅膠，羥基硅藻土，親水和尺寸排阻柱，最經(jīng)常使用氨基結(jié)合的柱來分析甜的葡糖苷。
“葉子產(chǎn)量”是指單位面子的栽培種產(chǎn)生的甜葉菊葉子的干重。
“總糖苷”是指以干重為基礎(chǔ)在甜葉菊葉子中產(chǎn)生的四種主要的蛇菊苷非糖部分(ent-13-羥基異貝殼杉-16-烯-19-酸)糖苷的量。經(jīng)濟意義的總蛇菊糖苷水平是指總蛇菊糖苷的水平至少為約14％(以干重為基礎(chǔ))。新蛇菊苷A與蛇菊苷的比率(新蛇菊苷A蛇菊苷)是指將特定的或栽培種的葉子中存在的新蛇菊苷A的重量百分比除以蛇菊苷的重量百分比得到的值。該值沒有單位，并在0至約11．0。術(shù)語“高比率”是指新蛇菊苷A與蛇菊苷的比率為至少約9．1∶1。
一種“合成的”或“合成的栽培種”是指通過在輪回選擇的循環(huán)中從育種群體得到的克隆或姊妹系進行雜交產(chǎn)生的甜葉菊栽培種。作為一種合成的栽培種，通常在合成的栽培種中具有多于一個的品系或克隆，這些品系或克隆通常被保存下來用于將來的合成栽培種的合成，并且這些品系或克隆通常被組合起來進行隨即雜交。這種合成的栽培種的目的是用于作物生產(chǎn)系統(tǒng)。
育種群體是指通過為了篩選出新型的基因型的目的而選擇出的親本的有性雜交產(chǎn)生的一組植物。
一種當?shù)卦耘喾N是一種僅在一定區(qū)域內(nèi)流行的品種，是由形態(tài)學或化學型組成的混合物，但其來源不清。
在現(xiàn)有技術(shù)中已知，與新蛇菊苷A含量低的本地甜葉菊或當?shù)卦耘喾N相比，需要產(chǎn)生富含新蛇菊苷A的甜葉菊葉子的植物。但是，這種植物在過去不能進行種子繁殖。本發(fā)明解決了在富含新蛇菊苷A的栽培種中總的糖苷濃度低的問題，并提供了一種從種子中生產(chǎn)具有高的總糖苷和富含新蛇菊苷A的葉子的方法。本文中公開的本發(fā)明涉及從一種可從合成的甜葉菊栽培種并基于種子的移植物生產(chǎn)植物的方法，這種植物具有經(jīng)濟意義的總糖苷水平，并具有高的新蛇菊苷A與蛇菊苷的比率。
為了得到用于合成栽培種的親本，在一些單植株和大量的植于野外的子代中進行雜交，并在這些子代中進行選擇。使用HPLC對從這些選擇的植株得到的葉子樣品分析糖苷濃度和組成，并選擇出高的糖苷濃度和新蛇菊苷A與蛇菊苷的比例超過9．1∶1，并且至少超過約9．3∶1的植株。將選擇出的植株在冬天在溫室中進行雜交并從母本收獲種子。同時，從這些植物做出一些插條，使它們在需要時可被用于繁殖該合成的栽培種。
將來自母本植物的種子作為半同胞家系保留，并將一部分大量繁殖(bulked)。將半同胞家系，大量繁殖的樣品和母本克隆在一個重復的野外種植中進行評估。
這樣得到的植株的特征為顯示高水平的總蛇菊糖苷，并且富含新蛇菊苷A。優(yōu)選這些栽培種種子是從至少兩個相互雜交的基因型產(chǎn)生的。每個母本具有的新蛇菊苷A蛇菊苷的比率至少為9．1∶1。具體地說，該比率可在約9．1∶1至約11．0∶1的范圍內(nèi)。而且，每個母本顯示出的總蛇聚糖苷為至少約14％。更具體地說，總蛇菊糖苷水平可以在約14．4至約18．8％的范圍內(nèi)。該栽培種的種子的生產(chǎn)是使用現(xiàn)有技術(shù)中標準的技術(shù)進行的。干燥葉子的生產(chǎn)是通過從種子生長植物進行的，然后收獲植物并從葉子中抽提甜味劑。
下文將通過實施例進一步描述本發(fā)明。但是，這些實施例只是為了說明的目的，不以任何方式限定本發(fā)明的范圍。
通常使用一種具有一種丙胺結(jié)合相的Waters公司生產(chǎn)的碳水化合物柱來大量分析S．rebaudiana葉子中的雙萜類糖苷。
所有的分析是在一種Hewlett-Packard 1090液相層析儀上進行的，它裝備了一種三通道溶劑投送系統(tǒng)和自動取樣器和一種與chem工作站相對的二極管陣列檢測器(205nm)。四種主要的蛇菊糖苷是使用一種250×4．6mm內(nèi)徑Waters公司的碳水化合物柱進行的，保護柱是一種碳水化合物防衛(wèi)柱和梯度水-乙腈。流速為1．5mL／min并且溶劑為水(pH5．25)，乙腈和乙腈。保留時間對于半乳糖醇糖苷為14．5分鐘，對于蛇菊苷為18．8分鐘，對于新蛇菊苷C為20．4分鐘，對于新蛇菊苷A為23．5分鐘(參見圖2)。樣品中的蛇菊糖苷通過它們的保留時間進行識別，通過外部標準方法計算它們的濃度并以干重為基礎(chǔ)表示。
篩查的結(jié)果為，選出的四個植株顯示出高的新蛇菊苷A與蛇菊苷的比率，至少為9．1∶1，并且含有的總蛇菊糖苷的水平至少為約14％。這些植株用表1中的A至D表示。表1中也顯示出了植株A-D，13個半同胞家系和一個當?shù)卦耘喾N(巴西)的糖苷組成的比較。巴西品種顯示出適度水平的總糖苷，但是，新蛇菊苷A蛇菊苷的比率低。同樣，在半同胞家系中檢測到了高水平的總糖苷，但是新蛇菊苷A蛇菊苷的比率低。但是，甜葉菊植株A-D中的每一個顯示出經(jīng)濟意義的總糖苷水平，以及新蛇菊苷A與蛇菊苷的高比率。表1在來自巴西的當?shù)卦耘喾N，13個半同胞家系，和四個選擇出的構(gòu)成AC Blackbird的品種(A，B，C和D)中四種主要的糖苷的濃度，總糖苷濃度，和新蛇菊苷A與蛇菊苷的比率和它們的標準誤差(括號) 1巴西表示一種來自南部巴西的當?shù)卦耘喾N，該值是50個觀察值的平均值2家系表示在13個半同胞家系中的所有的選擇，該值是255個觀察值的平均值選擇出的克隆的有性雜交，產(chǎn)生AC Blackbird
在秋季從大田中分離出植株A，B，C和D(表1)，移栽到20cm花盆中，將存在的營養(yǎng)生長修剪至花冠。將這些植株放置在一個溫室中的升高的溫床上，置于一個1．3米×l米的昆蟲罩中，罩上10毫米網(wǎng)罩，并在12小時日照氣溫21℃進行重新生長。在第一個花開放之后在昆蟲罩中立即放入一群峰，使蜂在這些花上進行采蜜，進行雜交。在三周之后從這些植物收獲種子，并在此后的8周規(guī)律地進行收獲。將收獲的種子集中在一起，命名為AC Blackbird。并將這些種子在ATCC進行了保藏，保藏號為203340，保藏日為1998年10月9日。用于移植的秧苗的生產(chǎn)來自四種選擇的植物的種子以及這些種子的集合物每次一個種子種植在288孔填料盤(plug tray)中，填料深度為4．4cm。兩周之后從每個母本克隆剪取枝條，將剪取的莖尖枝條種植于填料盤孔中，在固定的時間間隔澆水，直至長根。用無土花盆混合物填充這些盤，在種子盤的情況下，每日澆水多達三次，直至種子萌發(fā)，小苗長出。在發(fā)芽和剪枝之后，將盤每天澆水兩次并且每十天用20-20-20施肥一次，直至可用于野外種植。合成的栽培種性能的評估設(shè)計一個試驗，用于比較合成栽培種AC Blackbird與四個半同胞家系和克隆繁殖的原始選擇的拷貝的糖苷組成。該實驗使用了一個隨機化完整區(qū)組設(shè)計，并具有11個處理。每個地塊包括8個植株。在每個春季在200填料盤中種植小苗和移植物。在約7周之后開始試驗并在發(fā)芽后的5個月時收集葉子用于HPLC分析。生產(chǎn)條件與前文描述的用于母本克隆選擇的相同。糖苷分析方法與前文描述的用于母本克隆的方法相同。在所有的克隆繁殖的母本中，在4個半同胞的3個中和合成的栽培種AC Blackbird中觀察到了至少約14％的總蛇菊糖苷水平。在四個克隆繁殖的母本中的三個中，三個半同胞的兩個中和在AC Blackbird中觀察到新蛇菊苷A與蛇菊苷的比率至少為約9．1∶1。表2在來自巴西的當?shù)卦耘喾N(一種適應于當?shù)氐倪x擇種(SR5))，克隆A，B，C和D，從這些克隆雜交產(chǎn)生的半同胞家系(HS-A，B，C，D)，和一個集合合成種(AC Blackbird)中，對從生長于Delhi Research Station的試驗中取樣的葉子測得的四種主要的蛇菊糖苷的濃度(w／w％)，總糖苷濃度，和新蛇菊苷A與蛇菊苷的比率 本文已參照實施方案對本發(fā)明進行了描述。但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以發(fā)現(xiàn)，可以進行一些變化而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。
參考文獻Ahmed，M．S．和Dobberstein，R．H．1982a。蛇菊．Ⅱ．蛇菊苷，新蛇菊苷A和新蛇菊苷C的高效液相色譜分離和定量．J．Chromatogr．236523-526．Ahmed，M．S．和Dobberstein，R．H． 1982b．蛇菊．Ⅲ．新蛇菊苷B，D，和E，半乳糖醇糖苷A，和蛇菊生物苷的高效液先色譜分離和定量J．Chromatogr．245373-376．Brandle，J．E和Rosa，N．1992．從蛇菊的一種當?shù)卦耘喾N評估的產(chǎn)量，葉子莖比率，和蛇菊苷含量的遺傳性．Can．J．Plant Sci．721263-1266。Chang，S．S．和Cook，J．M．1983．在碳酸飲料中蛇菊苷和新蛇菊苷A的穩(wěn)定性研究．J．Agric．Food Chem．31409-412．DuBois，G．E．和Stephenson，R．A．1984．二萜甜味劑．具有改善的感官性能的蛇菊苷類似物的合成和感官評估J．Med．Chem 2893-98．FulIas FKim JCompadre C．MKinghom A．D．1989使用過壓層色譜分離天然產(chǎn)物甜為劑J．Chrom．464213-219．Katayama OSumida，T，Hayashi，H．和Mitsuhashi H．1976．甜葉菊的實際應用以及研究和開發(fā)數(shù)據(jù)(Englishtranslation)．I．S．U．Company，Japan．747pp．Kinghom，A．DNanayakkara，N．P．DSoejarto，D．DMedon，P．J．和Kamath，S．1982．植物來源的潛在的甜為劑。I．Purification of Steviarebaudiana sweet constituents by droplet counter-current chromatography．J．Chromatogr．237478-483．Lee，J．IKang，K．HPark，H．W和Ham，Y．S．1982．新的高新蛇菊苷-Astevia variety“Suweonll”(English abstr．)．Res．Rep．ORD 24186-188．Liu，J．和Li，S．F．V．1995．通過毛細電泳和高效液相色譜對甜葉菊甜味劑的分離和確定．J．Liq．Chromatogr．181703-1719．Matsushita，K和Kitahara，T．1981通過結(jié)晶分離蛇菊苷和新蛇菊苷A(English abstr．)．Jap．Patent 56-121454．Mauri，PCatalano，GGardana，C．和Pietta，P．1996．通過毛細電泳分析甜葉菊糖苷．Electrophoresis 17367-371．Metivier，J．和Viana，A．M．1979．通過雙向薄層電泳確定來源于甜葉菊的葉子的毫克量的蛇菊糖苷J．Exp．Bot．30805-8 10．Mizukami，HShiiba，K．和Ohashi，H．1982．在蛇菊中酶法測定蛇菊苷．Phytochemistry 211927-1930．Nakamura，S．和Tamura，V．1985．甜葉菊中主要的糖苷的變化．Jap．J．Trop．Agric．29109-115．Nikolova-Damyanova，BBankova，V．和Popov，S．1994．通過常相高效液相色譜和薄層色譜在植物抽提物中對蛇菊苷和新蛇菊苷A的分離和定量一種比較．Phytochem．Anal．58 1-85．Nishiyama，PAlvarez，M．和Vieira，L．G．E．1992．通過近紅外反射色譜在蛇菊的葉子中對蛇菊苷進行定量分析，J．Sci．Food Agric．59277-281．Phillips，K．C．1989．甜葉菊開發(fā)新的甜味劑的步驟．Pages 1-43 in T．H．Grenby ed．Developments in sweeteners，Volume 3．Elsivier Applied Science，London．Scbiffman，S．SBooth，B．JCarr，B．TLosee，M．LSattely-Miller，EandGraham，B．G．1995．Investigation of synergism in binary mixtures ofsweeteners．Brain Res．Bull．38105-120．Shizhen，S．1995．對一種優(yōu)選的蛇菊的研究．Scientia Agricultura Sinica 2837-41．Sumida，T．1968．對一種從巴西引進的蛇菊Bertoni M．在日本作為新的甜味劑來源的報告．Misc．Pub．Hokkaido Natl．Exp．Sta．269-83．Tanaka，0．1987．天然甜味劑的味道的改善．Pure Appl．Chem 69675-683．
權(quán)利要求
1．一種甜葉菊植物，其特征在于，總蛇菊糖苷的水平至少為約14％，并且新蛇菊苷A蛇菊苷的比率至少為約9．1∶1。
2．按照權(quán)利要求1所述的甜葉菊植物，其中，所述的總蛇菊糖苷的水平為約14．4至約18．8％，并且新蛇菊苷A蛇菊苷的比率為約9．3∶1至約11．0∶1。
3．一種生產(chǎn)甜葉菊植物的方法，該植物的特征為總蛇菊糖苷的水平至少為約14％，并且新蛇菊苷A蛇菊苷的比率至少為約9．1∶1，包括ⅰ)選擇至少兩個相互交配的甜葉菊基因型，每個含有新蛇菊苷A蛇菊苷的比率至少為約9∶1∶1，并且總糖苷水平為至少約14％；ⅱ)使所說的至少兩個相互交配的基因型進行交叉授粉，產(chǎn)生一種種子；ⅲ)收獲所說的種子；ⅳ)生長所說的甜葉菊植物。
4．按照權(quán)利要求3所說的方法，其中，所說的至少兩個相互交配的基因型每個含有的總糖苷水平為約14．4至約18．8％。
5．按照權(quán)利要求3所說的方法，其中，所說的至少兩個相互交配的基因型每個含有新蛇菊苷A蛇菊苷的比率為約9．3∶1至約11．0∶1。
6．按照權(quán)利要求3所述的方法，其中，所說的至少兩個相互交配的基因型每個含有的總蛇菊糖苷的水平為約14．4至約18．8％，并且新蛇菊苷A蛇菊苷的比率為約9．3∶1至約11．0∶1。
7．一種由權(quán)利要求3所述的方法生產(chǎn)的植物。
8．一種由權(quán)利要求4所述的方法生產(chǎn)的植物。
9．一種由權(quán)利要求5所述的方法生產(chǎn)的植物。
10．一種由權(quán)利要求6所述的方法生產(chǎn)的植物。
11．一種生產(chǎn)天然甜味劑的方法，該甜味劑的特征為比蔗糖的甜度高約150至約320倍，包括從權(quán)利要求1的甜葉菊植物葉子中提取所說的天然的甜味劑。
12．按照權(quán)利要求11所述的方法，其中該甜味劑為新蛇菊苷A。
13．按照權(quán)利要求12所述的方法，其中，所說的提取步驟包括溶劑抽提，離子交換，沉淀，凝集，結(jié)晶，過濾，納米過濾，超臨界液體抽提，超過濾，或者它們的組合。
14．一種由權(quán)利要求1所述的甜葉菊得到的種子。
15．一種由權(quán)利要求2所述的甜葉菊得到的種子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種甜葉菊植物,其特征在于,它顯示出高的總糖苷水平,和高的新蛇菊苷A和蛇菊苷之間的比率。優(yōu)選總蛇菊糖苷的水平至少為約14%,或約14.4%至約18.8%,并且新蛇菊苷A:蛇菊苷的比率至少為約9.1∶1,或約9.3∶1至約11.0∶1。本發(fā)明也公開了一種生產(chǎn)甜葉菊植物的方法,該植物的特征為總蛇菊糖苷的水平至少為約14%,并且新蛇菊苷A:蛇菊苷的比率至少為約9.1∶1,包括:選擇至少兩個相互交配的甜葉菊基因型,每個含有新蛇菊苷A:蛇菊苷的比率至少為約9.1∶1,并且總糖苷水平為至少約14%;使所說的至少兩個相互交配的基因型進行交叉授粉,產(chǎn)生一種種子;收獲所說的種子;生長所說的甜葉菊植物。也公開了一種由從顯示出高的總糖苷水平和高的新蛇菊苷A和蛇菊苷之間的比率的甜葉菊植物得到的種子。
文檔編號A01H5/12GK1294486SQ99804378
公開日2001年5月9日 申請日期1999年3月29日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月31日
發(fā)明者詹姆斯·愛德華·布蘭德勒 申請人:加拿大農(nóng)業(yè)與農(nóng)業(yè)食品部