專利名稱：植酸酶變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植酸酶的變體，特別是子囊菌綱植酸酶變體和擔(dān)子菌綱植酸酶變體、相應(yīng)的克隆的DNA序列、制備此類植酸酶變體的方法以及其在多種工業(yè)用途上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植酸或肌醇-1,2,3,4,5,6-六二氫磷酸鹽(或縮寫為肌醇六磷酸鹽)是植物種子中肌醇的主要來源和磷酸鹽的基本儲(chǔ)存形式。植酸鈣鎂是一種混合的肌醇鉀、鎂和鈣鹽。
植酸的磷酸鹽部分螯合二價(jià)和三價(jià)陽離子，例如金屬離子，即營養(yǎng)所必需的離子鈣、鐵、鋅和鎂以及痕量礦物質(zhì)錳、銅和鉬。
植酸及其鹽，植酸鹽，通常不被代謝，即其三價(jià)磷和螯合的金屬離子均非營養(yǎng)上可利用的。
相應(yīng)地，食物和飼料的制備需要補(bǔ)充無機(jī)磷酸鹽，而且通常還必需補(bǔ)充營養(yǎng)所必需的離子，例如鐵和鈣。
此外，植酸鹽的三價(jià)磷穿過這些動(dòng)物的胃腸道并隨糞尿排泄，引起不希望的環(huán)境磷酸鹽污染，導(dǎo)致例如水環(huán)境的富養(yǎng)化和藻類的大量生長。
植酸或植酸鹽，這些在本申請中除非另外指明，作為同義詞使用或隨機(jī)使用的術(shù)語，均通過植酸酶降解。
植物以及微生物的植酸酶產(chǎn)生已有報(bào)道。在微生物中，產(chǎn)植酸酶細(xì)菌以及產(chǎn)植酸酶真菌是已知的。
有一些對屬于真菌門子囊菌綱的產(chǎn)植酸酶絲狀真菌的描述。特別是，有幾篇產(chǎn)植酸酶的子囊菌綱曲霉屬，例如土曲霉的文獻(xiàn)(Yamada等，1986，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)(Agric.Biol.Chem.3221275-1282))。此外，黑曲霉變種泡盛曲霉的植酸酶基因的克隆和表達(dá)也已經(jīng)被描述(Piddington等，1993，基因(Gene)133:55-62)。EP 0420358描述了無花果(黑)曲霉的植酸酶的克隆和表達(dá)。EP 0684313描述了子囊菌綱黑曲霉、嗜熱毀絲霉、土曲霉的植酸酶的克隆和表達(dá)。此外還給出了構(gòu)巢曲霉、嗜熱踝節(jié)菌、煙曲霉以及另一株土曲霉的植酸酶的一些部分序列。
在WO 97/35017中描述了Thermomyces lanuginosus植酸酶的克隆和表達(dá)。
目前需要具有改變的性質(zhì)或特性的植酸酶，例如熱穩(wěn)定性增加的、最佳pH改變的(體外處理需要一高的最佳pH，體內(nèi)胃腸道中的處理需要一低的最佳pH)和/或較高特異性活性的植酸酶。
發(fā)明概述在一方面，本發(fā)明提供植酸酶變體，其特性與所謂的模式植酸酶相比是改變的。
任何模式植酸酶，其與本文特別公開的十三種模式植酸酶具有某種相似性，都可以用作此類變體的模式。
在另一方面，本發(fā)明涉及衍生自Cladorrhinum foecundissimum的一種新型植酸酶。
在另一方面，本發(fā)明還提供編碼這些植酸酶變體和該植酸酶的DNA序列，以及它們的制備方法。
最后，本發(fā)明大體上還涉及植酸酶和植酸酶變體從任何植酸酶底物中釋放三價(jià)磷，特別是從植酸鹽或植酸中釋放無機(jī)磷酸鹽的應(yīng)用。
附圖簡述在下面本發(fā)明的詳細(xì)描述中，對圖進(jìn)行了說明，其中


圖1是十三種特定植酸酶序列的對齊排列(多序列對齊排列，按照程序PileUp；空隙權(quán)(Gap Weight):3.000；空隙長度權(quán)(GapLength Weight):0.100)；圖2該圖顯示一種植酸酶(“P_involtus-A1”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自97年11月28日保藏的Paxillus involutus CBS 100231株；包含其全長cDNA序列的表達(dá)質(zhì)粒pYES2.0被轉(zhuǎn)化到97年11月12日保藏的大腸桿菌DSM 11842株(見WO 98/28409)中；圖3該圖顯示另一種植酸酶(“P_involtus-A2”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自97年11月28日保藏的Paxillus involutus CBS 100231株；包含其全長cDNA序列的表達(dá)質(zhì)粒pYES2.0被轉(zhuǎn)化到97年11月12日保藏的大腸桿菌DSM 11843株(見WO 98/28409)中；圖4該圖顯示一種植酸酶(“絨毛栓菌(T pubescens)”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自97年11月28日保藏的絨毛栓菌CBS 100232株；包含其全長cDNA序列的表達(dá)質(zhì)粒pYES2.0被轉(zhuǎn)化到97年11月12日保藏的大腸桿菌DSM 11844株(見WO 98/28409)中；圖5該圖顯示一種植酸酶(“平田頭菇(A pediades)”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自96年12月4日保藏的平田頭菇CBS 900.96株；包含其全長cDNA序列的表達(dá)質(zhì)粒pYES2.0被轉(zhuǎn)化到96年12月2日保藏的大腸桿菌DSM 11313株(見WO 98/28409)中；圖6該圖顯示一種植酸酶(“P_lycii”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自96年12月4日保藏的Peniophora lycii CBS 686.96株；包含其全長cDNA序列的表達(dá)質(zhì)粒pYES2.0被轉(zhuǎn)化到96年12月2日保藏的大腸桿菌DSM11312株(見WO 98/28409)中；圖7該圖等同于EP 0684313的圖2，顯示一種植酸酶(“嗜熱毀絲霉(M_thermophila)”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自97年3月14日重新保藏的嗜熱毀絲霉ATCC 48102株(=ATCC 74340)；圖8該圖顯示一種植酸酶(“煙曲霉(A_fumigatus)”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自煙曲霉ATCC 13073株(見EP 0897985)；圖9該圖顯示一種子囊菌屬共有植酸酶(在本申請中稱為“共有植酸酶A(consphyA)”)的氨基酸(“Conphys”)和DNA序列(見EP 0897985)；
圖10該圖顯示一種植酸酶(“構(gòu)巢曲霉(A_nidulans)”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自構(gòu)巢曲霉DSM 9743株(見EP 0897985)；
圖11該圖等同于EP 0420358的圖8，顯示一種植酸酶(“無花果曲霉(A_ficuum)”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自無花果曲霉NRRL-3135株；
圖12該圖等同于EP 0684313的
圖1，顯示一種植酸酶(“土曲霉(A_terreus)”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自土曲霉CBS 220.95株；
圖13該圖顯示一種植酸酶(“嗜熱踝節(jié)菌(T_thermo)”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自97年3月14日重新保藏的嗜熱踝節(jié)菌ATCC 20186(=ATCC74338)株(見EP 0897985)；
圖14該圖等同于WO 97/35017的圖2，顯示一種植酸酶(“T_lanuginosa”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自Thermomyces lanuginosusCBS 586.94株；將包含其全長cDNA序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到96年2月23日保藏于NRRL的大腸桿菌DH5α(pMWR46)株B-21527中；
圖15該圖顯示一種植酸酶(“C_foecundissimum”)的氨基酸和DNA序列，其衍生自1997年1月23日保藏的Cladorrhinum foecundissimum CBS427.97株；將包含其全長cDNA序列的表達(dá)質(zhì)粒pYES2.0轉(zhuǎn)化到1999年3月17日保藏的大腸桿菌DSM 12742株中；
圖16該圖顯示C_foecundissimum植酸酶與作為模式植酸酶的嗜熱毀絲霉的對齊排列，利用程序GAP gcg(空隙權(quán)3.000；長度權(quán)0.100)；以及
圖17顯示如何能將C_foecundissimum植酸酶粘貼于
圖1的對齊排列中。
發(fā)明詳述植酸酶在本申請中，植酸酶是一種催化植酸鹽(肌醇六磷酸鹽)水解為(1)肌醇和/或(2)其單、二、三、四和/或五磷酸鹽以及(3)無機(jī)磷酸鹽的酶。為了簡短，在后文中上述化合物有時(shí)分別由IP6、I、IP1、IP2、IP3、IP4、IP5和P指代。這意味著通過植酸酶的作用，IP6被降解成P加一個(gè)或多個(gè)IP5、IP4、IP3、IP2、IP1和I組分?；蛘撸瑢⒐矓y有n個(gè)磷酸基團(tuán)于p、q、r、……位點(diǎn)處的肌醇表示為Ins(p,q,r,..)Pn。為了方便，Ins(1,2,3,4,5,6)P6(植酸)縮寫為PA。
根據(jù)酶命名法數(shù)據(jù)庫ExPASy〔一個(gè)酶命名法相關(guān)信息的收集處，其主要基于國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUBMB)命名委員會(huì)為描述每種類型鑒定過并為其提供了一個(gè)EC(酶學(xué)委員會(huì)(Enzyme Commission))編號(hào)的酶所提出的建議〕，已知有兩種不同類型的植酸酶一種被稱為的3-植酸酶(肌醇六磷酸鹽3-磷酸水解酶，EC 3.1.3.8)和一種被稱為的6-植酸酶(肌醇六磷酸鹽6-磷酸水解酶，EC 3.1.3.26)。3-植酸酶首先水解D-3位的酯鍵，而6-植酸酶首先水解D-6或L-6位的酯鍵。
“植酸酶”或“表現(xiàn)植酸酶活性的多肽或酶”包括任何能夠影響無機(jī)磷酸鹽或三價(jià)磷從各種肌醇磷酸鹽中釋放的酶。此類肌醇磷酸鹽(植酸酶底物)的實(shí)例是植酸及其任意鹽，例如，植酸鈉或植酸鉀或混合鹽。肌醇的單、二、三、四或五磷酸鹽的任何立體異構(gòu)體都可以用作植酸酶底物。優(yōu)選的植酸酶底物是植酸及其鹽。
根據(jù)上述的定義，可以利用其中采用了這些底物之一的任何測試來確定植酸酶的活性。在本申請中(除非另外指定)植酸酶活性是以FYT單位來確定的，一個(gè)FYT是在下述條件下pH5.5；溫度37℃；底物是濃度為0.0050mol/l的植酸鈉(C6H6O24P6Na12)，每分鐘釋放1μmol無機(jī)正磷酸鹽的酶的量。在試驗(yàn)部分描述了一種適當(dāng)?shù)闹菜崦笝z測法。
本發(fā)明提供遺傳工程植酸酶，如在所附的權(quán)利要求中所述。
遺傳工程植酸酶是非自然存在的植酸酶，其與模式植酸酶，例如野生型植酸酶不同。遺傳工程植酸酶包括，但不限于，通過定點(diǎn)誘變、基因重組、隨機(jī)誘變等制備的植酸酶。
本發(fā)明還提供了DNA構(gòu)建體、載體、宿主細(xì)胞以及制備這些遺傳工程植酸酶和植酸酶變體的方法及其應(yīng)用。
植酸酶變體是一種多肽或酶或其一個(gè)片段，其表現(xiàn)出植酸酶活性而且與模式植酸酶相比其被改變。
改變意指通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸或肽的置換、缺失、插入和/或增加的方式(在每種情況下，一個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生改變)。此類置換、缺失、插入、加入可以通過本領(lǐng)域所知的任何方法來實(shí)現(xiàn)，例如基因重組、隨機(jī)誘變、定點(diǎn)誘變等。
可衍生出植酸酶變體的模式或親代植酸酶可以是任何植酸酶，例如，一種野生型植酸酶或其一種衍生物、突變體或變體，包括等位變體和物種變體，及其基因工程變體，它們可以通過例如定點(diǎn)誘變、隨機(jī)誘變、重組等來制備。
在模式植酸酶概念中還包括任何雜交或嵌合植酸酶，即組合了至少兩種植酸酶的部分氨基酸序列的植酸酶。
雜交植酸酶可能組合了至少兩種子囊菌綱植酸酶、至少兩種擔(dān)子菌綱植酸酶或至少一種子囊菌綱植酸酶和至少一種擔(dān)子菌綱植酸酶的部分氨基酸序列。這些可衍生出部分氨基酸序列的子囊菌綱和擔(dān)子菌綱植酸酶可以是例如本文所提及的那些特定植酸酶中的任何一種。
在本申請中，單純衍生自子囊菌綱植酸酶的雜交的、重組的、隨機(jī)誘變的、定點(diǎn)誘變的或其它遺傳工程改造的植酸酶仍然是子囊菌綱植酸酶；而單純衍生自作為模式的擔(dān)子菌綱植酸酶的雜交的、重組的、隨機(jī)誘變的、定點(diǎn)誘變的或其它遺傳工程改造的植酸酶仍然是擔(dān)子菌綱植酸酶。將任何衍生自至少一種子囊菌綱植酸酶以及至少一種擔(dān)子菌綱植酸酶的雜交體稱為混合的子囊菌綱/擔(dān)子菌綱植酸酶，而且此種植酸酶在本申請中也是一種模式植酸酶。
類似地，衍生自一種或多種曲霉類植酸酶的雜交的、重組的、隨機(jī)誘變的、定點(diǎn)誘變的或其它遺傳工程改造的植酸酶仍然是曲霉植酸酶；而衍生自本文提到的任何其它分類亞群的雜交的、重組的、隨機(jī)誘變的、定點(diǎn)誘變的或其它遺傳工程改造的植酸酶也將被指定為該分類亞群的植酸酶。
進(jìn)而，在本申請中“衍生自”意指由所指定生物的一個(gè)株產(chǎn)生的或可產(chǎn)生的植酸酶，以及由分離自該株的DNA序列編碼并在由該DNA序列轉(zhuǎn)化的宿主生物中所產(chǎn)生的植酸酶。最后，該術(shù)語意指一種植酸酶，其由一合成的和/或cDNA來源的DNA序列編碼而且具有所指定植酸酶的鑒定特征。
模式植酸酶優(yōu)選為一種可以按下述與
圖1中十三種植酸酶(均為特別優(yōu)選的模式植酸酶)的任何一個(gè)進(jìn)行對齊排列的植酸酶。
優(yōu)選的野生型植酸酶(即，未經(jīng)重組、或重排或其它遺傳工程改造的植酸酶)與這十三種植酸酶中任一種的38-403號(hào)(隔孢伏革菌的編號(hào))氨基酸序列具有至少40％，更優(yōu)選至少50％，還更優(yōu)選至少60％，特別是至少70％，尤其是至少80％的相似性或同源性，優(yōu)選等同性，而在一最優(yōu)選的實(shí)施方案中是至少90％的相似度。
優(yōu)選的重組的或重排的或者其它遺傳工程改造的模式植酸酶與這十三種植酸酶中任何一種的38-49、63-77、274-291、281-300以及389-403號(hào)(隔孢伏革菌的編號(hào))部分序列具有至少60％，更優(yōu)選至少70％，還更優(yōu)選至少80％，特別是至少90％的相似性或同源性，優(yōu)選等同性。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，相似性程度是基于與十三種植酸酶中任一種的完整氨基酸序列的比較。
相似性或同源性，或者等同性的程度可以利用任何本領(lǐng)域已知的對齊排列程序來確定。一個(gè)優(yōu)選的對齊排列程序是在GCG版本8程序包(WisconsinPackage程序手冊，版本8,1994年8月，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組，575 ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA 53711，還見Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物學(xué)雜志(Joumal of Molecular Biology),48,443-453)中提供的GAP。利用GAP按照下述設(shè)置進(jìn)行多肽序列比較3.000的空隙權(quán)和0.100的空隙長度權(quán)。
還優(yōu)選的是一種野生型模式植酸酶，其包括一段由下述DNA序列編碼的氨基酸序列，該DNA序列與編碼
圖1中十三種特定植酸酶序列中任一種的38-403位(隔孢伏革菌的編號(hào))氨基酸序列的DNA序列雜交。
更優(yōu)選的模式植酸酶是一種遺傳工程植酸酶，其包括一段由下述DNA序列編碼的氨基酸序列，該DNA序列與編碼
圖1中十三種特定植酸酶序列中任一種的38-49位、63-77位、274-291位、281-300位以及389-403位的氨基酸序列(隔孢伏革菌的編號(hào))的DNA序列雜交。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，雜交是與十三種植酸酶中任何一種的完整植酸酶編碼部分的雜交。
用于確定一給定的DNA或RNA序列是否與一特定的核苷酸或寡核苷酸探針“雜交”的適當(dāng)試驗(yàn)條件包括在5×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中將含有待測DNA片段或RNA的濾膜預(yù)先浸泡10分鐘，(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(Molecular Cloning,ALaboratory Manual)，第二版，冷泉港，紐約)，并在5×SSC、5×Denhardt液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和100μg/ml變性的超聲處理鮭魚精DNA(Sambrook等，1989)的溶液中預(yù)雜交，隨后在大約45℃于含有隨機(jī)引物引發(fā)的(Feinberg,A.P.和Vogelstein,B.(1983)分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)132:6-13)32p-dCTP標(biāo)記的(特異活性＞1×109cpm/μg)探針10ng/ml的相同溶液中雜交12小時(shí)。
然后在至少55℃(低嚴(yán)謹(jǐn)度)、至少60℃(中嚴(yán)謹(jǐn)度)、至少65℃(中/高嚴(yán)謹(jǐn)度)、至少70℃(高嚴(yán)謹(jǐn)度)或至少75℃(極高嚴(yán)謹(jǐn)度)將濾膜在2×SSC、0.5％ SDS中洗滌兩次30分鐘。
利用X線膠片可檢測到在這些條件下寡核苷酸探針?biāo)s交的分子。
需要注明的是，某種特定的植酸酶變體實(shí)際上不需要由特定的模式植酸酶來制備，因?yàn)樵诒旧暾堉性撃Ｊ街菜崦赣米饕环N“樣板植酸酶”。在后來與模式植酸酶比較時(shí)變體表現(xiàn)出至少一種本文所指的改變便足夠了。
圖1的對齊排列是利用程序PileUp(Wisconsin Package程序手冊，版本8,1994年8月，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組，575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711)按照3.000的空隙權(quán)和0.100的空隙長度權(quán)作出。當(dāng)排列一種新型模式植酸酶或一種新型植酸酶變體時(shí)，與新型植酸酶(變體)一起的可以包括所有十三個(gè)序列，或者與新型植酸酶(變體)一起的至少包括
圖1的十三個(gè)序列之一。
對
圖1的新型模式植酸酶(或植酸酶變體)進(jìn)行對齊排列的優(yōu)選程序如下將新型模式植酸酶與
圖1的十三條序列中與新型模式植酸酶同源性程度最高的特定序列進(jìn)行對齊排列。為了對兩個(gè)序列進(jìn)行同源性程度的計(jì)算以及“根據(jù)
圖1進(jìn)行對齊排列”，優(yōu)選利用下面提到的程序GAP。首先對齊排列兩條序列，利用第一個(gè)對齊排列的結(jié)果(按照對齊排列所規(guī)定的，將相同和同源的氨基酸殘基彼此對齊)，將新型模式植酸酶(或植酸酶變體)添加(粘貼)到
圖1的對齊排列中，隨后相應(yīng)位點(diǎn)便很容易判斷。
實(shí)施例7顯示一個(gè)如何向
圖1的對齊排列中增加一種新型模式植酸酶并推斷其相應(yīng)植酸酶變體的實(shí)例。
同實(shí)施例7類似，可以對齊排列其他模式植酸酶并推斷變體。特別是對于下述模式植酸酶更是如此黑曲霉變種泡盛曲霉的植酸酶(美國專利號(hào)5,830,733)；WO 98/06858的芽孢桿菌植酸酶；WO 98/20139的大豆植酸酶；WO 98/05785的玉米植酸酶；WO 97/38096的曲霉植酸酶；WO98/13480的亞克紅曲霉植酸酶；EP 0699762的西方許旺氏酵母植酸酶等。
當(dāng)利用本文所描述的對齊排列來比較一種模式植酸酶和一種推測的植酸酶變體時(shí)，可以鑒定相應(yīng)的氨基酸位點(diǎn)，即模式植酸酶的模式位點(diǎn)和變體的變異位點(diǎn)——在對齊排列中只是簡單地將相應(yīng)的模式位點(diǎn)和變異位點(diǎn)一個(gè)置于另一個(gè)上方。如果模式位點(diǎn)的模式氨基酸同變異位點(diǎn)的變異氨基酸不同，則稱在給定的位點(diǎn)發(fā)生了改變。這些位點(diǎn)優(yōu)選的改變表現(xiàn)為氨基酸置換、缺失或增加。
在至少一個(gè)位點(diǎn)被改變意味著在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)，即在一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)、十一個(gè)、十二個(gè)等，高達(dá)所有列出的N個(gè)位點(diǎn)處被改變。該定義包括其任何可能的亞組合，例如任何有兩個(gè)置換的組、任何有三個(gè)置換的組、任何有四個(gè)置換的組等，——直至任何有(N-1)個(gè)位點(diǎn)置換的組。
在本申請中，不論模式植酸酶為何，均利用同植酸酶P_lycii相應(yīng)的編號(hào)對所有序列，以及包括
圖1的十三條序列進(jìn)行編號(hào)。這些“隔孢伏革菌編號(hào)”同“對齊排列編號(hào)”一起在
圖1中標(biāo)出。P_lycii的編號(hào)起始于M1，終止于E439處。
如上面所解釋的，對齊排列揭示了在除P_lycii外的各種植酸酶序列中哪些位點(diǎn)同給出的P_lvcii位點(diǎn)等價(jià)或相應(yīng)。
本文將氨基酸的置換標(biāo)注為如“3S”，其表示在位點(diǎn)3處可以用氨基酸S置換“原始”或模式位點(diǎn)3處的氨基酸，不論其為何種氨基酸。因此，該置換可以在相應(yīng)的變異位點(diǎn)產(chǎn)生一個(gè)S。現(xiàn)在鑒于
圖1上的對齊排列，對于所示各種植酸酶的類似如“3S”的置換將做如下解釋(第一個(gè)標(biāo)明的氨基酸是在“隔孢伏革菌位點(diǎn)”3處的“原始”或模式氨基酸)P_involtus_A1 F3S(3號(hào)F由S置換)P_involtus_A2 L3S絨毛栓菌 M1S平田頭菇 M1SP_lycii 多余的(已經(jīng)為一S)煙曲霉T5S共有植酸酶A V5S構(gòu)巢曲霉 T5S無花果曲霉_NRRL3135 A5S土曲霉A5S嗜熱踝節(jié)菌L5ST_lanuginosa V11S嗜熱毀絲霉G5S然而，下文對上述的特定置換將做如下定義(始終采用隔孢伏革菌編號(hào))P_involtus_A1 F3SP_involtus_A2 L3S絨毛栓菌 M3S平田頭菇 M3SP_lycii 多余的(已經(jīng)為一S)煙曲霉T3S共有植酸酶A V3S構(gòu)巢曲霉 T3S
無花果曲霉_NRRL3135 A3S土曲霉A3S嗜熱踝節(jié)菌L3ST_lanuginosa V3S嗜熱毀絲霉G3S此外，類似如“3S,F,G”的符號(hào)意指將正討論的模式植酸酶位點(diǎn)3(隔孢伏革菌編號(hào))處的氨基酸由S、F或G的任何一個(gè)來置換,即，例如標(biāo)示“3S,F,G”可以被認(rèn)為完全等同于標(biāo)示“3S,3F,3G”。
類似()3S的符號(hào)意指在該序列中與隔孢伏革菌3號(hào)相應(yīng)的位點(diǎn)處增加了氨基酸S(在實(shí)際序列中的空隙處)，反之為缺失(S3())。
在隔孢伏革菌植酸酶序列比
圖1中某些其他植酸酶存在更大缺失的區(qū)域的情況下，例如在位點(diǎn)201和202(隔孢伏革菌編號(hào))間的區(qū)域中，中間的位點(diǎn)(在其他序列中的氨基酸殘基)通過在最后一個(gè)隔孢伏革菌位點(diǎn)編號(hào)處添加a、b、c、d等小寫字母來編號(hào)，例如對于嗜熱毀絲霉植酸酶E201；G201a；P201b；Y201c；S201d；T201e；I201f；G202；D203等。
在本申請書的一個(gè)優(yōu)先權(quán)申請中，有兩個(gè)位點(diǎn)編號(hào)的小錯(cuò)誤；根據(jù)上述定義，在第一個(gè)優(yōu)先權(quán)申請中所提及的204和205位點(diǎn)(隔孢伏革菌編號(hào))為錯(cuò)誤指定；它們本應(yīng)分別編號(hào)為203a和204。因此，在本申請中204由203a、205由204代替。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的植酸酶變體包括以下氨基酸序列，其包括，優(yōu)選含有，一個(gè)或多個(gè)下述氨基酸置換24C；27P；31Y；33C；39H,S,Q；40L,N；42S,G；43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；44N；45D,S；47Y,F；49P；51E,A,R；56P；58D,K,A；59G；61R；62V,I；69Q；75W,F；78D,S；79G；80K,A；81A,G,Q,E；82T；83A,I,K,R,Q；84I,Y,Q,V；88I；90R,A；102Y；115N；116S；118V,L；119E；120L；122A；123N,Q,T；125M,S；126H,S,V；127Q,E,N；128A,S,T；132F,I,L；143N；148V,I；151A,S；152G；153D,Y；154D,Q,S,G；157V；158D,A；159T；160A,S；161T,N；162N；163W；170fH；170gA；171N；172P；173Q,S；184Q,S,P；185S；186A,E,P；187A；187aS；190A,P；193S；194S,T；195T,V,L；198A,N,V；200G,V；201D,E；201a、201b、201c、201d、201e、201f中的至少一個(gè)，優(yōu)選全部的缺失；201eT；202S,A；203R,K,S；203aY,T；204Q,E,S,A,V；205E；211L,V；215A,P；220L,N；223H,D；228N；232T；233E；235Y,L,T；236Y,N；237F；238L,M；242P,S；244D；246V；251eE,Q；253P；256D；260A,H；264R,I；265A,Q；267D；270Y,A,L,G；271D,N；273D,K；275F,Y；278T,H；280A,P；283P；287A,T；288L,I,F；292F,Y；293A,V；302R,H；304P,A；332F；336S；337T,G,Q,S；338I；339V,I；340P,A；343A,S,F,I,L；348Y；349P；352K；360R；362P；364W,F；365V,L,A,S；366D,S,V；367A,K；368K；369I,L；370V；373A,S；374S,A；375H；376M；383kQ,E；387P；393V；396R；404A,G；409R；411K,T；412R；417E,R；421F,Y；431E.
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，這是以模式植酸酶在所指定的位點(diǎn)處并未包括上面提到的氨基酸置換或增加或缺失為條件的。或者，以每個(gè)位點(diǎn)的模式氨基酸尚不是此處提出的變異氨基酸為條件的。但由于“改變”的表述，可以說這些附加條件事實(shí)上已經(jīng)為上述措辭所固有。
權(quán)利要求16-34的各種優(yōu)選植酸酶變體包括(優(yōu)選含有或具有)以下氨基酸序列，它們包括或含有在各權(quán)利要求中所列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換，增加或缺失。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，各種植酸酶變體包括這些置換中的1、2、3、4、5、6、7、8、9個(gè)或者甚至10個(gè)；或者10-15、15-20、20-30個(gè)或者甚至30-50個(gè)的大量置換；最終高達(dá)60、70、80或90個(gè)置換。
在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，各種植酸酶變體的氨基酸序列包括本文下面所列置換亞群的一個(gè)或多個(gè)置換；或者歸類至兩個(gè)或多個(gè)亞群的置換的組合。
通常，由于被本文所描述的一個(gè)或多個(gè)置換所修飾，優(yōu)選變體的氨基酸序列并非“包括”、“含有”或“具有”，而是“基本上由”或者“由”
圖1中特定模式植酸酶“組成”。
在本發(fā)明中，擔(dān)子菌意指擔(dān)子菌綱的微生物。此擔(dān)子菌綱與諸如子囊菌綱一起，都屬于真菌界。
分類學(xué)問題可以通過查閱下面所列的參考或通過查閱互聯(lián)網(wǎng)的下述地址http；//www3.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/tax.html所提供的真菌分類數(shù)據(jù)庫(NIH數(shù)據(jù)庫(Entrez))來明確。
對于擔(dān)子菌綱的定義，以Julich,1981，擔(dān)子菌綱高級分類法(HigherTaxa of Basidiomycetes)；Ainsworth和Bisby’s(編)真菌字典(Dictionary of theFungi),1995,Hawksworth,D.L.,P.M.Kirk,B.C.Sutton和D.N.Pegler；或者Hansen和Knudsen(編)，Nordic Macromycetes，第2卷(1992)和第3卷(1997)作為參考。優(yōu)選參考Hansen和Knudsen。
對于子囊菌綱的定義，以上面引用的Ainsworth和Brisby或者由Eriksson,O.E.和D.L.Hawksworth，第16卷，1998編輯的系統(tǒng)子囊菌綱(Systema Ascomycetum)作為參考。優(yōu)選參考Eriksson等。
大體上，歸類于以上所列參考(包括數(shù)據(jù)庫)的子囊菌綱/擔(dān)子菌綱的微生物是本申請中的子囊菌/擔(dān)子菌。
一些曲霉菌株很難分類，因?yàn)樗鼈兪菨u變的，因此它們應(yīng)被歸類為半知菌。然而，一旦發(fā)現(xiàn)有性配對部分，便按照分類法將其重新分類。例如，構(gòu)巢曲霉的有性型是構(gòu)巢皮胞囊果屬(子囊菌門的不整囊菌綱，散囊菌目，發(fā)菌科)。優(yōu)選子囊菌門的這些亞群以及子囊菌門的核菌綱，糞殼目，Lasiosphaeriaceae科。
本文所用的“子囊菌綱”和類似物包括曲霉屬、Thermomyces、毀絲霉屬、踝節(jié)菌屬的漸變的，并因此應(yīng)被歸類于半知菌的菌株。
優(yōu)選的擔(dān)子菌綱植酸酶是在WO 98/28409中以“發(fā)明詳述”為標(biāo)題的章節(jié)的最開始處所列舉的那些。
按照在附圖簡述下所列各文獻(xiàn)的指導(dǎo)，可以制備編碼這十三種特別列舉的模式植酸酶以及其他模式植酸酶的DNA序列。
利用本領(lǐng)域眾所周知的各種方法可以從產(chǎn)生目的植酸酶的任何細(xì)胞或微生物中分離編碼模式植酸酶的DNA序列。首先，應(yīng)該利用來自產(chǎn)該植酸酶生物的染色體DNA或信使RNA構(gòu)建一基因組DNA和/或cDNA文庫。然后，如果已知該植酸酶的氨基酸序列，可以合成同源的標(biāo)記寡核苷酸探針，并用來從由該生物制備的基因組文庫中鑒定植酸酶編碼克隆。或者，利用低嚴(yán)謹(jǐn)度的雜交和洗滌條件，可以將含有同一已知植酸酶基因同源的序列的標(biāo)記寡核苷酸探針用作探針，來鑒定植酸酶編碼克隆。
另一種鑒定植酸酶編碼克隆的方法還可以包括將基因組DNA片段插入到一表達(dá)載體，例如質(zhì)粒中，利用所獲的基因組DNA文庫轉(zhuǎn)化植酸酶陰性的細(xì)菌，然后將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌涂平板至含有植酸酶底物的瓊脂上，由此可以鑒定表達(dá)植酸酶的克隆。
或者，可以通過已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法來合成編碼該酶的DNA序列，例如，由S.L.Beaucage和M.H.Caruthers(1981)所描述的磷酰胺方法或者由Matthes等(1984)所描述方法。在磷酰胺方法中，對寡核苷酸進(jìn)行合成，例如在自動(dòng)DNA合成儀中，將其純化、退火、連接并克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中。
最后，按照標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，通過連接合成的、基因組的或cDNA來源的片段(若適當(dāng)，這些片段對應(yīng)于整個(gè)DNA序列的各個(gè)部分)所制備的DNA序列可以是基因組和合成混合來源的、合成和cDNA混合來源的或者基因組和cDNA混合來源的。也可以利用特定的引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來制備DNA序列如在美國專利4,683,202或R.K.Saiki等(1988)中所描述。
編碼本發(fā)明中植酸酶變體的DNA可以通過本領(lǐng)域所知的方法來制備，例如定點(diǎn)誘變。一旦分離出編碼目的模式植酸酶的DNA序列，并確定了預(yù)期的突變位點(diǎn)，就可以利用合成的寡核苷酸引入突變。這些寡核苷酸含有預(yù)期突變位點(diǎn)的側(cè)翼核苷酸序列；在寡核苷酸合成過程中插入突變的核苷酸。在一特定的方法中，在一攜帶植酸酶編碼基因的載體中建立一個(gè)橋接植酸酶編碼序列的DNA單鏈空隙。隨后將帶有預(yù)期突變的合成核苷酸與單鏈DNA的同源部分退火。然后用DNA聚合酶Ⅰ(Klenow片段)補(bǔ)平其余的空隙，并用T4連接酶連接該構(gòu)建體。該方法的一個(gè)特定的實(shí)例描述于Morinaga等(1984)中。US 4,760,025公開了通過進(jìn)行基因盒的局部改動(dòng)對編碼多個(gè)突變的寡核苷酸的引入。然而，因?yàn)榭梢砸敫鞣N長度的多種寡核苷酸，所以利用Morinaga方法可以在任何時(shí)候引入更加多樣的突變。
在Nelson和Long(1989)中描述了向編碼一預(yù)期模式植酸酶的DNA序列中引入突變的另一種方法。其涉及一個(gè)3步產(chǎn)生的含有預(yù)期突變的PCR片段，這些突變是通過利用一化學(xué)合成的DNA鏈作為PCR反應(yīng)中的引物之一來引入的。由PCR生成的片段，可以通過限制性核酸內(nèi)切酶切割來分離攜帶該突變的DNA片段并將其重新插入到一表達(dá)質(zhì)粒中。
突變編碼一種模式植酸酶的DNA序列的另一方法是隨機(jī)誘變。在翻譯成所示氨基酸序列的基因的至少三個(gè)部分或在整個(gè)基因內(nèi)適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行局部隨機(jī)誘變或特定區(qū)域隨機(jī)誘變。
利用本領(lǐng)域已知的任何方法可以方便地對編碼模式植酸酶的DNA序列進(jìn)行隨機(jī)誘變。
同上面的相關(guān)，本發(fā)明進(jìn)一步還涉及產(chǎn)生模式植酸酶的變體的方法，其中該變體優(yōu)選表現(xiàn)出下述的改變的特征，該方法包括
(a)使編碼該模式植酸酶的DNA序列進(jìn)行定點(diǎn)誘變，或用Nelson和LongPCR誘變方法誘變或者隨機(jī)誘變，(b)在宿主細(xì)胞中表達(dá)步驟(a)中獲得的突變DNA序列，并(c)篩選表達(dá)相對于該模式植酸酶性質(zhì)改變的植酸酶變體的宿主細(xì)胞。
當(dāng)利用隨機(jī)誘變時(shí)，本發(fā)明上述方法的步驟(a)優(yōu)選利用添加的引物進(jìn)行。
例如，可以通過利用一種適宜的物理或化學(xué)誘變劑、利用一種適宜的寡核苷酸、或者通過將該DNA序列進(jìn)行PCR生成的誘變來進(jìn)行隨機(jī)誘變。此外，可以通過利用這些誘變劑的任意組合來進(jìn)行隨機(jī)誘變。例如，該誘變劑可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)換、顛換、倒位、scrambling、缺失、和/或插入。
適于本目的的物理或化學(xué)誘變劑的實(shí)例包括紫外線(UV)輻射、羥胺、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、wycb甲基羥胺、亞硝酸、乙基甲磺酸鹽(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸以及核苷酸類似物。利用此類誘變劑時(shí)，通常通過在適于誘變發(fā)生的條件下于所選誘變劑存在下溫育待誘變的編碼親代酶的DNA序列，并篩選具有預(yù)期性質(zhì)的突變DNA來進(jìn)行誘變。
當(dāng)利用寡核苷酸來進(jìn)行誘變時(shí)，在寡核苷酸合成過程中于該寡核苷酸待改變的位點(diǎn)處應(yīng)添加或增強(qiáng)標(biāo)定三種非親代核苷酸。實(shí)施添加或增強(qiáng)標(biāo)定或以避開無用氨基酸的密碼子。通過任何公開的技術(shù)，利用認(rèn)為適當(dāng)?shù)娜鏟CR、LCR或者任何DNA聚合酶和連接酶，可以將添加或增強(qiáng)標(biāo)定的寡核苷酸整合到編碼植酸酶的DNA中。
優(yōu)選利用“持續(xù)隨機(jī)添加”進(jìn)行添加，其中在每個(gè)位點(diǎn)上的野生型和突變的百分比是預(yù)先確定的。此外，根據(jù)對某些核苷酸引入的優(yōu)選以及由此的對一個(gè)或多個(gè)特定氨基酸殘基的優(yōu)選可以指導(dǎo)添加。例如，添加可在每個(gè)位點(diǎn)引入90％野生型和10％突變。在選擇添加設(shè)計(jì)時(shí)還應(yīng)根據(jù)遺傳學(xué)以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)限制加以考慮。添加設(shè)計(jì)可以通過利用DOPE程序來進(jìn)行，其特別保證防止引入終止密碼子。
在利用PCR生成的誘變時(shí)，在增加核苷酸錯(cuò)誤增強(qiáng)標(biāo)定的條件下對編碼模式植酸酶的化學(xué)處理或非處理的基因進(jìn)行PCR(Deshler 1992；Leung等，技術(shù)(Technique)，第1卷，1989,11-15頁)。
通過例如向一誘變株中轉(zhuǎn)化一含有親代糖基化酶的質(zhì)粒，培養(yǎng)轉(zhuǎn)有質(zhì)粒的誘變株并從誘變株中分離突變的質(zhì)粒，大腸桿菌(Fowler等，分子普通遺傳學(xué)(Molec.Gen.Genet.),133,1974,179-191頁)、釀酒酵母或任何其他微生物的誘變株可以用于對編碼模式植酸酶DNA進(jìn)行隨機(jī)誘變,即通過例如向一誘變株中轉(zhuǎn)化一含有親代糖基化酶的質(zhì)粒，培養(yǎng)轉(zhuǎn)有質(zhì)粒的誘變株并從誘變株中分離突變的質(zhì)粒。隨后可以將突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)生物體中。
待誘變的DNA序列可以方便地存在于由表達(dá)該模式植酸酶的生物體所制備的基因組或cDNA文庫中?；蛘?，該DNA序列可以存在于一適當(dāng)?shù)妮d體上，例如質(zhì)?；蚴删w，其本身可以同誘變劑進(jìn)行溫育或者暴露于誘變劑。待誘變的DNA還可以通過整合到細(xì)胞的基因組中或者通過存在于駐留細(xì)胞中的一種載體上而存在于該宿主細(xì)胞中。最后，待誘變的DNA可以處于分離的形式。當(dāng)然待進(jìn)行隨機(jī)誘變的DNA序列優(yōu)選為一cDNA或一基因組DNA序列。
有些情況下，在進(jìn)行表達(dá)步驟b)或篩選步驟c)之前擴(kuò)增突變DNA序列可能是方便的。此類擴(kuò)增可以按照本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，目前優(yōu)選的方法是利用基于親代酶的DNA或氨基酸序列制備的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR生成的擴(kuò)增。
在同誘變劑進(jìn)行溫育或暴露于誘變劑后，通過在便于表達(dá)的條件下培養(yǎng)攜帶該DNA序列的適當(dāng)宿主細(xì)胞來表達(dá)該突變DNA。用于此目的的宿主細(xì)胞可以是由選擇性地存在一載體上的突變DNA序列轉(zhuǎn)化的那種，或者是在誘變處理過程中攜帶編碼親代酶DNA序列的那種。適宜的宿主細(xì)胞的實(shí)例如下革蘭氏陽性細(xì)菌，例如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌，淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌；以及革蘭氏陰性細(xì)菌，例如大腸桿菌。
突變的DNA序列進(jìn)而可以包括編碼允許該突變DNA序列表達(dá)的功能的一段DNA序列。
利用局部隨機(jī)誘變可以將隨機(jī)誘變便利地定位于模式植酸酶的一部分。例如，當(dāng)已經(jīng)確定了酶的某些區(qū)域?qū)τ谠撁傅囊灰阎匦蕴貏e重要時(shí)，以及當(dāng)預(yù)計(jì)修飾會(huì)產(chǎn)生具有改變特性的變體時(shí)，這可能是有益的。在親代酶的三級結(jié)構(gòu)已被闡明而且同酶的功能相關(guān)時(shí)通?？梢源_定此類區(qū)域。
通過利用上面所描述的PCR生成的誘變技術(shù)或本領(lǐng)域所知的任何其他適當(dāng)?shù)募夹g(shù)可以方便地進(jìn)行局部的或者區(qū)域特定的隨機(jī)誘變?；蛘撸幋a待修飾的DNA序列中一部分的DNA序列可以被分離，例如通過插入到一適當(dāng)?shù)妮d體中，隨后通過利用上面討論的任何誘變方法可以對該部分進(jìn)行誘變。
為了改變?nèi)缒Ｊ街菜崦傅奶禺愋曰钚远M(jìn)行區(qū)域特定的隨機(jī)誘變時(shí)，可以適當(dāng)?shù)蒯槍ν?br> 圖1中所列氨基酸序列的下述氨基酸殘基相應(yīng)的密碼子位點(diǎn)而進(jìn)行殘基41-47、68-80、83-84、115-118、120-126、128、149-163、184-185、191-193、198-201e、202-203、205、235-236、238-239、242-243、270-279、285、288、332-343、364-367、369-375、394。
區(qū)域41-47、68-80、120-128、149-163、270-279、332-343、364-375。
隨機(jī)誘變可以通過下面的步驟進(jìn)行1．在親代酶中選擇待修飾的目的區(qū)域2．在選定的區(qū)域中確定突變位點(diǎn)和非突變位點(diǎn)3．例如根據(jù)待構(gòu)建變體的預(yù)期的穩(wěn)定性和/或特性，確定應(yīng)進(jìn)行哪類突變4．選擇結(jié)構(gòu)上合理的突變5．根據(jù)步驟4調(diào)整通過步驟3選定的殘基6．利用一適當(dāng)?shù)奶砑铀惴ǚ治龊塑账岱植?．如果必要，根據(jù)遺傳密碼的實(shí)踐調(diào)整所需的殘基，例如考慮到由遺傳密碼產(chǎn)生的限制，如為了避免終止密碼子的引入；技術(shù)人員將清楚一些密碼子的組合在實(shí)踐中不能使用并將需要調(diào)整。
8．制備引物。
9．利用這些引物進(jìn)行隨機(jī)誘變10．通過篩選預(yù)期的改善的性質(zhì)來選擇所獲的植酸酶變體用于步驟6中的適宜的添加算法是本領(lǐng)域眾所周知的。Tomandl,D.等，1997，計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)雜志(Journal of Computer-Aided MolecularDesign)11:29-38描述了一種此類算法。另一種算法是DOPE(Jensen,LJ,Andersen,KV,Svendsen,A和Kretzschmar,T(1998)核酸研究(NucleicAcids Research)26:697-702)。
編碼本發(fā)明的模式植酸酶或植酸酶變體的DNA序列可以利用表達(dá)載體，重組表達(dá)載體來表達(dá)，該表達(dá)載體通常包括編碼啟動(dòng)子、操縱子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯啟始信號(hào)的控制序列以及選擇性地一個(gè)抑制子基因或各種激活子基因。
重組表達(dá)載體應(yīng)該是可以方便地進(jìn)行重組DNA操作的任何載體，而且載體的選擇通常將有賴于其將被引入的宿主細(xì)胞。因此，載體可以是一種自主復(fù)制載體，例如質(zhì)粒、噬菌體或者染色體外元件?；蛘撸d體可以是當(dāng)引入宿主細(xì)胞時(shí)被整合到宿主細(xì)胞基因組中并同其整合于其中的染色體一起復(fù)制的那種。
在載體中，DNA序列應(yīng)該是可操作地同一適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列相連。啟動(dòng)子可以是在選定的宿主細(xì)胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，而且可以來自編碼宿主細(xì)胞同源或者異源性蛋白質(zhì)的基因。用于指導(dǎo)編碼本發(fā)明中植酸酶變體的DNA序列轉(zhuǎn)錄，特別是在一細(xì)菌宿主中轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動(dòng)子的一個(gè)實(shí)例是大腸桿菌的lac乳糖操縱子。對于在真菌宿主中的轉(zhuǎn)錄，有效啟動(dòng)子的實(shí)例是來自編碼米曲霉TAKA淀粉酶基因的那些。
本發(fā)明的表達(dá)載體還可以包括一個(gè)適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子以及在真核細(xì)胞中可操縱地連接至編碼本發(fā)明中植酸酶變體DNA序列的的多聚腺苷酸化序列。終止和多聚腺苷酸化序列可以適當(dāng)?shù)匮苌酝瑔?dòng)子相同的來源。
載體進(jìn)一步可以包括使載體能夠在所選宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。此類序列的實(shí)例是質(zhì)粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的復(fù)制起點(diǎn)。
載體還可能包括一可篩選的標(biāo)志，例如，其產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中彌補(bǔ)一缺陷的基因，如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或者提供抗生素抗性的基因，如氨芐青霉素抗性。進(jìn)而，載體可以包括曲霉篩選標(biāo)記，如amdS、argB、niaD和sC，或者篩選可以通過共轉(zhuǎn)化來完成，例如按照在WO91/17243所描述的。
用于分別連接本發(fā)明中編碼植酸酶變體的DNA構(gòu)建體、啟動(dòng)子、終止子和其他元件并將它們插入到含有復(fù)制所需信息的適當(dāng)載體中的方法，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是眾所周知的(參閱，例如，Sambrook等，(1989))。
本發(fā)明的細(xì)胞，其包括按照上面所確定的其包括本發(fā)明的DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體，在本發(fā)明的植酸酶變體的重組制備中便利地用作宿主細(xì)胞。通過將本發(fā)明中編碼變體的DNA構(gòu)建體整合到宿主染色體中(一個(gè)或多個(gè)拷貝)，可以方便地用該DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化該細(xì)胞。這種整合通常被認(rèn)為具有優(yōu)勢，因?yàn)镈NA序列更有可能穩(wěn)定地保留在細(xì)胞中?？梢园凑諅鹘y(tǒng)的方法，例如通過同源或異源重組，將DNA構(gòu)建體整合到宿主染色體中?；蛘?，可以用如上所述的與不同的宿主細(xì)胞類型相關(guān)表達(dá)載體來轉(zhuǎn)化該細(xì)胞。
一種分離的DNA分子或者一段“克隆的DNA序列”、“一個(gè)DNA構(gòu)建體”、“一段DNA片段”或“一段分離的DNA序列”指一種DNA分子或序列，其可以按照在遺傳工程中用來將DNA片段由其天然位置重新定位至其將被復(fù)制的一不同位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)的克隆方法來進(jìn)行克隆。該術(shù)語通常指基本上沒有其他核酸序列的一段核酸序列，例如通過瓊脂糖凝膠電泳確定的；至少大約20％的純度，優(yōu)選至少40％的純度，更優(yōu)選大約60％的純度，還要更優(yōu)選80％的純度，最優(yōu)選大約90％的純度，更加更優(yōu)選大約95％的純度?？寺〉牟襟E可能包括切除和分離含有編碼該多肽的核酸序列的預(yù)期核酸片段，將該片段插入一載體分子，以及將重組載體整合到一種宿主細(xì)胞中，在該宿主細(xì)胞中該核酸序列的多個(gè)拷貝或克隆將被復(fù)制。核酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或者其任意的組合。
術(shù)語“載體”規(guī)定為包括象“核酸構(gòu)建體”、“DNA構(gòu)建體”、“表達(dá)載體”或“重組載體”那樣的術(shù)語/對象。
核酸構(gòu)建體包括本發(fā)明中可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列的核酸序列，這些調(diào)控序列能夠指導(dǎo)編碼序列在同調(diào)控序列相容的條件下于一種合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)。
本文“核酸構(gòu)建體”定義為一段核酸分子，單鏈或雙鏈，其分離自一個(gè)天然存在的基因或者其經(jīng)修飾含有以自然界不會(huì)存在的方式結(jié)合或并置的核酸片段。
在核酸構(gòu)建體含有本發(fā)明中編碼序列表達(dá)所需的所有調(diào)控序列時(shí)，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語表達(dá)基因盒應(yīng)該是同義的。
本文所定義的術(shù)語“編碼序列”首先包括一段序列，當(dāng)將其置于上述調(diào)控序列的調(diào)控下時(shí)，其被轉(zhuǎn)錄成mRNA并翻譯成本發(fā)明的一種多肽。編碼序列的邊界一般是通過5’-末端的翻譯啟始密碼子ATG和3’-末端的翻譯終止密碼子來確定的。編碼序列可以包括，但不限于，DNA、cDNA以及重組核酸序列。
術(shù)語“調(diào)控序列”本文定義為包括所有對于核酸序列的編碼序列表達(dá)所必需或有利的所有成分。每個(gè)調(diào)控序列對于編碼多肽的核酸序列可以是原來或外來的。此類調(diào)控序列包括，但不限于，一個(gè)先導(dǎo)序列、一個(gè)多聚腺苷酸化序列、一個(gè)前肽序列、一個(gè)啟動(dòng)子、一個(gè)信號(hào)序列以及一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子。至少，調(diào)控序列包括一個(gè)啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。為了引入便于連接調(diào)控序列和編碼多肽的核酸序列編碼區(qū)的特定限制性酶切位點(diǎn)，調(diào)控序列可以帶有接頭。
“宿主細(xì)胞”或“重組宿主細(xì)胞”包括親代細(xì)胞的任何子代，其因在復(fù)制過程中發(fā)生的突變而與親代細(xì)胞不同。
細(xì)胞優(yōu)選被包括本發(fā)明核酸序列的載體轉(zhuǎn)化，隨后該載體整合到該宿主染色體中。
“轉(zhuǎn)化”意指在宿主細(xì)胞中引入包括本發(fā)明核酸序列的載體，以便該載體作為染色體整合子或自我復(fù)制的染色體外載體來保持。整合通常被認(rèn)為是一種優(yōu)勢，因?yàn)楹怂嵝蛄懈捎心茉诩?xì)胞中穩(wěn)定保持。載體在宿主染色體中的整合可以通過如上所述的同源或非同源重組來進(jìn)行。
宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，例如原核生物，或者非單細(xì)胞微生物，例如真核生物。真核生物細(xì)胞的實(shí)例是哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞。有用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、COS細(xì)胞或者例如可由美國典型培養(yǎng)物保藏中心所提供的許多其他的永生化細(xì)胞系。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。
真菌細(xì)胞可以通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞壁再生的方法，按照其原本的形式進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因植物、植物的部分例如植物的種子或者植物細(xì)胞，其已經(jīng)由編碼本發(fā)明中植酸酶的DNA序列所轉(zhuǎn)化以便表達(dá)或產(chǎn)生該酶。根據(jù)本發(fā)明的使用和食物/飼料權(quán)利要求，此類植物或植物部分的組合物和應(yīng)用也屬于本發(fā)明的范圍，特別是其用做飼料和食物或者其添加劑。
轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉或單子葉的，簡稱為雙的子葉或單子葉植物。主要的興趣是，可作為潛在的食物或種子組分，而且含有植酸的此類植物。種子組分的正常植酸水平為0.1-100g/kg，或者更通常為0.5-50g/kg，最通常為0.5-20g/kg。單子葉植物的實(shí)例是禾本科植物，例如草地早熟禾(早熟禾屬)，禾本科牧草，如狐茅屬、黑麥草屬，溫帶禾本，如，剪股穎屬，以及禾谷類，如小麥屬、燕麥屬、黑麥屬、大麥屬、稻屬、高粱屬和玉米屬(玉米)。
雙子葉植物的實(shí)例是豆科植物，例如羽扇豆屬、豌豆屬、菜豆屬和大豆，以及十字花科植物(十字花科)，例如花椰菜、油籽油菜以及密切相關(guān)的模式生物擬南芥。
此類轉(zhuǎn)基因植物等能夠降解其自身的植酸，相應(yīng)地減低了對于向含有這類植物的食物或飼料中添加此類酶的需要。優(yōu)選將植物或植物部分，例如種子，磨碎或粉碎，并且可能在添加至食物或飼料前或者在應(yīng)用，如攝入前還要浸泡，以便使酶促降解的速度適應(yīng)實(shí)際應(yīng)用。
如果需要，還可以從植物中回收植物所產(chǎn)生的酶。在某些情況下；優(yōu)選從植物中回收，以便在隨后可能的沉淀步驟中保證制劑的熱穩(wěn)定性。
植物部分的實(shí)例是莖、胼胝、葉、根、果實(shí)、種子、塊莖等。但是任何植物組織也都包括在本定義中。
任何植物細(xì)胞，不論組織來源，都包括在上面植物細(xì)胞的定義中。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括這些植物、植物部分和植物細(xì)胞的子代。
技術(shù)人員將知道如何構(gòu)建一個(gè)DNA表達(dá)構(gòu)建體來插入指定植物，特別是考慮到是否該酶應(yīng)以一種組織特異性的方式來分泌。同這個(gè)評價(jià)有關(guān)的是在植物的表達(dá)室中植酸酶的穩(wěn)定性(pH穩(wěn)定性、由內(nèi)源性蛋白酶的可降解性等)。如果需要的話，他還將能夠選擇適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列，如啟動(dòng)子和終止子序列以及信號(hào)或轉(zhuǎn)位序列(Tague等，植物，生理，(Plant,Phys.),86,506,1988)。
利用任何已知的方法，可以用該DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物、植物部分等。這種方法的一個(gè)實(shí)例是通過病毒或細(xì)菌載體的轉(zhuǎn)化，例如經(jīng)遺傳學(xué)設(shè)計(jì)而包括編碼本發(fā)明中植酸酶的基因的農(nóng)桿菌屬的細(xì)菌種。直接將植酸酶DNA引入植物細(xì)胞或植物組織的方法在本領(lǐng)域也是已知的，例如顯微注射和電穿孔(Gasset等，科學(xué)(Science),244,1293；Potrykus，生物/技術(shù)(Bio/Techn.)8,535,1990；Shimamoto等，自然(Nature),338,274,1989)。
在轉(zhuǎn)化后，利用技術(shù)人員已知的任何方法篩選轉(zhuǎn)化子，隨后將它們再生成為完整的植物。
然后，這些植物等以及它們的子代攜帶植酸酶編碼DNA作為它們遺傳學(xué)部件的一部分。
大體上，以WO 9114782A和WO 9114772A作為參考。
根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是選擇來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的方法(綜述見Hooykas和Schilperoort,1992，植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)19:15-38)，然而，其還可以用于轉(zhuǎn)化單子葉植物。由于宿主范圍的限制，在根癌農(nóng)桿菌輔助下轉(zhuǎn)化單子葉植物通常是不可能。此處需使用其他的方法。選擇來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的方法是對胚胎胼胝或發(fā)育中胚胎的微粒轟擊(包被有轉(zhuǎn)化DNA的顯微金或鎢顆粒)(Christou,1992.植物雜志(PlantJ.)2:275-281；Shimatoto,1994.生物技術(shù)的當(dāng)前觀點(diǎn)(Curr.Opin.Biotechnol.)5:158-162；Vasil等，1992.生物技術(shù)(Bio/Technology)10:667-674)。
用于將游離DNA轉(zhuǎn)移入這些植物的其他系統(tǒng)也是優(yōu)選的方法，包括病毒載體(Joshi和Joshi,1991.FEBS Lett.281:1-8)、通過聚乙二醇或電穿孔的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(綜述見Potyrkus,1991.植物生理學(xué)和植物分子生物學(xué)年鑒(Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.)42:205-225)、向葉肉原生質(zhì)體中的DNA顯微注射(Crossway等，1986.Mol.Gen.Genet.202:79-85)以及向禾谷類植物嫩的花分檗中的DNA顯微注射(de la Pena等，1987.自然325:274-276)。
通常將編碼本發(fā)明植酸酶變體的cDNA或基因置于由在目標(biāo)植物中有活性的一適當(dāng)啟動(dòng)子和一適當(dāng)終止子(轉(zhuǎn)錄的終止)組成的一個(gè)表達(dá)基因盒中(例如Pietrzak等，1986.核酸研究(Nuleic Acids Res.)14:5857-5868)。單子葉植物通過微粒轟擊將該基因盒(當(dāng)然包括合適的篩選標(biāo)志，見下面)轉(zhuǎn)化入該植物。如果是雙子葉植物，首先將表達(dá)基因盒置于一提供T-DNA邊界以及一個(gè)合適的篩選標(biāo)志的適宜載體中，該載體又被轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌。雙子葉植物將通過載有由T-DNA為側(cè)翼的表達(dá)基因盒以及篩選標(biāo)志的農(nóng)桿菌按照標(biāo)準(zhǔn)的方法(例如Akama等，1992.植物細(xì)胞報(bào)道(Plant Cell Reports)12:7-11)來轉(zhuǎn)化。最近對T-DNA由農(nóng)桿菌向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移已經(jīng)進(jìn)行了綜述(Zupan和Zambryski,1995.植物生理學(xué)(Plant Physiol.)107:1041-1047)。用于通過農(nóng)桿菌進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化的載體是商品化的或者可以從許多構(gòu)建此類載體的實(shí)驗(yàn)室獲得(例如，Deblaere等，1985.核酸研究13:4777-4788；綜述見Klee等，1987.植物生理學(xué)年鑒(Annu.Rev.Plant Physiol.)38:467-486)。
可利用的植物啟動(dòng)子根據(jù)操作的步驟，可能需要器官和/或細(xì)胞特異性的表達(dá)以及適當(dāng)?shù)陌l(fā)育控制和環(huán)境控制。例如，理想的是在玉米胚乳等中表達(dá)植酸酶cDNA。最常用的啟動(dòng)子是組成型的35S-CaMV啟動(dòng)子(Franck等，1980.細(xì)胞(Cell)21:285-294)。表達(dá)在植物各部位中將或多或少是等同的。該啟動(dòng)子已經(jīng)成功地用于改造除草劑和病原體抗性植物(綜述見Stitt和Sonnewald,1995.植物生理學(xué)和植物分子生物學(xué)年鑒(Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.)46:341-368)。器官特異性啟動(dòng)子已經(jīng)被報(bào)道用于儲(chǔ)存性沉降組織(sink tissue)，例如種子、馬鈴薯塊莖和果實(shí)(Edwards和Coruzzi,1990.遺傳學(xué)年鑒(Annu.Rev.Genet.)24:275-303)，以及用于代謝性沉降組織，例如分生組織(Ito等，1994.植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)24:863-878)。
用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適于所選宿主細(xì)胞生長的任何常規(guī)培養(yǎng)基。所表達(dá)的植酸酶可以方便地分泌到培養(yǎng)基中，并且可以通過眾所周知的方法從中回收，包括通過離心或過濾將細(xì)胞同培養(yǎng)基分離，用鹽，如硫酸銨沉淀培養(yǎng)基的蛋白成分，隨后進(jìn)行層析，如離子交換層析、親和層析等。
優(yōu)選的宿主細(xì)胞是鐮孢屬、漢遜氏酵母屬、木霉屬或曲霉屬的菌株，特別是禾谷鐮孢、毒性鐮孢(Fusarium venenatum)、谷類鐮孢(Fusariumcerealis)、具有鐮孢ATCC20334株的鑒別特征的進(jìn)一步描述于PCT/US/95/07743中的各種鐮孢菌種、多形漢遜氏酵母、harzianum木霉(Trichoderma harzianum)或reesei木霉(Trichoderma reesei)、黑曲霉或米曲霉中的一株。
在多形漢遜氏酵母中表達(dá)的參考:Gellissen,G.、Piontek,M.、Dahlems,U.、Jenzelewski,V.、Gavagan,J.E.、DiCosimo,R.、Anton,D.I.和Janowicz,Z.A.(1996)。重組的多形漢遜氏酵母作為生物催化劑菠菜乙醇酸酯氧化酶(GO)以及釀酒酵母催化酶T(CTT1)基因的共表達(dá)。應(yīng)用微生物學(xué)生物技術(shù)(Appl.Microbiol.Biotechnol.)46,46-54。
根據(jù)本發(fā)明植酸酶變體的一些更特定的應(yīng)用登載于PCT/DK97/00568,發(fā)明詳述部分的最后數(shù)頁。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的植酸酶變體基本上不含其他非植酸酶多肽，例如，通過SDS-PAGE確定的至少大約20％的純度、優(yōu)選至少大約40％的純度、更優(yōu)選大約60％的純度、還要更優(yōu)選大約80％的純度、最優(yōu)選大約90％的純度而且更加更優(yōu)選大約95％的純度。有時(shí)此類多肽或者指一種“純化的”和/或“分離的”植酸酶。
含有本發(fā)明植酸酶變體的植酸酶多肽包括融合的多肽或者可切割的融合多肽，其中另一多肽融合于該多肽或其片段的N-末端或C-末端。融合的多肽是通過將編碼另一多肽的核酸序列(或其一部分)融合至編碼本發(fā)明一種植酸酶變體的核酸序列(或其一部分)來制備的。用于制備融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，而且包括連接編碼多肽的編碼序列，以便它們在同一閱讀框架中而且融合多肽的表達(dá)處于相同啟動(dòng)子和終止子的控制下。
“飼料”和“食物”分別指預(yù)期或適合分別被動(dòng)物或人食用、攝取、消化的任何天然的或人工的飲食、膳食或諸如此類或者此類膳食的組分。
本發(fā)明的植酸酶變體可以在體外或體內(nèi)發(fā)揮其效應(yīng)，即分別在攝入前或在機(jī)體的胃中。也可能是聯(lián)合作用。
根據(jù)本發(fā)明的植酸酶組合物通常包括至少一種本發(fā)明的植酸酶。
通常，植酸酶組合物是液態(tài)的或干燥的。
液態(tài)組合物不需要含有除植酸酶外的任何組分，優(yōu)選處于一種高度純化的形式。然而，通常也加入一種穩(wěn)定劑如甘油、山梨醇或單丙二醇。液態(tài)組合物還可以包括其他添加劑，例如鹽、糖、防腐劑、pH調(diào)節(jié)劑、蛋白質(zhì)、植酸鹽(植酸酶底物)。典型的液態(tài)組合物是基于水或油的粘合液。液態(tài)組合物在其選擇性沉淀后可以加至食物或飼料中。
干燥的組合物可以是噴霧干燥的組合物，在這種情況下組合物不需要含有除干燥形式的酶以外的任何組分。然而，通常干燥的組分就是所謂的顆?？赡芤子谕缡澄锘蝻暳辖M分混合，或者更優(yōu)選形成預(yù)混合料的組分。酶顆粒的顆粒大小優(yōu)選同混合物中其他組分的大小一致。這提供了將酶摻進(jìn)例如動(dòng)物飼料中的一種安全而且方便的方式。
在一高剪切力的攪拌機(jī)(例如Lodige)中利用團(tuán)聚技術(shù)制備團(tuán)聚顆粒，在此過程中一種填充劑材料同酶團(tuán)聚成顆粒。通過使載體材料的核心吸收酶/被酶包被來制備吸收顆粒。
典型的填充劑材料是鹽，例如硫酸鈉。其他填充劑為陶土、滑石、硅酸鎂鋁以及纖維素纖維。選擇性地，粘合劑，例如糊精也包括在團(tuán)聚顆粒中。
典型的載體材料是淀粉，例如木薯、玉米、馬鈴薯、大米和小麥。鹽也可以使用。
選擇性地，顆粒由包被混合物來包裹。此類混合物包括包被劑，優(yōu)選疏水包被劑，例如氫化棕櫚油和牛油，以及必要時(shí)加其他添加劑，例如碳酸鈣或陶土。
另外，植酸酶組合物可以含有其他替代物，例如生色劑、芳香化合物、穩(wěn)定劑、維生素、礦物質(zhì)、其他飼料或食物強(qiáng)化酶，即提高飼料/食物的營養(yǎng)性質(zhì)的酶，等。特別是對于所謂的預(yù)混合料就是如此。
“食物或飼料添加劑”是用來或適于添加到食物或飼料中的基本上純的化合物或多組分組合物。特別是其是一種物質(zhì)，其預(yù)期的用途是成為一種食物或飼料產(chǎn)品的組分或影響一種食物或飼料產(chǎn)品的任何特征。其由如上面對植酸酶組合物所說明的所組成。典型的添加劑通常包括一種或多種化合物，例如維生素、礦物質(zhì)或飼料強(qiáng)化酶以及適當(dāng)?shù)妮d體和/或賦形劑。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的植酸酶組合物額外包括有效數(shù)量的一種或多種飼料強(qiáng)化酶，特別是選自由α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶，特別是乳糖酶，其他植酸酶、β-葡聚糖酶，特別是內(nèi)-β-1,4-葡聚糖酶和內(nèi)-β-1,3(4)葡聚糖酶，纖維素酶、木糖苷酶、半乳聚糖酶，特別是阿拉伯半乳聚糖內(nèi)-1,4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖內(nèi)-1,3-β-半乳糖苷酶，內(nèi)葡聚糖酶，特別是內(nèi)-1,2-β-葡聚糖酶、內(nèi)-1,3-α-葡聚糖酶和內(nèi)-1,3-β-葡聚糖酶，果膠降解酶，特別是果膠酶、果膠酯酶、果膠裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸-α-鼠李糖苷酶、果膠酸鹽裂解酶和α-半乳糖醛酸苷酶，甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、木聚糖乙酰酯酶、蛋白酶、木聚糖酶、阿拉伯糖基木聚糖酶以及脂解酶例如脂肪酶、磷脂酶和角質(zhì)酶所組成組合的飼料強(qiáng)化酶。
本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑是在進(jìn)食前或進(jìn)食同時(shí)添加給單胃動(dòng)物。本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑優(yōu)選在進(jìn)食的同時(shí)添加給單胃動(dòng)物。在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，動(dòng)物飼料添加劑以顆?；蚍€(wěn)定液體的形式添加到膳食中。
在食物或飼料中植酸酶的有效數(shù)量是從大約10到20,000；優(yōu)選從大約10到15,000，更優(yōu)選從大約10到10,000，特別是從大約100到5,000，尤其是從大約100到大約2,000 FYT/kg飼料或食物。
本發(fā)明植酸酶的其他特定用途的實(shí)例是在大豆加工或在肌醇或其衍生物的生產(chǎn)中。
本發(fā)明還涉及用于降低動(dòng)物糞尿中植酸鹽水平的方法，其中給動(dòng)物喂養(yǎng)含有有效數(shù)量的本發(fā)明植酸酶的飼料。
本發(fā)明還包括在食物或飼料制品或添加劑的制備過程中對本發(fā)明植酸酶的應(yīng)用，即植酸酶僅在生產(chǎn)過程中發(fā)揮其植酸酶活性而在最終食物或飼料產(chǎn)品中沒有活性。該方面與例如調(diào)面和烘烤相關(guān)。
本發(fā)明涉及一種植酸酶變體，當(dāng)利用同P_lycii相應(yīng)的位點(diǎn)編號(hào)按照
圖1對齊排列時(shí)，同一模式植酸酶相比，其在至少下述位點(diǎn)之一處是改變的24；27；31；33；39；40；41；42；43；44；45；46；47；49；51；56；58；59；61；62；68；69；70；71；72；73；74；75；76；77；78；79；80；81；82；83；84；88；90；102；115；116；117；118；119；120；121；122；123；124；125；126；127；128；132；143；148；149；150；151；152；153；154；155；156；157；158；159；160；161；162；163；170f；170g；171；172；173；184；185；186；187；187a；190；191；192；193；194；195；198；199；200；201；201a；201b；201c；201d；201e；201f；202；203；203a；204；205；211；215；220；223；228；232；233；234；235；236；237；238；239；242；243；244；246；251e；253；256；260；264；265；267；270；271；272；273；274；275；276；277；278；279；280；283；285；287；288；292；293；302；304；332；333；334；335；336；337；338；339；340；341；342；343；348；349；352；360；362；364；365；366；367；368；369；370；371；372；373；374；375；376；383k；387；393；394；396；404；409；411；412；413；417；421；431.
從這些變體，我們預(yù)期改變的特征，優(yōu)選改變的活性特征。事實(shí)上，幾種變體已經(jīng)表現(xiàn)出此類改變的特征(見實(shí)驗(yàn)部分)。同上面相似，“改變”意指同模式植酸酶相比。“改變的活性特征”意指在至少一個(gè)植酸酶活性相關(guān)方面被改變，例如(非排他性列舉)pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性、pH適應(yīng)性、溫度適應(yīng)性、特異性活性(特別是同pH和溫度相關(guān)的)、底物特異性、底物切割模式、底物結(jié)合、位點(diǎn)特異性、磷酸鹽從玉米釋放的速度和水平、反應(yīng)率、植酸鹽降解率、釋放的磷酸鹽所達(dá)到的最終水平。
優(yōu)選的改變活性特征是改變的特異性活性，優(yōu)選提高的活性，而且優(yōu)選在pH 3、4、5或6下提高的活性；改變的pH或溫度適應(yīng)性；和/或改變的，優(yōu)選提高的熱穩(wěn)定性，例如如DSC所測定的提高的熔解溫度。
優(yōu)選的植酸酶變體是當(dāng)利用同P_lycii相應(yīng)的位點(diǎn)編號(hào)根據(jù)
圖1對齊排列時(shí)，同一模式植酸酶相比，其在至少下述位點(diǎn)之一處是改變的植酸酶變體43；44；47；51；58；62；78；80；83；88；90；102；143；148；153；154；186；187a；195；198；201e；204；205；211；215；220；242；244；251e；260；264；265；267；270；273；278；302；336；337；339；352；365；373；383k；404；417.
下述煙曲霉的變體組成一個(gè)亞群Q43L；Q270L；G273D,K；N336S；A205E；Y278H；Q43L+Q270L；Q43L+Q270L+G273D；Q43L+Q270L+G273D+N336S；G273K+A205E；G273K+A205E+Y278H(see EP 0897010)。
通常，如下可以推斷或鑒定出本發(fā)明的變體觀察根據(jù)
圖1的對齊排列，比較兩個(gè)序列，其中一個(gè)為一種有改變性質(zhì)的模式植酸酶，確定在相關(guān)位點(diǎn)/區(qū)域的氨基酸差異并將在相關(guān)位點(diǎn)處的氨基酸從模式植酸酶轉(zhuǎn)移到(置換)另一植酸酶序列。
本發(fā)明還涉及制備植酸酶變體的方法，其包括上面的方法，而且進(jìn)一步包括相應(yīng)DNA序列的推斷和合成、宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、宿主細(xì)胞的培養(yǎng)以及植酸酶變體的回收。
相關(guān)的位點(diǎn)/區(qū)域包括下面提到的同重要的植酸酶活性特征，如特異性活性、熱穩(wěn)定性、pH活性/穩(wěn)定性相關(guān)的那些。
本發(fā)明還涉及植酸酶變體(本文所定義的各種模式植酸酶)，其是通過上面概述的步驟可獲得的，優(yōu)選獲得的，并且其預(yù)期表現(xiàn)改變的特征/性質(zhì)，優(yōu)選表現(xiàn)例如改善的特異性活性等此類改變的特征。
至少擔(dān)子菌綱模式植酸酶P_lvcii和絨毛栓菌表現(xiàn)出一種高度特異性的活性(如本文實(shí)施例2的方法所確定的)。
這是預(yù)期性質(zhì)的一個(gè)實(shí)例，通過那種例如上面提到的推斷步驟，可以將其轉(zhuǎn)移至其他植酸酶，例如在
圖1中所列舉的其他植酸酶，特別是A_pediades和子囊菌綱植酸酶例如煙曲霉、無花果曲霉、共有植酸酶A。
因此，變體預(yù)期具有改變的特異性活性，特別是改善的特異性活性，特別是在低pH和/或高溫下，其中變體已經(jīng)在相關(guān)區(qū)域被改變，即(ⅰ)在指向活性位點(diǎn)裂口的氨基酸殘基；或者(ⅱ)在緊鄰這些活性位點(diǎn)殘基處的氨基酸殘基。優(yōu)選，緊鄰意指在距離活性位點(diǎn)殘基10以內(nèi)。
由pdb文件1IHP(布魯克海文數(shù)據(jù)庫(Brookhaven Database)條目18.03.98re lIHP，磷酸單酯酶的結(jié)構(gòu)，D.Kostrewa；或者如在自然結(jié)構(gòu)生物學(xué)(NatureStructural Biology)4,1997,185-190頁中所發(fā)表的)可以鑒定活性位點(diǎn)區(qū)域，利用來自分子模擬MSI，圣迭哥，加利弗尼亞的程序INSIGHTII并利用子命令，可以確定一個(gè)“活性位點(diǎn)外框”，其包括那些位置靠近催化殘基的氨基酸殘基，在無花果曲霉植酸酶中確定為H59、D339和R58(分別同隔孢伏革菌編號(hào)H71、D335和R70相對應(yīng))。一個(gè)“活性位點(diǎn)外框(10)”包括那些位于距離上述催化殘基10以內(nèi)的殘基。
距離H71和D335在10以內(nèi)的殘基如下(利用隔孢伏革菌編號(hào))41-47、68-77、115-118、120-126、128、149-163、185、191-193、199、243、270-271、273-275、277-279、288、332-343、364-367、369-375、394(“活性位點(diǎn)外框(10)”)。
優(yōu)選，還可以確定一個(gè)“底物結(jié)合外框”，其包括那些緊鄰底物結(jié)合位點(diǎn)因而預(yù)期可能同底物接觸的殘基。
如上面所描述可以通過在活性位點(diǎn)裂口(形成活性位點(diǎn)的表面的殘基)中接入一種植酸鈣鎂的糖類似物來推斷這些信息。如果一種沒有任何磷酸基團(tuán)的糖例如，α-D-葡萄糖(椅式構(gòu)象，由INSIGHTII程序提供的結(jié)構(gòu))接入活性位點(diǎn)裂口中，利用如下所示的一個(gè)固定距離，利用子命令以及距底物類似物10的距離可以得出指向活性位點(diǎn)裂口的殘基?；蛘?，化合物肌醇-1,4,5-三磷酸酯(布魯克海文數(shù)據(jù)庫文件1djx，肌醇-1,4,5-三磷酸酯)可以接入活性位點(diǎn)裂口中。然而，該化合物和葡萄糖或多或少是可疊加的。
以埃()計(jì)的距離為從α-D-葡萄糖6號(hào)位處的氧原子到H59的原子ND15.84R58的原子NH26.77R142的原子NH2 5.09N340的原子ND2 3.00H59的原子ND17.76R58的原子NH28.58。
(上述殘基的隔孢伏革菌編號(hào)分別為H71、R70、R155、N336、H71和R70。)這樣，將與底物接觸的殘基鑒定如下(隔孢伏革菌編號(hào))43-44；70-80；83-84；115；153；155-156；184；191-192；198-202；205；235；238；242；270；272-273；275-277；332-336；338；369；371(“底物結(jié)合外框(10)”)。
在一個(gè)或多個(gè)(1)活性位點(diǎn)外框或(2)底物結(jié)合外框處被改變的變體被強(qiáng)烈預(yù)期具有改變的特異性活性。這引起下面位點(diǎn)的聯(lián)合分組(仍為隔孢伏革菌編號(hào)和10的外框)41-47,68-80,83-84,115-118,120-126,128,149-163,184-185,191-193,198-201e,202-203,205,235-236,238-239,242-243,270-279,285,288,332-343,364-367,369-375,394.
優(yōu)選，如上所述利用
圖1的擔(dān)子菌綱模式植酸酶(隔孢伏革菌植酸酶為一種優(yōu)選的模式)來確定活性位點(diǎn)外框和底物結(jié)合外框。利用
圖1的對齊排列可推斷其他模式植酸酶的相應(yīng)變體。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，在子命令中利用了一個(gè)5的距離，因此確定具有一更有限大小的活性位點(diǎn)和底物結(jié)合外框，例如包括殘基43-44、69-74、117、125、155-156、159、274、332-340、370-374(距離H71和D3355)的一個(gè)活性位點(diǎn)外框，“活性位點(diǎn)外框(5)”。
通?；钚晕稽c(diǎn)外框和底物結(jié)合外框區(qū)域構(gòu)成用于選擇隨機(jī)誘變區(qū)域的基礎(chǔ)。優(yōu)選的隨機(jī)誘變區(qū)域的實(shí)例為區(qū)域69-74、332-340、370-374，待加入添加劑(一個(gè)5的距離)；以及區(qū)域57-62、142-146、337-343，待加入添加劑(一個(gè)10的距離)。
目前預(yù)計(jì)在這些位點(diǎn)的任意一個(gè)中的任何改變將產(chǎn)生一種具有改變的特征，例如改變的特異性活性的植酸酶。
上面的描述“在這些位點(diǎn)的任意一個(gè)中的任何改變”被認(rèn)為完全等價(jià)于列舉的每個(gè)位點(diǎn)以及每個(gè)置換，例如對于上面的亞群41-47如下41A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；42A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；
44A,C,D,E,E,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；45A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y,46A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；47A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y.
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中,改變的特異性活性預(yù)期來自下面的變體42S,G；43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；45D,S；47Y,F；51E,A；75W,F；78S,D；79G；80K,A；83I,Q；84Q,V；116S；118V,L；119E；120L；122A；123N,T；125S；126H,S；127Q,E；128A,T；151A,S；152G；153D,Y；154Q,D,G；157V；158D,A；1S9T；160A,S；161T,N；162N；163W；184Q,S；186A,E；198A,N；200G,V；201D；201a、201b、201c、201d、201e、201f中一個(gè)或多個(gè)——優(yōu)選全部的缺失；202S；205Q,E；235Y,L；238L,M；242P；270Y,A,L；271D；273D,K；275F,Y；278T,H；332F；336S；337T,Q；339V；340P,A；343A,S；364W,F；365V,L；366D,V；367K；368K；369I,L；370V；373S；374A；375H；376M；393V.
特別優(yōu)選的變體如下78S；79G；80A；83I,Q；84Q,V；198A,N；200G,V；201D；201a、201b、201c、201d、201e、201f中一個(gè)或多個(gè)——優(yōu)選全部的缺失；202S；205Q,E；235Y,L；238L,M；242P；273D；275F,Y。
其他特別優(yōu)選的變體如下43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；特別是43M,P；75W,F；80K；153D；184Q,S；270Y,A；332F；369I,L。
下面的變體是非常優(yōu)選的43L,G,N,V,A,I,T；78D；153Y；154G；270L；273D,K。雙重或三重變體(43L/270L)；(43L/270L/273D)；(43L/78D)以及(43L/153Y/154G)也是非常優(yōu)選的。其他優(yōu)選的變體是205E；278H；336S。
這些非常優(yōu)選的單重、雙重和三重變體優(yōu)選為可以在
圖1對齊排列的模式植酸酶的變體,特別是在
圖1中所列舉的特定模式植酸酶的變體。
至少已知共有植酸酶A具有一高的熱穩(wěn)定性。進(jìn)一步P_lvcii的熱穩(wěn)定性也是相當(dāng)高的。
這是一個(gè)能通過諸如上述的推斷步驟轉(zhuǎn)移到其他植酸酶,例如在
圖1中所列舉的其他植酸酶,特別是擔(dān)子菌綱植酸酶,例如P_lvcii和A_pediades中的所需特性的實(shí)例。
根據(jù)這個(gè)背景,下述變體預(yù)期具有改變的熱穩(wěn)定性，特別是提高的熱穩(wěn)定性39H,S；40L,N；43P；47Y,F；49P；51E,A；56P；58D；61IR；62V；80K；83A；84Y；172P；184P；195T；198A；204V；211L；223D；236Y；242P；246V；253P；264R；265Q；280A,P；283P；287A；292F,Y；293A；302R；304P；337S；348Y；387P；396R；409R；411K；412R；417E；421F,Y.
特別優(yōu)選下述具有改變的熱穩(wěn)定性的變體39S；40N；47Y,F；51A；83A；195T；204V；211L；242P；265A。
具有改變的熱穩(wěn)定性的變體還有如下42G；43T,L,G；44N；58K,A；59G；62I；69Q；75F；78D；79G；80A；81A,G；82T；83K,R；84I；88I；90R,A；102Y；115N；118V；122A；123Q,N；125M,S；126V,S；127N,Q；128S,A；143N,K；148V,I；154S；158D；170fH；170gA；171T,N；172N；173W,184S；186A；187A；187aS；193S；195V,L；198V；201E；201eT；202A,203aT；204A；211V,215P,A；220L,N；223H；228N；232T；322E；235T；236N；242S；244D；251eQ,E；256D；264I；260A,H；265A；267D；270G；271D；273K,D；278T,H；287T；293V；302H；337T,G；338I；339V,I；340A；352K；365A,S；366S；367A；369L；373S,A；374S；376M；383kE,Q；404G,A；411T；417R；431E.
預(yù)期能使植酸酶的熱穩(wěn)定性提高的本發(fā)明的其它構(gòu)想如下-參照前文引用的1IHP結(jié)構(gòu)并通過本文所概述的按
圖1之對齊排列進(jìn)行的轉(zhuǎn)移(A)在間隙位點(diǎn)引入脯氨酸，這些位點(diǎn)是能充滿脯氨酸特異性雙面夾角，和不阻礙氫原子結(jié)合網(wǎng)絡(luò)，而且未發(fā)現(xiàn)空間沖突的位點(diǎn)。
(B)填補(bǔ)孔洞通過置換內(nèi)部空腔中較大的殘基通?？梢允狗€(wěn)定性提高。
(C)半胱氨酸橋半胱氨酸橋通常將使蛋白質(zhì)具有更大的剛性，而且增加伸展能。
根據(jù)(A)至(C)的這些構(gòu)想預(yù)期具有改變的熱穩(wěn)定性變體進(jìn)一步還有27P、31Y、132F、132I、132L、184P、186P、190P、280P、343F、343I、343L、349P、362P以及(33C和24C)。
構(gòu)想(A)27P、184P、186P、190P、349P、362P。
構(gòu)想(B)343F,I,L、31Y、132F,I,L、273F。
構(gòu)想(C)33C/24C。
另一個(gè)預(yù)期的性質(zhì)是pH活性或穩(wěn)定性的改變，優(yōu)選穩(wěn)定性的改變，特別是在低pH下的改變，而且特別是提高，其可以通過按
圖1進(jìn)行對齊排列以及從pH適應(yīng)性提高的模式植酸酶傳遞至其他植酸酶來被傳遞-如上述。
預(yù)期能使植酸酶在低pH時(shí)的穩(wěn)定性提高的本發(fā)明其它構(gòu)想如下-參照前文引用的1IHP結(jié)構(gòu)并通過本文所概述的按
圖1之對齊排列進(jìn)行的轉(zhuǎn)移(D)表面電荷在低pH下的更好的分布來避免負(fù)或正電荷的聚集，并避免帶有相同電荷的殘基過于靠近。
(E)脫酰氨基作用暴露Q或N的表面同帶有負(fù)電荷的殘基緊密接觸。
在低pH下pH穩(wěn)定性/活性提高的植酸酶變體預(yù)期為39H；39Q；80A；203R；271N；51R；154S；185S；194S；194T；288L；288I；288F；360R；173Q,S；204Q,S；303K,S；81Q,E。
構(gòu)想(D)203R、271N、51R、185S；360R；173Q,S；204Q,S；303K,S；81Q,E。
構(gòu)想(E)154S；194S,T；288L,I,F。
對于(D)和(E)這些構(gòu)想的優(yōu)選的模式植酸酶為P_lycii。
實(shí)驗(yàn)證實(shí)最佳pH值降低的是子囊菌綱植酸酶變體80A，特別是煙曲霉的植酸酶和共有植酸酶A。
非常優(yōu)選的單重、雙重和三重變體為43L；(43L/270L)和(43L/270L/273D)。這些變體具有一改變的pH適應(yīng)性。它們優(yōu)選為在
圖1中所列舉的特定模式植酸酶的變體。
對于上面所列舉的所有優(yōu)選變體穩(wěn)定性優(yōu)選在高溫下被改變，即在50-100℃，特別是60-90℃的溫度范圍內(nèi)，更優(yōu)選在70-90℃的范圍內(nèi)。
活性優(yōu)選在適用于動(dòng)物胃腸道系統(tǒng)的相應(yīng)溫度范圍內(nèi)被改變，例如30-40℃，更優(yōu)選32-38℃，最優(yōu)選在35-38℃的范圍內(nèi)。
穩(wěn)定性優(yōu)選在低的pH下被改變，即在pH1.5-7，優(yōu)選2-6，更優(yōu)選3-5的范圍內(nèi)。
活性優(yōu)選在pH1.5-5.5，更優(yōu)選在pH2.5-4.5，還更優(yōu)選3-5的范圍內(nèi)被改變。
對于如上提到的改變的植酸酶特征的測試法是本領(lǐng)域眾所周知的，而且任何此類測試都可以用來比較植酸酶變體和模式植酸酶的性能。
在實(shí)施例2中給出了特異性活性的優(yōu)選測試法。在實(shí)施例3中給出了pH和溫度活性以及穩(wěn)定性的優(yōu)選測試法。熱穩(wěn)定性的更優(yōu)選測試法為實(shí)施例4的DSC方法。
WO 98/28409也公開了各種其他參數(shù)如位點(diǎn)特異性的測試。WO98/28409的所有測試法都為優(yōu)選的測試法。
當(dāng)然總體上所有這些測試法都可以在預(yù)期的pH值和溫度下進(jìn)行。
在附屬的權(quán)利要求中，詳細(xì)說明了基于本文明確公開的十三種模式植酸酶中五種的一些優(yōu)選的植酸酶變體。
用類似的方式可以很容易推斷出基于剩余八種明確公開的模式植酸酶的其他優(yōu)選變體，方法是對
圖1中每一相應(yīng)序列作上述改變。這些優(yōu)選的變體明確地包括在本發(fā)明中，而且它們很容易推斷，即如下衍生自Paxillus，優(yōu)選Paxillus involutus，其中又優(yōu)選CBS 100231株的模式植酸酶變體，優(yōu)選P_involtus-Al的植酸酶變體，其序列示于圖2中，上述的變體包括至少下列改變之一()24C；T27P；F31Y；I33C；R39H,S,Q；N40L；S42G；P43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y；Y44N；S45D；Y47F；A51E,R；A58D；K；Q61R；I62V；F75W；S78D；A80K；T81Q,E,G,A；R83A,I,Q,K；I84Y,Q,V；L88I；K90R,A；F102Y；S115N；D116S；V118L；P119E；F120L；A123N,T,Q；S125M；F126H,S,V；D127Q,E,N；A128T,S；A132F,I,L；I148V；D151A,S；S153D,Y；D154Q,S,G；D158A；S159T；A160S；T161N；()170fH；()170gA；S171N；H172P；N173Q,S；P184Q,S；Q185S；T186A,E,P；G187A；()187aS；T190P,A；D193S；N194S,T；M195T,V,L；A198N,V；G200V；D201E；()201eT；S202A；D203R,K,S；P203aV,T；Q204E,S,A,V；V205E；V211L；S215A,I；L220N；A223D,H；D233E；F235Y,L,T；N236Y；L237F；V238L,M；A242P,S；M244D；()251eE,Q；D253P；T256D；P260A,H；E264R,I；A265Q；A267D；G270Y,A,L；D271N； D273K；F275Y；T278H；Y280A,P；E283P；V287A,T；Q288L,I,F；Y292F；V293A；N302R,H；A304P；N336S；L337T,Q,S,G；M338I；V339I；A340P；S343A,F,I,L；F348Y；R349P；A352K；P360R；R362P；W364F；R365V,L,A,S；T366D,V,S；S367K,A；S368K；L369I；S373A；G374A,S；R375H；()383kQ,E；T387P；Q396R；G404A；L409R；T411K；L412R；E417R；F421Y.
衍生自Paxillus屬，優(yōu)選Paxillus involutus種，其中又優(yōu)選CBS 100231株的模式植酸酶變體，優(yōu)選P_involtus-A2的植酸酶變體，其序列示于圖3中，上述的變體包括至少下列改變之一P24C；I27P；F31Y；I33C；R39H,S,Q；N40L；S42G；P43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y；Y44N；S45D；Y47F；A51E,R；A58D,K；E61R；I62V；F75W；S78D；A80K；A81Q,E,G；R83A,I,Q,R,K；I84Y,Q,V；L88I；K90R,A；F102Y；S115N；D116S；V118L；P119E；F120L；A123N,T,Q；S125M；F126H,S,V；D127Q,E,N；A128T,S；V132F,I,L；D143N；I148V；D151A,S；S153D,Y；D154Q,S,G；D158A；A160S；T161N；()170fH；()170gA；S171N；R172P；N173Q,S；P184Q,S；Q185S；T186A,E,P；G187A；()187aS；T190P,A；D193S；N194S,T；M195T,V,L；A198N,V；G200V；E201D；()201eT；S202A；D203R,K,S；P203aV,T；Q204E,S,A,V；V205E；S211L,V；S215A,P；L220N；A223D,H；A232T；F235Y,L,T；N236Y；L237F；V238L,M；P242S；M244D；()251eE,Q；D253P；T256D；P260A,H；E264R,I；A265Q；A267D；G270Y,A,L；D271N；D273K；F275Y；T278H；Y280A,P；A283P；V287A,T；Q288L,I,F；Y292F；I293A,V；N302R,H；A304P；N336S；L337T,Q,S,G；M338I；V339I；340P,A；A343S,F,I,L；F348Y；R349P；A352K；P360R；R362P；W364F；L365V,A,S；T366D,V,S；S367K,A；S368K；V369I,L；S373A；R375H；()383kQ,E；T387P；Q396R；G404A；L409R；A411K,T；L412R；E417R；Y421F.
衍生自栓菌屬的一個(gè)種，優(yōu)選絨毛栓菌種，其中又優(yōu)選CBS 100232株的模式植酸酶變體，優(yōu)選絨毛栓菌的植酸酶變體，其序列示于圖4中，上述的變體包括至少下列改變之一R24C；T27P；L31Y；V33C；Q39H,S；S40L,N；S42G；M43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；Y44N；S45D；Y47F；A51E,R；A58D,K；S59G；Q61R；I62V；E75W；S78D；A80K；A81Q,E,G；R83A,I,Q,K；I84Y,Q,V；V88I；K90R,A；L102Y；D115N；V118L；T123N,Q；S125M；S126H,V；E127Q,N；A128T,S；A132F,I,L；D143N；V148I；S151A；S153D,Y；D154Q,S,G；A158D；A160S；N161T；()170fH；()170gA；S171N；S172P；N173Q,S；S184Q,P；E185S；A186E,P；G187A；()187aS；T190P,A；N194S,T；M195T,V,L；A198N,V；G200V；()201eT；S202A；D203R,K,S；P203aV,T；Q204E,S,A,V；V205E；Q211L,V；P215A；L220N；G223D,H；D233E；Y235L,T；N236Y；L237F；L238M；P242S；E244D；()251eE,Q；E253P；Q260A,H；D264R,I；A265Q；A267D；A270Y,L,G；D271N；D273K；F275Y；T278H；Y280A,P；V287A,T；Q288L,I,F；Y292F；I293A,V；A302R,H；N304P,A；N336S；Q337T,S,G；M338I；V339I；A340P；S343A,F,I,L；F348Y；N349P；A352K；P360R；R362P；F364W；L365V,A,S；V366D,S；K367A；I369L；A373S；A374S；R375H；()383kQ,E；Q387P；A396R；G404A；V409R；T411K；L412R；E417R；Y421F.
衍生自曲霉屬的一個(gè)種，優(yōu)選構(gòu)巢曲霉種，其中又優(yōu)選DSM 9743株的模式植酸酶變體，優(yōu)選構(gòu)巢曲霉的植酸酶變體，其序列示于
圖10中，上述的變體包括至少下列改變之一V24C；A27P；H39S,Q；V40L,N；G42S；Q43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y；Y44N；S45D；Y47F；S49P；E51A,R；V56P；H58D,K,A；E61R；V62I；S69Q；Y75W,F；E78D,S；S79G；K80A；S81Q,E,A,G；K82T；A83I,Q,K,R；Y84Q,V,I；A90R；D115N； D116S；T118V,L；I119E；F120L；E122A；N123T,Q；M125S；V126H,S；D127Q,E,N；S128A,T；F132I,L；K143N；I148V；S151A；S153D,Y；D154Q,S,G；A158D；S159T；A160S；E161T,N；K162N；F163W；G170fH；S1709A；()171N；()172P；K173Q,S；P184Q,S；E185S；I186A,E,P；D187A；G187aS；T190P,A；H193S；S194T；S198A,N,V；
R201f()(缺失至少201d、201e、201f之一，優(yōu)選全部)；A202S；D203R,K,S；E203aV,T；I204Q,E,S,A,V；I211L,V；P215A；L220N；D223H；K228N；E232T；N233E；I235Y,L,T；Y236N；L237F；M238L；S242P；M246V；E251eQ；A256D；E260A,H；L264R,I；Q270Y,A,L,G；S271D,N；S273D,K；Y275F；G278T,H；A280P；A287T；Q288L,I,F；F292Y；T293A,V；Q302R,H；P304A；N336S；S337T,Q,G；M338I；I339V；S340P,A；F343A,S,I,L；N349P；Q352K；S360R；Q362P；Y364W,F；A365V,L,S；A366D,V,S；S367K,A；W368K；T369I,L；G373S,A；A374S；R375H；A376M；E383kQ；A404G；T411K；L412R；E417R；F421Y；K431E.
衍生自曲霉屬的一個(gè)種，優(yōu)選土曲霉種，其中又優(yōu)選CBS 220.95株的模式植酸酶的變體，優(yōu)選土曲霉的植酸酶變體，其序列示于
圖12中，上述的變體包括至少下列改變之一G24C；V27P；H39S,Q；K40L,N；G42S；L43A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；Y44N；A45D,S；Y47F；S49P；Q51E,A,R；V56P；P58D,K,A；D59G；H61R；I62V；A69Q；S75W,F；H78D,S；S79G；K80A；T81Q,E,A,G；A83I,Q,K,R；Y84Q,V,I；A90R；E115N；E116S；T118V,L；P119E；F120L；R122A；N123T,Q；L125S,H；R126H,S,V；D127Q,E,N；L128A,T,S；F132I,L；H143N；V148I；T151A,S；D152G；A153D,Y；S154D,Q,G；H157V；E158D,A；S159T；A160S；E161T,N；K162N；F163W；H173Q,S；P184Q,S；E185S；G186A,E,P；S187A；A187aS；T190P,A；H193S；S194T；L195T,V；A198N,V；E200G,V；S201D,E；S201d()；T201e()；V201f()；G202S,A；D203R,K,S；D203aV,T；A204Q,E,S,V；V205E；V211L；A215P；L220N；D223H；Q228N；D232T；D233E；V235Y,L,T；N236Y；L237F；M238L；P242S；E244E；T251eE,Q；A260H；T264R,I；Q265A；N267D；L270Y,A,G；S271D,N；K273D；Y275F；H278T；G280A,P；V287A,T；Q288L,I,F；W292F,Y；A293V；Q302H；P304A；N337T,Q,S,G；L338I；V339I；S340P,A；W343A,S,F,I,L；N34 9P；A352K；S360R；S362P；Y364W,F；A365V,L,S；A366D,V,S；A367K；W368K；T369I,L；A373S；A374S；R375H；A376M；R383kQ,E；P404A,G；K411T；A417E,R；F421Y；A431E.
衍生自踝節(jié)菌屬的一個(gè)種，優(yōu)選嗜熱踝節(jié)菌種，其中又優(yōu)選ATCC 20186或ATCC 74338株的模式植酸酶的變體，優(yōu)選嗜熱踝節(jié)菌的植酸酶變體，其序列示于
圖13中，上述的變體包括至少下列改變之一H24C；V27P；H39S,Q；S40L,N；G42S；Q43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y；Y44N；S45D；F47Y；S49P；A51E,R；V56P；Q58D,K,A；N59G；K61R；I62V；Y75W,F；S78D；S79G；K80A；T81Q,E,A,G；E82T；L83A,I,Q,R,K；Y84Q,V,I；R90A；D116S；T118V,L；P119E；F120L；E122A；N123T,Q；M125S；I126H,S,V；Q127E,N；L128A,T,S；F132I,L；V148I；S151A；S153D,Y；D154Q,S,G；I157V；A158D；S159T；G160A,S；R161T,N；L162N；F163W；S170gA；D171N；K172P；H173Q,S；E184Q,S,P；E185S；G186A,E,P；D187A；T190P,A；T193S；G194S,T；S195T,V,L；V198A,N；E200G,V；D201E；S201d()；S201e(),T；S201f()；G202S,A；H203R,K,S；D203aV,T；A204Q,E,S,V；Q205E；Q211L,V；A215P；I220N,L；H223D；D228N；S232T；D233E；P235Y,L,T；Y236N；M237F；D238L,M；P242S；E244D；L246V；()251eE,Q；A256D；Q260A,H；Q264R,I；A265Q；Q270Y,A,L,G；S271D,N；G273D,K；Y275F；N278T,H；G280A,P；A287T；Q288L,I,F；F292Y；V293A；H302R；P304A；N336S；T337Q,S,G；M338I；T339V,I；S340P,A；A343S,F,I,L；N349P；A352K；S360R；E362P；Y364W,F；S365V,L,A；A366D,V,S；A367K；W368K；T369I,L；G373S,A；G374A,S；R375H；A376M；D383kQ,E；E404A；K411T；R417E；F421Y.
衍生自Thermomyces屬的一個(gè)種，優(yōu)選Thermomyces lanuginosus種，其中又優(yōu)選DBS 586.94株的模式植酸酶的變體，優(yōu)選T-lanuginosa的植酸酶變體，其序列示于
圖14中，上述的變體包括至少下列改變之一K24C；()27P；()31Y；()33C；R39H,S,Q；H40L,N；G42S；Q43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y；Y44N；S45D；F47Y；S49P；A51E,R；V56P；K58D,A；V62I；S69Q；Y75W,F；A78D,S；H79G；K80A；S81Q,E,A,G；E82T；V83A,I,Q,K,R；Y84Q,V,I；L88I；R90A；F102Y；D115N；N116S；T118V,L； R119E；F120L；E122A；E123N,T,Q；M125S；M126H,S,V；E127Q,N；S128A,T；F132I,L；E143N；V148I；A151S；S153D,Y；A154D,Q,S,G；I157V；A158D；S159T；A160S；E161T,N；F162N；F163W；R170fH；S170gA；K172P；D173Q,S；S184Q,P；E185S；E186A,P；T187A；G187aS；T190P,A；G193S；L194S,T；T195V,L；A198N,V；E200G,V；E201D；A201d()；P201e(),T；D202S,A；P203R,K,S；T2C3aV；Q204E,S,A,V；P205E；V211L；R215A,P；I220L,N；H223D；E232T；D233E；P235Y,L,T；L236Y,N；M238L；P242S；Q251eE；H256D；Q260H；M264R,I；A265Q；Y270A,L,G；T271D,N；D273K；Y275F；H278T；G280A,P；A283P；S287A；R288L,I,F；F292Y；V293A；G302R,H；P304A；N336S；T337Q,S,G；M338I；T339V,I；G340P,A；S343A,F,I,L；N349P；P360R；T362P；Y364W,F；A365V,L,S；A366D,V,S；S367K,A；W368K；T369I,L；A373S；A374S；R375H；A376M；E383kQ；R404A,G；R411K,T；K417E,R；F421Y；D431E.
衍生自毀絲菌屬的一個(gè)種，優(yōu)選嗜熱毀絲菌種，其中又優(yōu)選ATCC 48102或ATCC 74340株的模式植酸酶的變體，優(yōu)選嗜熱毀絲菌的植酸酶變體，其序列示于圖7中，上述的變體包括至少下列改變之一S24C；F31Y；H39S,Q；F40L,N；G42S；Q43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y；Y44N；S45D；Y47F；S49P；p51E,A,R；I56P；D58K,A；D59G；E61R；V62I；S69Q；A75W,F；L78D,S；K79G；R80K,A；A81Q,E,G；A82T；S83A,I,Q,K,R；Y84Q,V,I；R90A；D115N；E116S；T118V,L；R119E；T120L；Q122A；Q123N,T；M125S；V126H,S；N127Q,E；S128A,T；F132I,L；K143N；V148I；A151S；Q153D,Y；D154Q,S,G；H158D,A；S159T；A160S；E161T,N；G170fH；S170gA；T171N；F163W；V172P；R173Q,S；P184Q,S；E185S；T186A,E,P；G187aS；T190P,A；N193S；D194S,T；L195T,V；A198N,V；E200G,V；E201D；G201a()；P201b()；Y201c()；S201d()；T201e()；I201f()；G202S,A；D203R,K,S；D203aV,T；A204Q,E,S,V；Q205E；T211L,V；P215A；V220N,L；N223D,H；A232T；D233E；V235Y,L,T；A236Y,N；L237F；M238L；P242S；E244D；A251eE,Q；R256D；E260A,H；R264I；A265Q；Q270Y,A,L,G；S271D,N；K273D；Y275F；Y278T,H；P280A；T287A；Q288L,I,F；F292Y；V293A；()302R,H；P304A；N336S；D337T,Q,S,G；M338I；M339V,I；G340P,A；G343A,S,F,I,L；D349P；P352K；D360R；E362P；Y364W,F；A365V,L,S；A366D,V,S；S367K,A；W368K；A369I,L；A373S；A374S；R375H；I376M；E383KQ；E387P；G404A；M409R；T411K；L412R；E417R；F421Y；D431E.
本發(fā)明還提供了一種新型植酸酶，其衍生自Cladorrhinum的一個(gè)株，即C.Foecundissimum。相應(yīng)地，本發(fā)明還涉及一種具有植酸酶活性的多肽，而且其包括SEQ ID NO:2或其成熟部分(16-495位氨基酸)；或者一種與之至少70，更優(yōu)選75、80、85、90、95％同源的多肽；同源性意指相似性，優(yōu)選同一性，是通過利用程序GAP和本文上面所確定的設(shè)置來確定的。本發(fā)明涉及一種DNA構(gòu)建體，其編碼一種具有植酸酶活性的多肽，該DNA構(gòu)建體包括一種DNA分子，其包括SEQ ID NO:1或其20-70和207-1560號(hào)核苷酸；或者其20-70和207-1563號(hào)核苷酸；或者其65-70和207-1560號(hào)核苷酸；或者其65-70和207-1563號(hào)核苷酸；或者一種DNA構(gòu)建體或分子，其同這些核苷酸序列中任何一種至少70、75、80、85、90、95％同源；同源性意指相似性，優(yōu)選同一性，是通過利用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序，例如在GCG程序包中提供的GAP(威斯康星包的程序手冊，版本8,1996年8月，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組，575 Science Drive,Madison,Wisconsin，美國53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物學(xué)雜志(Joumal ofMolecular Biology),48,443-453)來確定的。利用GAP按照下列設(shè)置進(jìn)行DNA序列比較5.0的GAP形成補(bǔ)償和0.3的GAP延伸補(bǔ)償。本發(fā)明還涉及一種DNA構(gòu)建體，其在本文上面提到的條件下同上述DNA序列中的任何一個(gè)雜交。
實(shí)施例實(shí)施例1植酸酶活性檢測(FYT)利用下面的檢測可以測定植酸酶活性將10μl稀釋的酶樣品(稀釋于0.1M乙酸鈉、0.01％吐溫20,pH5.5)加入到在0.1M乙酸鈉、0.01％吐溫20、pH5.5中的5mM植酸鈉(Sigma)250μl(植酸鈉溶解后調(diào)節(jié)pH；預(yù)熱底物)中并于37℃溫育30分鐘。通過加入250μ1 10％TCA來終止反應(yīng)，并通過加入在100ml鉬酸鹽試劑(將在8mlH2SO4中溶解的2.5g(NH4)6Mo7O24·4H2O稀釋至250ml)中溶解的7.3gFeSO4500μl來測定游離磷酸根。在一96孔微量滴定板中測定200μl樣品在750nm處的吸光度。同時(shí)測定的有底物和酶的空白對照。還包括一個(gè)磷酸根的標(biāo)準(zhǔn)曲線(0-2mM磷酸根)。1FYT等于在給定的條件下每分鐘釋放1μmol磷酸根的酶的量。
實(shí)施例2對特異性活性的測試按照下述方法可以確定特異性活性利用一種高度純化的植酸酶樣品(預(yù)先在一SDS聚丙烯酰胺凝膠上檢測純度，表現(xiàn)出僅有一種組分存在)。
按照下述方法通過氨基酸分析確定在植酸酶樣品中的蛋白質(zhì)濃度在一抽真空的玻璃試管中于110℃將一份植酸酶樣品在6N HCl、0.1％苯酚中水解16小時(shí)。利用Applied Biosystems 420A氨基酸分析系統(tǒng)按照制造商的說明進(jìn)行操作對所獲的氨基酸定量。根據(jù)氨基酸的量可以計(jì)算出水解樣品中蛋白質(zhì)的總質(zhì)量-從而還有濃度。
以FYT為單位確定活性。一個(gè)FYT等于在pH5.5、37℃下每分鐘從植酸鹽(5mM植酸鹽)釋放1微摩爾無機(jī)磷酸根的酶的量；測試法描述于例如實(shí)施例1中。
特異性活性是FYT/mg酶蛋白的值。
實(shí)施例3對溫度和pH活性及穩(wěn)定性的測試溫度和pH活性及穩(wěn)定性可以按照下述的方法確定溫度適應(yīng)性(即溫度活性關(guān)系)通過在各種溫度下進(jìn)行實(shí)施例1的FYT測試(預(yù)熱底物)而定。
溫度穩(wěn)定性通過在檢測殘存活性前在各種溫度下于0.1M磷酸鈉、pH5.5中預(yù)溫育植酸酶而定。
pH穩(wěn)定性通過在檢測殘存活性前在40℃于pH3(25mM鹽酸甘油)、pH4-5(25mM乙酸鈉)、pH6(25mM MES)、pH7-9(25mM Tris-HCl)下溫育酶1小時(shí)而定。
pH適應(yīng)性(即pH活性關(guān)系)通過利用相同的緩沖液系統(tǒng)(50mM、在溶解底物時(shí)重新調(diào)節(jié)的pH)在各種pH下進(jìn)行測試。
實(shí)施例4DSC作為對熱穩(wěn)定性的一個(gè)優(yōu)選的測試熱穩(wěn)定性或熔解溫度，Tm，可以按照如下的方法確定在DSC中，測定樣品池相對于參考池保持恒速升溫所消耗的熱量。保持恒定的加熱速率(例如90℃/小時(shí))。將吸熱過程(熱消耗過程-例如酶/蛋白質(zhì)的展開)看作是為了保持恒速升溫而傳遞至該池的熱量的增加。
利用MicroCal的MC2-儀可以進(jìn)行DSC。在以90℃/h的掃描速率掃描至90℃前將池在20℃平衡20分鐘。裝載例如在0.1M乙酸鈉，pH5.5中的大約2.5mg/ml植酸酶樣品。
實(shí)施例5具有改變的活性特征的植酸酶變體按照在EP 98104858.0(EP-A-0897010)實(shí)施例2-3和5中所述制備煙曲霉的模式植酸酶(衍生自ATCC 13073株的一種野生型植酸酶)的變體，而且按照其實(shí)施例7中所述測定植酸酶活性。pH和溫度最佳值以及熔點(diǎn)按照在EP98113176.6(EP-A-0897985)實(shí)施例9和10中所描述的來測定。
在表1中，列舉了在pH5.0下具有改善的特異性活性的變體。表2列舉了在pH3.0下具有改善的相對活性的變體，而表3列舉了具有改善的熱穩(wěn)定性的變體(通過例如DSC測定的最佳溫度)。
表1
表2
表3
實(shí)施例6具有改變的活性特征的其它植酸酶變體按照在EP98113176.6(EP-A-0897985)，實(shí)施例4-8中所描述的來制備圖9中子囊菌綱共有序列“共有植酸酶”的變體。植酸酶活性，包括最佳pH和最佳溫度以及熔點(diǎn)，分別按照在其實(shí)施例9和10中所描述的來測定。
下面的表列舉出具有改變的活性特征的變體，即表4在pH6.0下具有改善的特異性活性的變體；表5具有改變的最佳pH的變體(所指的最佳pH是一個(gè)近似值，確定為在此pH下獲得最大植酸酶活性的那個(gè)pH值(選自由pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0組成的一組))；表6具有改善的熱穩(wěn)定性的變體(通過由差異掃描測熱法(DSC)所測定的熔點(diǎn)來表示)；以及表7具有改變的熱穩(wěn)定性(最佳溫度)的變體；“+”或“-”分別表示對高達(dá)1℃的最佳溫度的正或負(fù)影響；而“++”和“--”分別指對在1和3℃之間的最佳溫度的正或負(fù)影響。
表4
表5
表6
表8
實(shí)施例7Cladorrhinum foecundissimum植酸酶的克隆基本上按照在WO 98/28409中所描述的對編碼Cladorrhinumfoecundissimum CBS 427.97的植酸酶的DNA進(jìn)行了克隆，并對該酶進(jìn)行了分離和純化。
圖15顯示在pA2phy8中HindⅢ/XbaⅠ克隆的PCR產(chǎn)物的DNA序列。所克隆的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增自編碼Cladorrhinum foecundissimum CBS 427.97中phyA基因的基因組區(qū)域。推測的內(nèi)含子通過符合GT-AG構(gòu)想的剪切-連接位點(diǎn)處的雙下劃線標(biāo)明(R.Brethnach等，美國國家科學(xué)院進(jìn)展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75(1978)4853-4857頁)。用于克隆的限制性位點(diǎn)標(biāo)有下劃線。
根據(jù)SignalP V1.1的預(yù)測(Henrik Nielsen、Jacob Engelbrecht、StrenBrunak和Gunnar von Heijne“原核和真核信號(hào)肽的鑒定和它們的切割位點(diǎn)的預(yù)測”，蛋白質(zhì)工程(Protein Engineering)10,1-6(1997))，該酶的信號(hào)肽部分對應(yīng)于1-15位氨基酸，相應(yīng)地成熟的酶是16-495位氨基酸。
該酶表現(xiàn)出在pH6左右有最佳pH而在低pH(pH3)下沒有活性，但較高活性保持至pH7.5；因此，同無花果曲霉植酸酶相比其是一種更堿性的植酸酶。
在pH5.5下發(fā)現(xiàn)一個(gè)60℃左右的最佳溫度。因此，該植酸酶比無花果曲霉植酸酶熱穩(wěn)定性更好。
實(shí)施例8根據(jù)
圖1一種新型模式植酸酶的對齊排列利用上面引用的GAP版本8，按照3.000的空隙權(quán)和0.100的空隙長度權(quán)，將在實(shí)施例7中所公開的Cladorrhinum foecundissimum的植酸酶序列同
圖1中的13種模式植酸酶進(jìn)行比較。比較了完整的氨基酸序列。嗜熱毀絲霉植酸酶序列被證明是最同源的序列，表現(xiàn)出同C.foecundissimum序列70.86％的相似度。
仍利用GAP程序以及上面提到的參數(shù)，現(xiàn)在將植酸酶序列“C_foecundissimum”同“嗜熱毀絲霉”植酸酶進(jìn)行對齊排列——見
圖16。平均匹配為0.540；平均錯(cuò)配為-0.396；質(zhì)量(quanlity)445.2，長度505，比率0.914，空隙9個(gè)，相似百分比70.860，同一性百分比53.878。
在下一個(gè)步驟中，見
圖17，將C_foecundissimum粘貼(或者其可以簡單地寫)到
圖1的對齊排列上作為最底行，保證那些根據(jù)
圖16的對齊排列為相同(通過一個(gè)垂直線標(biāo)明)或相似(通過一個(gè)或兩個(gè)點(diǎn)標(biāo)明)的氨基酸殘基一一置于其上。在沿著序列的5個(gè)位置處C_foecundissimum序列包括“多余”的氨基酸殘基，
圖1的對齊排列沒有為其提供位置。在
圖17中，將這些多余的殘基轉(zhuǎn)移至下一行(但是它們能包括在多序列對齊排列中，而且按照前面在位點(diǎn)編號(hào)相關(guān)段落中所描述的進(jìn)行編號(hào)(利用符號(hào)a、b、c等))。
然后，基于
圖17很容易地推斷出C_foecundissimum植酸酶相應(yīng)的變體。一些實(shí)例在C_foecundissimum中通常表示為“80K,A”和“43T”的變體分別對應(yīng)于“K80A”和“Q43T”。
序列表<212>DNA<213>Cladorrhinum foecundissimum<220><221>內(nèi)含子<222>(71)..(126)<220><221>CDS<222>(20)..(70)<220><221>CDS<222>(127)..(1563)<220><221>信號(hào)肽<222>(20)..(64)<400>1aagcttgggc aaactcatc atg ctc atc ttg atg att cca ctg ttc agc tac 52Met Leu Ile Leu Met Ile Pro Leu Phe Ser Tyr1 5 10ctg gct gct gct tct ctg tgggttcatc ctttgcccct gtctcgatgt 100Leu Ala Ala Ala Ser Leu15taaaatacta aacatatttc accaga cgt gta ctc tcc cct cag cca gtg tcc 153Arg Val Leu Ser Pro Gln Pro Val Ser20 25tgt gac agc ccg gag ctt ggt tac caa tgc gac cag cag aca acg cac 201Cys Asp Ser Pro Glu Leu Gly Tyr Gln Cys Asp Gln Gln Thr Thr His30 35 40acc tgg ggt caa tac tca ccc ttc ttc tct gtc ccg tca gag atc tcc 249Thr Trp Gly Gln Tyr Ser Pro Phe Phe Ser Val Pro Ser Glu Ile Ser45 50 55cct tcc gtt cct gat ggc tgc cgc ctc acc ttc gcc caa gtt ctc tcc 297Pro Ser Val Pro Asp Gly Cys Arg Leu Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser60 65 70cgc cac ggc gcc cgc ttc cca acc ccg ggt aaa gcc gcc gcc atc tcc 345Arg His Gly Ala Arg Phe Pro Thr Pro Gly Lys Ala Ala Ala Ile Ser75 80 85 90gct gtc ctc acc aaa atc aaa acc tct gcc acc tgg tac ggt tcc gac 393Ala Val Leu Thr Lys Ile Lys Thr ser Ala Thr Trp Tyr Gly Ser Asp95 100 105ttt cag ttc atc aag aac tac gac tat gta ctt ggc gta gac cac ctg 441Phe Gln Phe Ile Lys Asn Tyr Asp Tyr Val Leu Gly Val Asp His Leu110 115 120acc gcg ttc ggc gag caa gaa atg gtc aac tcc ggc atc aag ttc tac 489Thr Ala Phe Gly Glu Gln Glu Met Val Asn Ser Gly Ile Lys Phe Tyr125 130 135cag cgc tac tcc tcc ctc atc cag aca gaa gac tcg gat acg ctc ccc 537Gln Arg Tyr Ser Ser Leu Ile Gln Thr Glu Asp Ser Asp Thr Leu Pro140 145 150ttc gtc cgc gcc tct ggc cag gaa cgc gtc atc gcc tcc gcc gag aac 585Phe Val Arg Ala Ser Gly Gln Glu Arg Val Ile Ala Ser Ala Glu Asn155 160 165 170ttc acc acc ggc ttc tac tcg gcc ctc tca gcc gac aag aac cct cct 633Phe Thr Thr Gly Phe Tyr Ser Ala Leu Ser Ala Asp Lys Asn Pro Pro175 180 185tcc tcc tta cca aga cca gaa atg gtc atc att tct gag gag cca aca 681Ser Ser Leu Pro Arg Pro Glu Met Val Ile Ile Ser Glu Glu Pro Thr190 195 200gcc aac aac acc atg cac cac ggc ctc tgc cgc tcc ttt gaa gat tcc 729Ala Asn Asn Thr Met His His Gly Leu Cys Arg Ser Phe Glu Asp Ser205 210 215acc acc ggc gac caa gcc caa gcg gaa ttc atc gcc gcc acc ttc cca 777Thr Thr Gly Asp Gln Ala Gln Ala Glu Phe Ile Ala Ala Thr Phe Pro220 225 230ccc atc acc gcc cgt ctc aac gcc caa ggt ttc aaa ggc gtc acc ctc 825Pro Ile Thr Ala Arg Leu Asn Ala Gln Gly Phe Lys Gly Val Thr Leu235 240 245 250tcc aac acc gac gtc cta tca cta atg gac ctc tgc ccc ttt gac acc 873Ser Asn Thr Asp Val Leu Ser Leu Met Asp Leu Cys Pro Phe Asp Thr255 260 265gtc gcc tac ccc ctt tcc tcc ctc acc acc acc tct tcc gtt tct gga 921Val Ala Tyr Pro Leu Ser Ser Leu Thr Thr Thr Ser Ser Val Ser Gly270 275 280ggc ggc aag tta tcc ccc ttc tgc tct ctt ttc act gcc agc gac tgg 969Gly Gly Lys Leu Ser Pro Phe Cys Ser Leu Phe Thr Ala Ser Asp Trp285 290 295aca atc tac gat tac ctc cag tcc cta ggg aaa tac tac ggt ttc ggc 1017Thr Ile Tyr Asp Tyr Leu Gln ser Leu Gly Lys Tyr Tyr Gly Phe Gly300 305 310ccc ggt aat tcc cta gct gcc acc cag ggg gta ggg tac gtc aac gag 1065Pro Gly Asn Ser Leu Ala Ala Thr Gln Gly Val Gly Tyt Val Asn Glu315 320 325 330ctt atc gcc cgc ttg atc cgt gct ccc gtc gta gat cac acg accg acc 1113Leu Ile Ala Arg Leu Ile Arg Ala Pro Val Val Asp His Thr Thr Thr335 340 345aac tct act ctt gat ggc gac gaa aaa acg ttt ccg ttg aac aga acg 1161Asn Ser Thr Leu Asp Gly Asp Glu Lys Thr Phe Pro Leu Asn Arg Thr350 355 360gtg tat gcg gat ttt tcc cat gat aat gat atg atg aat atc ctg act 1209Val Tyr Ala Asp Phe ser His Asp Asn Asp Met Met Asn Ile Leu Thr365 370 375gct ttg cgg ata ttc gag cat atc agt ccg atg gat aac acc act atc 1257Ala Leu Arg Ile Phe Glu His Ile Ser Pro Met Asp Asn Thr Thr Ile380 385 390ccg acc aac tat ggc cag aca gga gat gac ggg gtg aag gaa agg gat 1305Pro Thr Asn Tyr Gly Gln Thr Gly Asp Asp Gly Val Lys Glu Arg Asp395 400 405 410ttg ttc aag gtt agt tgg gcg gtg ccc ttt gct ggg agg gtg tac ttt 1353Leu Phe Lys Val Ser Trp Ala Val Pro Phe Ala Gly 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Ser Gly Gly Gly Lys Leu Ser Pro275 280 285Phe Cys Ser Leu Phe Thr Ala Ser Asp Trp Thr Ile Tyr Asp Tyr Leu290 295 300Gln Ser Leu Gly Lys Tyr Tyr Gly Phe Gly Pro Gly Asn Ser Leu Ala305 310 315 320Ala Thr Gln Gly Val Gly Tyr Val Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu Ile325 330 335Arg Ala Pro Val Val Asp His Thr Thr Thr Asn Ser Thr Leu Asp Gly340 345 350Asp Glu Lys Thr Phe Pro Leu Asn Arg Thr Val Tyr Ala Asp Phe Ser355 360 365His Asp Asn Asp Met Met Asn Ile Leu Thr Ala Leu Arg Ile Phe Glu370 375 380His Ile Ser Pro Met Asp Asn Thr Thr Ile Pro Thr Asn Tyr Gly Gln385 390 395 400Thr Gly Asp Asp Gly Val Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Val Ser Trp405 410 415Ala Val Pro Phe Ala Gly Arg Val Tyr Phe Glu Lys Met Val Cys Asp420 425 430Ala Asp Gly Asp Gly Lys Ile Asp Ser Asp Glu Ala Gln Lys Glu Leu435 440 445Val Arg Ile Leu Val Asn Asp Arg Val Met Arg Leu Asn Gly Cys Asp450 455 460Ala Asp Glu Gln Gly Arg Cys Gly Leu Glu Lys Phe Val Glu Ser Met465 470 475 480Glu Phe Ala Arg Arg Gly Gly Glu Trp Glu Glu Arg Cys Phe Val485 490 49權(quán)利要求
1.一種植酸酶變體，當(dāng)按照
圖1進(jìn)行對齊排列時(shí)，利用與P_lycii相應(yīng)的位點(diǎn)編號(hào)，與模式植酸酶相比，其在至少下列位點(diǎn)之一處被改變24；27；31；33；39；40；41；42；43；44；45；46；47；49；51；56；58；59；61；62；68；69；70；71；72；73；74；75；76；77；78；79；80；81；82；83；84；88；90；102；115；116；117；118；119；120；121；122；123；124；125；126；127；128；132；143；148；149；150；151；152；153；154；155；156；157；158；159；160；161；162；163；170f；170g；171；172；173；184；185；186；187；187a；190；191；192；193；194；195；198；199；200；201；201a；201b；201c；201d；201e；201f；202；203；203a；204；205；211；215；220；223；228；232；233；234；235；236；237；238；239；242；243；244；246；251e；253；256；260；264；265；267；270；271；272；273；274；275；276；277；278；279；280；283；285；287；288；292；293；302；304；332；333；334；335；336；337；338；339；340；341；342；343；348；349；352；360；362；364；365；366；367；368；369；370；371；372；373；374；375；376；383k；387；393；394；396；404；409；411；412；413；417；421；431.
2.一種植酸酶變體，當(dāng)按照
圖1進(jìn)行對齊排列時(shí)，利用與P_lycii相應(yīng)的位點(diǎn)編號(hào)，與模式植酸酶相比，其包括至少下列改變之一24C；27P；31Y；33C；39H,S,Q；40L,N；42S,G；43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；44N；45D,S；47Y,F；49P；51E,A,R；56P；58D,K,A；59G；61R；62V,I；69Q；75W,F；78D,S；79G；80K,A；81A,G,Q,E；82T；83A,I,K,R,Q；84I,Y,Q,V；88I；90R,A；102Y；115N；116S；118V,L；119E；120L；122A；123N,Q,T；125M,S；126H,S,V；127Q,E,N；128A,S,T；132F,I,L；143N；148V,I；151A,S；152G；153D,Y；154D,Q,S,G；157V；158D,A；159T；160A,S；161T,N；162N；163W；170fH；1709A；171N；172P；173Q,S；184Q,S,P；185S；186A,E,P；187A；187aS；190A,P；193S；194S,T；195T,V,L；198A,N,V；200G,V；201D,E；201a()；201b()；201c()；201d()；201e()；201f()；201eT；202S,A；203R,K,S；203aV,T；204Q,E,S,A,V；205E；211L,V；215A,P；220L,N；223H,D；228N；232T；233E；235Y,L,T；236Y,N；237F；238L,M；242P,S；244D；246V；251eE,Q；253P；256D；260A,H；264R,I；265A,Q；267D；270Y,A,L,G；271D,N；273D,K；275F,Y；278T,H；280A,P；283P；287A,T；288L,I,F；292F,Y；293A,V；302R,H；304P,A；332F；336S；337T,G,Q,S；338I；339V,I；340P,A；343A,S,F,I,L；348Y；349P；352K；360R；362P；364W,F；365V,L,A,S；366D,S,V；367A,K；368K；369I,L；370V；373A,S；374S,A；375H；376M；383kQ,E；387P；393V；396R；404A,G；409R；411K,T；412R；417E,R；421F,Y；431E.
3.權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)的植酸酶變體，其衍生自子囊菌綱植酸酶。
4.權(quán)利要求3的植酸酶變體，其衍生自曲霉屬植酸酶。
5.權(quán)利要求4的植酸酶變體，其中所述模式植酸酶為黑曲霉、無花果曲霉、構(gòu)巢曲霉、煙曲霉、土曲霉的菌株。
6.權(quán)利要求5的植酸酶變體，其中所述模式植酸酶為構(gòu)巢曲霉DSM9743；或者土曲霉以下菌株之任一CBS 116.46、DSM 9076、CBS220.95。
7.權(quán)利要求6的植酸酶變體，其中所述模式植酸酶為示于
圖10中的構(gòu)巢曲霉植酸酶序列；或者示于
圖12中的土曲霉植酸酶序列。
8.權(quán)利要求3的植酸酶變體，其中所述模式植酸酶為Thermomyceslanuginosus、嗜熱踝節(jié)菌或嗜熱毀絲霉的菌株。
9.權(quán)利要求8的植酸酶變體，其中所述模式植酸酶為Thermomyceslanuginosus CBS 586.94；或者嗜熱踝節(jié)菌以下菌株之任一ATCC 20186、ATCC 74338；或者嗜熱毀絲霉以下菌株之任一ATCC 34625、ATCC74340。
10.權(quán)利要求9的植酸酶變體，其中所述模式植酸酶為示于
圖14中的Thermomyces lanuginosus植酸酶序列；或者示于
圖13中的嗜熱踝節(jié)菌植酸酶序列；或者示于圖7中的嗜熱毀絲霉植酸酶序列。
11.權(quán)利要求3的植酸酶變體，其中所述模式植酸酶為子囊菌綱共有植酸酶序列。
12.權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)的植酸酶變體，其衍生自擔(dān)子菌綱植酸酶。
13.權(quán)利要求12的植酸酶變體，其中所述模式植酸酶為Paxillusinvolutus、絨毛栓菌、平田頭菇或Peniophora lycii的菌株。
14.權(quán)利要求13的植酸酶變體，其中所述模式植酸酶為絨毛栓菌CBS100232或Paxillus involutus CBS 100231。
15.權(quán)利要求14的植酸酶變體，其中所述模式植酸酶為圖4中的絨毛栓菌植酸酶序列或者圖2或3中的Paxillus involutus植酸酶序列。
16.權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)的植酸酶變體，其包括至少下述改變之一R24C；V27P；H39Q,S；L40N；G42S；Q43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W,Y；Y44N；A45D,S；F47Y；S49P；A51E,R；V56P；A58D,K；V62I；S69Q；Y75W,F；D78S；S79G；K80A；G81A,Q,E；K82T；K83A,I,R,Q；Y84Q,I,V；E90R,A；D115N；D116S；T118V,L；P119E；F120L；E122A；Q123N,T；L125S,M；V126H,S；N127Q,E；S128A,T；F132I,L；I148V；S151A；S153D,Y；S154Q,D,G；I157V；A158D；S159T:G160A,S；K161T,N；K162N；F163W；R170fH；Q171N；G173Q,S；S184P,Q； E185S；A186E,P；S187A；T190P,A；P193S；G194S,T；T195V,L；V198A,N；E200G,V；D201E；S201d()；E201e(),T；L201f()；優(yōu)選所有三個(gè)缺失；A202S；D203R,K,S；D203aV,T；V204Q,E,S,A；T211L,V；S215AP；L220N；D223H；T228N；T235Y,L；Y236N；L237F；M238L；S242P；I246V；K251eE,Q；H260A；I264R；N265Q,A；Q270Y,A,L,G；S271D,N；K273D；Y275F；H278T；A280P；T287A；Q288L,I,F；Y292F；A293V；H302R；P304A；N336S；G337S,T,Q；I339V；S340P,A； F343A,S,F,I,L；N349P；N360R；T362P；F364W；S365V,L,A；S366D,V；A367K；W368K；T369I,L；A373S:S374A；R375H；L376M；Q383kE；P404A,G；T411K；R417E；F421Y；A431E.
17.權(quán)利要求16的植酸酶變體，其模式植酸酶為衍生自曲霉的植酸酶，優(yōu)選衍生自無花果曲霉或黑曲霉。
18.權(quán)利要求17的植酸酶變體，其模式植酸酶為衍生自無花果(黑)曲霉NRRL 3135、黑曲霉ATCC 9142或黑曲霉ATCC 74337之任一的植酸酶。
19.權(quán)利要求18的植酸酶變體，其模式植酸酶為
圖11的無花果曲霉植酸酶序列。
20.權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)的植酸酶變體，其植酸酶變體包括至少下述改變之一A24C；V27P；H39,S,Q；L40N；G42S；Q43C,D,E,F,H,K,M,P,R,S,W,Y；Y44N；S45D；F47Y；S49P；E51A,R；L56P；K58D,A；D59G；I62V；S69Q；Y75W,F；S78D；S79G；K80A；S81A,G,Q,E；K82T；K83A,I,Q,R；Y84Q,V,I；V88K；A90R；F102Y；D115N；D116S；T118V,L；P119E；F120L；E122A；Q123N,T；L125S,M；V126H,S；N127Q,E；S128A,T；F132,I,L；S143N；I148V；S151A；S153D,Y；D154Q,S,G；I157V；A158D；S159T；G160A,S；E161T,N；K162N；F163W；G170fH；()17IN；N173Q,S；T172P；P184Q,S；E185S；S186A,E,P；E187A；T187aS；T190P,A；G194S,T；V195L,T；K198A,N,V；E200G,V；A201D,E；S201d()；Q201e(),T；L201f()；優(yōu)選所有三個(gè)缺失；G202S,A；D203R,K,S；E203aV,T；V204Q,E,S,A；A205E；L211V；A220L,N；H223D；T228N；E232T；D233E；V235Y,L,T；V236Y,N；L237F；M238L；C242P,S；T246V；Q251eE,Q；Q256D；H260A；K264R,I；K265Q,A；N267D；Q270Y,A,L,G； S271D,N；G273D,K；Y275F；Y278T,H；A280P；A287T；Q288L,I,E；F292Y；T293A,V；R302H；P304A；F332F；N336S；S337T,G,Q；M338I；V339I；S340P,A；F343A,S,I,L；N349P；E352K；S360R；K362P；Y364W,F；S365V,L,A；A366D,V,S；S367A,K；W368K；V369I,L；G373S,A；R375H；A376M；K383kQ,E；D404A,G；K411T；I393V；L412R；K417E,R；W421F,Y；G431E.
21.權(quán)利要求20的植酸酶變體，其衍生自曲霉屬植酸酶，優(yōu)選利用衍生自煙曲霉的模式植酸酶。
22.權(quán)利要求21的植酸酶變體，其模式植酸酶為衍生自煙曲霉以下菌株之任一的植酸酶ATCC 13073、ATCC 32722、ATCC 58128、ATCC26906或ATCC 32239。
23.權(quán)利要求22的植酸酶變體，其模式植酸酶為圖8的煙曲霉植酸酶序列。
24.權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)的植酸酶變體，其植酸酶變體包括至少下述改變之一G24C；V27P；H39S,Q；L40N；G42S；Q43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；Y44N；S45D；Y47F；S49P；E51A,R；V56P；D58K,A；DS9G；V62I；S69Q；Y75W,F；S78D；S79G；K80A；S81A,G,Q,E；K82T；A83I,Q,K,R；Y84,Q,I,V；A90R；D115N；D116S；T118V,L；F119E；P120L；E122A；N123Q,T；M125S；V126H,S；N127Q,E；S128A,T；Y132F,I,L；K143N；I148V；S151A；S153D,Y；D154Q,S,G；I157V；A158D；S159T；A160S；E161T,N；K162N；F163W；G170fH；S1709A；Q171N；H173Q,S；P184Q,S；E185S；G186A,E,P；S187A；G187aS；T190P,A；H193S；G194S,T；T195V,L；A198N,V；E200G,V；D201E；S201d()；E201e(),T；L201f()；優(yōu)選所有三個(gè)；G202S,A；D203R,K,S；D203aV,T；V204Q,S,A,E；L211VA215P；L220N；D223H,T228N；E232T；D233E；V235Y,L,T；Y236N；L237F；M238L；P242S；E244D；E2S1e,Q；A256D；H260A；R264I；Q265A；Q270Y,A,L,G；S271D,N；G273D,K；Y275F；Y278T,H；A280P；A287T；Q288L,I,F；F292Y；A293V；R302H；P304A；N336S；S337T,Q,G；M338I；I339V；S340P,A；F343A,S,I,L；N349P；A352K；S360R；E362P；Y364W,F；S365V,L,A；A366D,V,S；S367K,A；W368K；T369I,L；G373S,A；A374S；R375H；A376M；Q383kE；A404G；K411T；E417R；F421Y；A431E.
25.權(quán)利要求24的植酸酶變體，其模式植酸酶為一種子囊菌綱共有植酸酶。
26.權(quán)利要求25的植酸酶變體，其模式植酸酶為圖9的子囊菌綱共有序列“conphys”。
27.權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)的植酸酶變體，其植酸酶變體包括至少下述改變之一V24C；F27P；()31Y；F33C；D39H,S,Q；S40L,N；A42S,G；A43C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y；Y44N；T45D,S；Y47F；Q51E,A,R；K58D,A；K61R；162V；F75W；S78D；A80K；G81A,Q,E；R83A,I,Q,K；I84Y,Q,V；V88I；K90R,A；L102Y；D115N；D116S；V118L；P119E；F120L；L123N,T,Q；S125M；S126H,V；Q127E,N；A128S,T；T132F,I,L；E143N；V148I；S151A；S152G；S1S3D,Y；N154D,Q,S,G；D158A；S159T；A160S；T161N；()170fH；()170gA；()171N；H173Q,S；H172P；S184Q,P；E185S；S186A,E,P；L187A；()187aS；T190P,A；D193S；A194S,T；M195T,V,L；N198A,V；G200V；S201D,E ()201eT；S202A；D203R,K,S；P203aV,T；Q204E,S,A,V；T205E；I211L,V；P215A；L220N；Q223D,H；A232T；D233E；S235Y,L,T；N236Y；L237F；I238L,M；A242P,S；E244D；I246V；()251eE,Q；N256D；P260A,H；A264R,I；Q265A；E267D；G270Y,A,L；L332P；D271N；D273K；F275Y；T278H,Y280A,P；Y283P；V287A,T；Q288L,I,F；Y292F；I293A,V；E302R,H；P304A；L332F；N336S；Q337T,S,G；M338I；I339V；A340P；S343A,F,I,L；F348Y；N349P；S352K；P360R；R362P；W364F；V365L,A,S；T366D,V,S；S367K,A；R368K；L369I；T370V；S373A；A374S；R375H；S383kQ,E；T387P；A396R；G404A；L409R；T411K；L412R；E417R；Y421F.
28.權(quán)利要求27的植酸酶變體，其模式植酸酶為衍生自平田頭菇的植酸酶。
29.權(quán)利要求27的植酸酶變體，其模式植酸酶為衍生自平田頭菇CBS900.96的植酸酶。
30.權(quán)利要求29的植酸酶變體，其模式植酸酶為圖5的平田頭菇植酸酶序列。
31.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的植酸酶變體，其植酸酶變體包括至少下述改變之一F24C；V27P；L31Y；I33C；S39H,Q；N40L；G42S；P43A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y；Y44N；D45S；F47Y；E51A,R；E58D,K,A；T61R；V62I；W75F；S78D；A80K；R81Q,E,G,A；S82T；R83A,I,Q,K；Q84Y,V,I；V88I；K90R,A；A115N；D116S；L118V；P119E；F120L；N123T,Q；S125M；H126S,V；Q127E,N；T128A,S；M132F,I,L；G143N；V148I；A151S；D153Y；Q154D,S,G；D158A；S159T；S160A；T161N；()170fH；()170gA；S171NG172P；E173Q,S；Q184S,P；E185S；E186A,P；G187A；()187aS；T190P,A；N193S；N194S,T；M195T,V,L；N198A,V；V200G；D201E；()201eT；G202S,A；D203R,K,S；()203aV,T；E204Q,S,A,V；S205E；V211L；N215A,P；L220N；A223D,H；S232T；D233E；L235Y,T；T236Y,N；L237F；M238L；P242S；L246V；()251eE,Q；A260H；V264R,I；S265Q,A；E267D；Y270A,L,G；D271N；D273K；F275Y；G278T,H；P280A；A283P；T287A；Q288L,I,F；Y292F；V293A；G302R,H；A304P；N336S；T337Q,S,G；M338I；V339I；P340A；A343S,F,I,L；F348Y；N349P；A352K；E360R；R362P；W364F；V365L,A,S；D366V,S；S367K,A；L369I；S373A；G374A,S；()383kQ,E；E387P；A396R；G404A；V409R；E411K,T；L412R；E417R；Y421F；A431E.
32.權(quán)利要求31的植酸酶變體，其模式植酸酶為衍生自Peniophora lycii的植酸酶。
33.權(quán)利要求32的植酸酶變體，其模式植酸酶為衍生自PeniophoralyciiCBS 686.96的植酸酶。
34.權(quán)利要求33的植酸酶變體，其模式植酸酶為圖6中的Peniophoralycii植酸酶序列。
35.一種植酸酶多肽，其包括根據(jù)上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的植酸酶變體。
36.一DNA構(gòu)建體，其包括編碼根據(jù)權(quán)利要求1-34中任一項(xiàng)的植酸酶變體的DNA序列。
37.一種重組表達(dá)載體，其包括根據(jù)權(quán)利要求36的DNA構(gòu)建體。
38.一種宿主細(xì)胞，其由根據(jù)權(quán)利要求36的DNA構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求37的載體轉(zhuǎn)化。
39.一種用于制備植酸酶變體的方法，該方法包括在允許產(chǎn)生植酸酶變體的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求38的宿主細(xì)胞，以及從培養(yǎng)液中回收植酸酶。
40.一種飼料或食物，其包括至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-34中任一項(xiàng)的植酸酶變體。
41.一種用于制備根據(jù)權(quán)利要求40的飼料或食物的方法，其中將上述至少一種植酸酶變體添加至食物或飼料組分中。
42.一種組合物，其包括至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-34中任一項(xiàng)的植酸酶變體。
43.權(quán)利要求42的組合物，其適用于制備食物或飼料。
44.權(quán)利要求42-43中任一項(xiàng)的組合物，其為一種動(dòng)物飼料添加劑。
45.一種用于降低動(dòng)物糞尿中植酸鹽水平的方法，其包括用有效量的根據(jù)權(quán)利要求40的飼料或根據(jù)權(quán)利要求41可獲得的飼料來喂養(yǎng)動(dòng)物。
46.權(quán)利要求1-34中任一項(xiàng)的植酸酶變體；或者權(quán)利要求42-43中任一項(xiàng)的組合物用于從植酸酶底物釋放三價(jià)磷的應(yīng)用。
47.一種轉(zhuǎn)基因植物或植物部分，其能夠表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1-34中任一項(xiàng)的植酸酶變體。
全文摘要
植酸酶變體、其制備及應(yīng)用,當(dāng)按照
圖1進(jìn)行對齊排列時(shí),此類植酸酶變體與模式植酸酶相比在許多位點(diǎn)中的至少一處被改變。優(yōu)選的模式植酸酶為擔(dān)子菌綱植酸酶和子囊菌綱植酸酶,例如隔孢伏革菌屬植酸酶和曲霉屬植酸酶。優(yōu)選的植酸酶變體表現(xiàn)出改變的活性特征,例如改善的特異性活性和/或改善的熱穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)A01H5/00GK1309699SQ9980637
公開日2001年8月22日 申請日期1999年3月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月23日
發(fā)明者阿倫·斯文德森, 德克·科斯特魯瓦, 馬丁·萊曼, 路易斯·帕薩蒙蒂斯, 安德魯·湯姆斯奇, 阿道弗斯·范隆, 庫爾特·沃格爾, 馬庫斯·懷斯, 索倫·F·拉森 申請人:諾維信公司