專利名稱：用于植物中的誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于植物中的表達(dá)系統(tǒng)，特別是一種利用外源性化學(xué)藥劑作為控制機(jī)制的表達(dá)系統(tǒng)，和某些化學(xué)品作為所述控制劑的用途。
基因表達(dá)是通過蛋白編碼區(qū)域上游(5’)的區(qū)域控制的，通常稱為“啟動(dòng)子”。啟動(dòng)子可以是組成型的，組織特異性的，發(fā)育編程型的或誘導(dǎo)型的。
為了提高性能(如生產(chǎn)率或質(zhì)量)，農(nóng)作物的操縱需要植物組織中的外源或外源性基因的表達(dá)。因此，這種基因的操縱依賴于方法的有效性，以按照需要控制基因表達(dá)；例如，依賴于在植物中有效的適宜啟動(dòng)子的有效性和用途。具有各種不同啟動(dòng)子的選擇是有利的，以便對(duì)于特定的基因，構(gòu)建體，細(xì)胞，組織，植物或環(huán)境可以選擇最適宜的啟動(dòng)子。已知一系列啟動(dòng)子在植物中是有效的。
在某些情況中，特別有效的啟動(dòng)子是通過外源性化學(xué)誘導(dǎo)物的施用誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。在有或沒有施用于植物或種子的化學(xué)藥劑的情況下，這允許將在植物生長和發(fā)育的特殊階段控制特殊基因的表達(dá)，例如通過噴霧或使用已知的種子包被技術(shù)。有時(shí)，這被稱為基因“開關(guān)”。
在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的基因可能是引起其所期望的性能或表型的基因，或者誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以控制阻抑蛋白的表達(dá)，該阻抑蛋白抑制靶基因的表達(dá)，例如通過與靶基因的操縱序列上游相互作用以阻止基因的表達(dá)(例如在細(xì)菌中已知的tet和lac操縱基因/阻抑物系統(tǒng))。在另一選擇中，在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的基因可以表達(dá)與另一個(gè)蛋白相互反應(yīng)的蛋白，以抑制其活性，例如在芽孢桿菌RNA酶/芽孢桿菌RNA酶抑制劑系統(tǒng)中，在沒有芽孢桿菌RNA酶抑制劑的情況下，芽孢桿菌RNA酶將抑制或殺死細(xì)胞。
這種類型的基因開關(guān)在若干廣泛的應(yīng)用中是已知的。這些包括可逆的雄性不育的產(chǎn)生，即WO90/08830中舉例描述的，在雜交植物生產(chǎn)中高度期望的特征。這種啟動(dòng)子的其它應(yīng)用包括在種質(zhì)保護(hù)中，其中特殊農(nóng)作物，特別是轉(zhuǎn)基因植物的防范和自生自長植物的控制是必要的，及在WO94/03619描述的收獲前出芽的預(yù)防中。
許多生物體具有讓它們代謝化學(xué)制劑如醇或酮的機(jī)理，例如通過醇脫氫酶的生產(chǎn)。這些系統(tǒng)的啟動(dòng)子在基因開關(guān)中可能是有益的，因?yàn)閱?dòng)子可以通過靶醇或酮的存在而被誘導(dǎo)。
這樣的例子可以在真菌生物體構(gòu)巢曲霉中找到，僅僅當(dāng)它在有各種醇或酮的情況下生長時(shí)，構(gòu)巢曲霉表達(dá)通過基因alcA編碼的醇脫氫酶I(ADHI)?？梢酝ㄟ^alcR基因編碼的調(diào)節(jié)蛋白接替誘導(dǎo)并組成型地表達(dá)。在有誘導(dǎo)物(醇或酮)的情況下，調(diào)節(jié)蛋白激活alcA基因的表達(dá)。調(diào)節(jié)蛋白也在有誘導(dǎo)物的情況下刺激它自身的表達(dá)。這意味著ADHl酶的高水平是在誘導(dǎo)條件下(即當(dāng)醇或酮存在時(shí))產(chǎn)生的。相反地，alcA基因和其產(chǎn)物，ADHl，在沒有誘導(dǎo)物的情況下是不表達(dá)的。alcA的表達(dá)和酶的生產(chǎn)在有葡萄糖的情況下是阻抑的。
因而，alcA基因啟動(dòng)子是一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，是在有誘導(dǎo)物的情況下(即通過蛋白/醇或蛋白/酮的結(jié)合)通過alcR調(diào)節(jié)蛋白激活的。已經(jīng)克隆和測序了alcR和alcA基因(包括各自的啟動(dòng)子)(Lockington RA et al，1985，Gene，33137-149；Felenbok B et al，1988，Gene，73385-396；Gwynne et al，1987，Gene，51205-216)。
已經(jīng)在某些植物物種中研究了醇脫氫酶(adh)基因。在玉米或其它谷類中，它們是通過缺氧情況接通的。源自玉米的adh基因的啟動(dòng)子區(qū)域包含在缺氧情況下表達(dá)所必需的300bp的調(diào)節(jié)元件。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在任何植物中均沒有alcR調(diào)節(jié)蛋白的等效物。因此，基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)的alcR/alcA類型在植物中是未知的。植物細(xì)胞中alcR的組成表達(dá)沒有導(dǎo)致內(nèi)源性adh活性的激活。
WO93/21334描述了轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)，該植物包括作為基因開關(guān)的系統(tǒng)。此文獻(xiàn)特別描述了化學(xué)-誘導(dǎo)的植物基因表達(dá)盒，該盒包含有效連接到調(diào)節(jié)序列上的第一啟動(dòng)子，該調(diào)節(jié)序列編碼調(diào)節(jié)蛋白，且誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有效地連接到靶基因上，在有有效外源性誘導(dǎo)物的情況下，通過調(diào)節(jié)蛋白激活誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，由此誘導(dǎo)物的施用引起靶基因的表達(dá)。特別是，在構(gòu)建物中利用alcR/alcA系統(tǒng)。應(yīng)用于這種情況中的外源性化學(xué)誘導(dǎo)物包括那些通過Creaser et al.，J.Biochem.(1984)225，449-454描述的，如丁-2-一(乙基甲基酮)，環(huán)己酮，丙酮，丁-2-醇，3-氧代丁酸，丙-2-醇和乙醇。
為了農(nóng)業(yè)的目的，醇通常用作外源性化學(xué)誘導(dǎo)物。然而，這種化學(xué)藥劑通常是揮發(fā)性的，并因此在農(nóng)業(yè)環(huán)境下難以處理，因?yàn)榇罅炕瘜W(xué)劑可能在噴霧過程中丟失。
本發(fā)明提供農(nóng)用可水解的酯在植物基因表達(dá)控制中的用途，所述的控制通過誘導(dǎo)型啟動(dòng)子作用，該誘導(dǎo)型啟動(dòng)子需要激活，即可包含醇的外源性化學(xué)藥劑的存在，其中所述農(nóng)用酯的水解導(dǎo)致所述醇的生產(chǎn)。
特別是，農(nóng)用酯包含式(I)的化合物， 其中R1是低級(jí)烷基，低級(jí)鏈烯基或低級(jí)炔基，R2是有機(jī)基團(tuán)，這樣R2COOH是農(nóng)用酸。式(I)化合物的水解產(chǎn)生式(II)的醇 此處使用的術(shù)語“農(nóng)用”意為在不引起農(nóng)作物中植物毒性或土壤損壞的不可接受的水平下，可以將化合物應(yīng)用于特殊的土壤或農(nóng)作物情況。
此處使用的表達(dá)方式“低級(jí)烷基”包括C1-6烷基，優(yōu)選C1-4烷基，其可以是直鏈或支鏈。此處使用的表達(dá)方式“低級(jí)鏈烯基”和“低級(jí)炔基”分別包括C2-6鏈烯基和C2-6炔基，優(yōu)選C2-4鏈烯基和C2-4炔基，其可以是直鏈或支鏈。
將用于本發(fā)明的農(nóng)用酯，如式(I)的那些適宜地轉(zhuǎn)移到靶植物中，其中基因控制系統(tǒng)位于適當(dāng)?shù)奈恢煤?或在環(huán)境條件或有適宜催化部分，如酶或催化性抗體的情況下，在適于提供充足量活化醇的速率下，在所要求的時(shí)間內(nèi)和在植物所需要的部分中水解。這些可以依據(jù)所處理植物物種的自然特性，所表達(dá)的基因和酯施用的時(shí)間而變化。
酯，如式(I)的化合物是有利的，在于它們比相應(yīng)的醇易于處理。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些化合物可以依據(jù)基因激活產(chǎn)生所期望的效果。
應(yīng)當(dāng)在所需要的基因激活之前，在充足的時(shí)間內(nèi)施用該化合物，以使水解發(fā)生，且依據(jù)合理的因素，如需要激活植物生長階段。如果水解的速率相對(duì)較慢，應(yīng)用的時(shí)間可以早一些，以確保在需要基因激活的植物生長階段有充足的水解發(fā)生。有困難時(shí)，可以選擇更快速水解的酯。
可選擇地，可以在單獨(dú)的處理中，應(yīng)用具有不同水解速率的一個(gè)以上的酯。通過選擇具有不同水解速率的酯的結(jié)合，可以得到活化醇的有效的“緩慢釋放”，以便延長基因表達(dá)超過所期望的時(shí)期。這意味著可以避免化學(xué)藥劑的重復(fù)應(yīng)用且“單擊(one-shot)”處理是可能的。
式(II)的醇的特殊實(shí)施例包括甲醇，乙醇，丙-1-醇，丙-2-醇，丁-2-醇或丁-3-烯-2-醇。
適宜地，式(II)的醇是低級(jí)烷醇，其中烷基含有1-4碳原子且可以是支鏈的，或線性的。R1的優(yōu)選基團(tuán)包括乙基，正-丙基和正-丁基。
式(II)化合物特別優(yōu)選的例子是乙醇。
R2基團(tuán)的準(zhǔn)確特性是不重要的，只要在將其施用于特殊的靶植物時(shí)，在適宜的速率下，它產(chǎn)生農(nóng)用酸即可。可以使用常規(guī)方法，例如像G.Mitchell et al.，Pestic.Sci(1995)4449-58描述的，確定水解速率，且優(yōu)選地使用相對(duì)于整個(gè)植物系統(tǒng)的測試。在任何具體的例子中什么是適宜的將取決于各種因素，該因素包括受控制的基因表達(dá)的特性，基因在其中表達(dá)的具體植物和其他外部的條件。水解速率應(yīng)當(dāng)是充足的，以允許在化學(xué)誘導(dǎo)物應(yīng)用之后，在適宜的時(shí)間看到所期望的效果，例如，可逆的雄性不育。
然而，可以選擇R2，這樣生成的式(III)的酸 具有某些有益的農(nóng)用化學(xué)作用。特別是，它自身可以充當(dāng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物。例如，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多酸，包括3-羥丁酸，2-羥丁酸，丙酮酸和3-氧代丁酸可以充當(dāng)alcR/alcA系統(tǒng)(Creaser etal.，supra.)的誘導(dǎo)物。
R2的特殊例子包括任意取代的烷基，任意取代的環(huán)烷基，任意取代的鏈烯基，任意取代的炔基，任意取代的芳基或任意取代的雜環(huán)基。
此處使用的術(shù)語“烷基”包括直鏈或支鏈的烷基鏈，適宜地，包含最多可達(dá)10個(gè)碳原子，優(yōu)選1-6個(gè)碳原子。術(shù)語“鏈烯基”和“炔基”包括含有最多可達(dá)10個(gè)碳原子，優(yōu)選2-6個(gè)碳原子的不飽和直鏈或支鏈。術(shù)語“芳基”包括苯基和萘基。術(shù)語“雜環(huán)基”包括含有最多可達(dá)10個(gè)，優(yōu)選最多可達(dá)7個(gè)，最多可達(dá)3個(gè)的選自氧，硫或氮原子的環(huán)。這些環(huán)可以是單環(huán)或可以是稠環(huán)系統(tǒng)的形式，且這些在特性上可以是芳香的或非芳香的。術(shù)語“鹵”或“鹵素”包括氯，氟，溴和碘。術(shù)語“烷氧基”涉及與氧原子連接的上面定義的烷基。
適宜地，R2是任意取代的C1-10烷基，其可以是線性的或支鏈的。優(yōu)選的烷基R2是線性的且含有3-8個(gè)碳原子，特別是5個(gè)碳原子。
烷基，鏈烯基和炔基R2的適宜任意取代包括一種或多種選自鹵素，硝基，氰基，氧代，任意取代的芳基，任意取代的雜環(huán)基，OR3，C(O)pR3，S(O)mR3，OCOR3，-NR4C(O)pR3，＝NOH，NR5R6，C(O)NR5R6，C(O)NR3NR5R6，-CH＝NOR3，P(O)R7R8或P(O)OR7OR8，NR3CONR5R6，-N＝CR5R6，S(O)mNR5R6or-NR3S(O)mR4，-N＝NR3的基團(tuán)，其中每個(gè)R3，R4，R5，R6，R7和R8單獨(dú)地選自氫，烷基，鏈烯基，炔基，芳基或雜環(huán)基，其任何一種可以是由官能團(tuán)任意取代的，且就芳基和雜環(huán)基基團(tuán)來說，可以是由烷基，鏈烯基或炔基取代的；或R5和R6和與之相連的原子一起，可以另外形成一個(gè)環(huán)，該環(huán)可以是碳環(huán)或雜環(huán)基；p是1或2，且m是0，1，2或3。
此處使用的術(shù)語“官能團(tuán)”指的是包括鹵素，氰基，硝基，氧代，羥基，＝NOR11，C(O)pR11，OR11，s(O)mR11，NR12R13，C(O)NR12R13，OC(O)NR12R13，-CH＝NOR11，-NR12C(O)nR11，-NR11CONR12R13，-N＝CR12R13，S(O)mNR12R13或-NR12S(O)mR11其中R11，R12和R13單獨(dú)選自氫或任意取代的烴基，或，R12和R13一起形成任意取代的環(huán)，該環(huán)任意地包含另外的雜原子，如氧和氮或S(O)R14，其中p是1或2的整數(shù)，m是0或1-3的整數(shù)，且R14是氫或烷基。
烴基R11，R12和R13的適宜任意取代基包括鹵素，全鹵化烷基如三氟甲基，巰基，羥基，烷氧基，氧代，雜芳氧基，鏈烯氧基，炔氧基，烷氧基烷氧基，芳氧基(其中芳基可以是由鹵素，硝基或羥基取代的)，氰基，硝基，氨基，單-或二-烷氨基，烷酰胺基或S(O)pR14，其中m和R14如上面所定義。
烷基，鏈烯基或炔基R2上任意取代的例子是一個(gè)或多個(gè)選自氧代；烷氧基羰基特別是低級(jí)烷氧基羰基；氰基；鹵素，如氯，氟或溴；用氨基或單-或二烷基氨基或烷基，如甲基任意取代的苯基；OR3，其中R3是用鹵素或烷基任意取代的烷基或雜環(huán)基；S(O)mR11，其中m為0或2，R11是用烷基任意取代的烷基或苯基；NR5R6或C(O)NR5R6其中R5是氫，甲基或甲氧基乙基，R6是烷基如甲基，苯基或芐莖，其用鹵素，如氟或氯，烷基如甲基或三氟甲基或烷氧基羰基任意取代，其中烷基部分可以帶有另一烷氧基羰基，或R6是雜環(huán)基如用烷基和/或乙?；我馊〈泥玎夯?；-NR4C(O)pR3其中p是2，R3是烷基且R4是用烷氧基羰基如乙氧基羰基烷基任意取代的烷基；-NR3S(O)mR4，其中R3是氫，R4是用鹵素，如氯任意取代的苯基，且m是2；C(O)NR3NR5R6，其中R3和R5是氫，且R6是用鹵素或烷氧基，如甲氧基任意取代的苯基；S(O)mNR5R6，其中m是2，R5是氫且R6用一個(gè)或多個(gè)烷氧基羰基任意取代的烷基；雜環(huán)基如呋喃基，吡啶基，吡啶基或吡嗪基，三嗪基，其任何一種可以是用烷基，鹵素，三鹵甲基，苯基，鹵苯基，氰基或氧代任意取代的。
烷基，鏈烯基或炔基R2的特別適宜的取代基包括烷氧基羰基，特另是其中烷氧基是低級(jí)烷基；烷氧基且特別是二烷基乙縮醛形式的兩個(gè)烷氧基；氰基或任意取代的雜環(huán)基。優(yōu)選的取代基包括，但不限制于低級(jí)烷氧基羰基和二烷基乙縮醛。當(dāng)取代烷基與式(I)化合物中的R1相同時(shí)，烷氧基羰基和二烷基乙縮醛是特別令人感興趣的，因?yàn)樵谒獾臅r(shí)候，這些產(chǎn)生更多的式(II)誘導(dǎo)物化學(xué)制劑。
R2的特殊芳基是苯基。
環(huán)烷基，芳基和雜環(huán)基R2和上述烷基，鏈烯基或炔基R2上的芳基或雜環(huán)基的合適的任意取代基包括鹵素；鹵烷基；氰基；硝基，氨基或單-或二-烷基氨基；羥基；烷氧基，硫代烷基，烷基或烷氧基羰基，其中這些任意的烷基部分可以是用，例如一個(gè)或多個(gè)選自鹵素，烷氧基，氰基，烷氧基羰基，氨基，單-或二-烷基氨基，芳基或羧酸酯或其鹽或酯；環(huán)烷基；或雜環(huán)基的基團(tuán)任意取代的。
芳基或雜環(huán)基R2的特別合適的取代基包括烷氧基，特別是低級(jí)烷氧基，如甲氧基，烷基，特別是低級(jí)烷基，烷氧基羰基，特別是低級(jí)烷氧基羰基和鹵素。
式(I)化合物的特殊亞基是式(IA)的化合物 其中R1按照上面相對(duì)于式(I)定義的，n是2-4的整數(shù)，且R10是烷基，鏈烯基或炔基，其任何一種可以任意地用雜原子，環(huán)烷基，雜環(huán)基或芳基插入，或R10是化合價(jià)為n的環(huán)烷基或芳基。
特別是，R10是化合價(jià)為n的烷基或芳基。
式(I)特別優(yōu)選的化合物包括2-正-戊基-3-氧代丁酸乙酯(第49號(hào)化合物)；2-羧基庚-1，7-二酸(dioate)三乙酯(第53號(hào)化合物)；和2，4-二甲氧基苯甲酸乙酯(第60號(hào)化合物)。
式(I)化合物的例子是乙基酯，在表1中列出。
表1 式(I)化合物或者是已知的化合物，可以使用常規(guī)方法從已知化合物制備它們。
式(I)化合物可能在靶植物中化學(xué)水解，或者通過靶植物中天然存在的酶，或者通過基因工程技術(shù)引入，并在植物內(nèi)表達(dá)的酶，或通過合適的催化抗體或通過基因工程技術(shù)引入植物中，并在植物內(nèi)表達(dá)的酶促水解催化性抗體的催化活性部分。
適宜的酶包括，但不限制于，酯酶和脂酶。
使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以從四面體酯水解轉(zhuǎn)變狀態(tài)的類似物產(chǎn)生適宜的催化性抗體，例如，使用適宜的磷酸酯時(shí)，對(duì)于氯霉素前體-藥物酯的水解Ole K et al.，1998，J.Mol.Biol.，281501-511，對(duì)于可卡因的解毒，使用甲基酯的水解，Mets B etal.，1998，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，9510176-10181。
人們已經(jīng)進(jìn)一步研究了本發(fā)明化合物的代謝作用，這些研究的結(jié)果在以下的實(shí)施例中公開。不限制于機(jī)制的理由，相信例如本發(fā)明的代表性化合物，化合物53，是根據(jù)下列的流程圖代謝的 此代謝的產(chǎn)物是乙醇，其可以充當(dāng)上面描述的化學(xué)誘導(dǎo)物。
在另一方面中，本發(fā)明提供一種控制植物中靶基因表達(dá)的方法，其中所述的植物是用化學(xué)-誘導(dǎo)的植物基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的，該盒包含有效連接到調(diào)節(jié)序列上的第一啟動(dòng)子，該調(diào)節(jié)序列編碼調(diào)節(jié)蛋白，且誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有效地連接到靶基因上，該誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是在有醇，如上面定義的式(II)化合物的情況下，通過調(diào)節(jié)蛋白激活的，所述的方法包含將酯應(yīng)用于所述植物，該酯水解，形成所述的醇，如上面定義的式(I)化合物，以引起靶基因的表達(dá)。
適宜地，如上面所描述的，調(diào)節(jié)序列編碼alcR蛋白，且誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是alcA啟動(dòng)子序列。
在需要或期望的地方，還可以轉(zhuǎn)化植物，這樣它表達(dá)或超表達(dá)酶或催化性抗體或它的催化活性片段，其水解式(I)的化合物以形成式(II)化合物。
在某些情況中，優(yōu)選必須將那些在沒有酶或其它部分的情況下為非活性的酶被工程化到植物中，因?yàn)樗鼈儍H僅在靶轉(zhuǎn)化種子中有效力。
可以將編碼水解酶，抗體或抗體片段的核酸序列包括在構(gòu)建體中，該構(gòu)建體包含有效連接到誘導(dǎo)型啟動(dòng)子上的調(diào)節(jié)蛋白和/或靶基因，或它們可能存在于用于共-轉(zhuǎn)化植物的獨(dú)立的構(gòu)建體上。然而這種系統(tǒng)是新的。
因而，在另一個(gè)方面中，提供一種植物基因表達(dá)系統(tǒng)，包含(i)有效連接到調(diào)節(jié)序列上的第一啟動(dòng)子，該調(diào)節(jié)序列編碼調(diào)節(jié)蛋白，(ii)有效連接到靶基因上的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，該誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是在有前面定義的式(I)有效外源性誘導(dǎo)物的情況下，通過調(diào)節(jié)蛋白激活的，借此誘導(dǎo)物的施用引起靶基因的表達(dá)；和(iii)編碼蛋白的序列，該蛋白在另一啟動(dòng)子的控制下影響酯，如式(I)化合物水解為相應(yīng)的醇，該另一啟動(dòng)子允許其在植物組織中的表達(dá)。
靶基因可以包含任何需要引入植物中的基因，以便如上所述修飾它的特性。靶基因可以是外源性植物基因或外源基因，且可以是單一基因或一系列基因。靶基因序列編碼至少部分功能蛋白或反義序列。
可以使用任何適宜于靶植物或植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法，包括用含有重組Ti質(zhì)粒的根瘤土壤桿菌感染，電穿孔，細(xì)胞和原生質(zhì)體的微量注射，微粒轉(zhuǎn)化和花粉管轉(zhuǎn)化。然后，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以在適宜的情況中，再生到整個(gè)植物中，在整個(gè)植物中，新的細(xì)胞核材料穩(wěn)定地結(jié)合到基因組中?？梢杂眠@種方法得到轉(zhuǎn)化的單子葉和雙子葉植物。
可以生產(chǎn)的基因修飾植物的實(shí)施例包括農(nóng)作物，谷類，水果和蔬菜如canola，向日葵，煙草，甜菜，棉花，大豆，玉米，小麥，大麥，稻米，高粱，番茄，芒果，桃，蘋果，梨，草莓，香蕉，甜瓜，馬鈴薯，胡蘿卜，生菜，卷心菜，洋蔥。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包含本發(fā)明基因表達(dá)系統(tǒng)的植物細(xì)胞。該基因表達(dá)系統(tǒng)可以通過轉(zhuǎn)化穩(wěn)定地結(jié)合到植物基因組中。本發(fā)明還提供包含這種細(xì)胞的植物組織或植物，和從其衍生的植物或種子。
此方法中所使用的式(I)化合物的優(yōu)選實(shí)施例是上面描述的那些。
本發(fā)明農(nóng)用酯，如式(I)化合物適宜以農(nóng)用組合物，與稀釋劑或載體組合的形式應(yīng)用。這種組合物形成本發(fā)明的又一方面。
制劑中農(nóng)用酯的濃度優(yōu)選大約5％wt/wt或更少的濃度。在大約2％-5％wt/wt的濃度時(shí)是優(yōu)選的。
適宜的載體或稀釋劑對(duì)于技術(shù)人員來說是顯而易見的，并將依據(jù)所使用式(I)化合物的特殊特性而變化。例如，如果式(I)化合物是油類，它可能需要乳化劑的存在以便使它霧化在水溶液中。在本領(lǐng)域中乳化劑是熟知的，特殊的例子是部分水解的聚乙酸乙烯酯(PVA)或吐溫TM。
有機(jī)溶劑或稀釋劑，如丙酮也可以存在。
因此，優(yōu)選的組合物包含農(nóng)用酯，如式(I)的化合物，乳化劑，如PVA和稀釋劑，如水。組分的相對(duì)量在相當(dāng)大的程度上取決于各種組分相互之間的混溶性。然而適宜地，在組合物中存在的乳化劑的量為1-5％w/w，優(yōu)選大約2.5％w/w。
因而，本發(fā)明制劑的實(shí)施例包括下列制劑11.5％本發(fā)明化合物(例如化合物53)2.5％PVA余量的水制劑21.5％本發(fā)明化合物(例如化合物53)5％丙酮0.05％吐溫-20TM余量的水制劑33.0％本發(fā)明化合物(例如化合物53)2.5％PVA余量的水制劑43.0％本發(fā)明化合物(例如化合物53)
5％丙酮/水0.05％吐溫-20TM余量的水可能使用的可選擇組合物與在我們的與此有關(guān)的英國專利申請第9902236.0中描述的那些相似。特別是，該組合物將包含組分(a)農(nóng)用酯，如式(I)的化合物；(b)聚乙氧基化的C10-C20醇或三硅氧烷聚乙氧基化物和(c)稀釋劑。
稀釋劑(c)可以是，例如，水。
上述制劑的組分(b)優(yōu)選，聚乙氧基化的油醇，月桂醇，硬脂醇或鯨蠟醇。
更優(yōu)選含有0-35，更優(yōu)選2-20的平均摩爾環(huán)氧乙烷含量的聚氧化乙烯-油醇。最優(yōu)選聚氧化乙烯-(2)-油醇，氧化乙烯-(10)-油醇或氧化乙烯-(20)-油醇。組分(b)，然而，優(yōu)選聚氧化乙烯-(20)-油醇(括號(hào)中的數(shù)字表示每分子的平均氧化乙烯含量)。商業(yè)上使用的這種產(chǎn)品為BRIJ92TM，BRIJ97TM和BRIJ98TM。
優(yōu)選地，制劑中的組分(b)為大約0.5％wt/wt或更小的濃度。優(yōu)選大約0.2％wt/wt-0.5％wt/wt的濃度。
在可選擇實(shí)施方案中，制劑包括組分(b)，氫或甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物。特別是，組分(b)是甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物。該甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物每分子優(yōu)選含有4-12，最優(yōu)選8的平均摩爾氧化乙烯含量。商業(yè)上應(yīng)用的這種產(chǎn)品是SILWET 77TM(SIL WET是Witco的商標(biāo))。
優(yōu)選地，甲基封端的三硅氧烷聚乙氧基化物為大約0.5％wt/wt或更小的濃度。優(yōu)選大約0.2％wt/wt-0.5％wt/wt的濃度。
制劑中的組分(c)優(yōu)選90％-98％wt/wt的濃度。
可以包括在本制劑中的其它添加劑包括分散劑，抗菌化合物，也可以加入潤濕劑化合物和抗-蒸發(fā)劑。
現(xiàn)在，通過實(shí)施例特殊描述本發(fā)明。
實(shí)施例1在土壤生長植物上測試化學(xué)制劑在預(yù)篩選hydroponiv溶液之后，將化合物用于本測試中，該測試是在暖房的1 1/2”盆中，在4星期大的alccat煙草純合系的30種植物上進(jìn)行的。將葉子的樣品從植物上摘下來作為“未誘導(dǎo)”的對(duì)照。在200μl250mM Tris pH8.0中粉碎葉片，離心并回收上清液，在4℃過夜貯存?；衔锶芙庠诤?.05％吐溫-20的50％丙酮，50％dH2O200mg/ml溶液，然后以1/10稀釋以配制2％的溶液。除非有其它規(guī)定，將5ml溶液施用于作為根浸液一式兩份處理的每2種植物的土壤中。22和44小時(shí)之后，除去葉子的樣品，按照上述提取并在4℃貯存上清液。通過使用Boehringer Mannheim CAT ELISA試劑盒分析樣品的cat蛋白定量，并通過Bradford測定確定總蛋白水平。結(jié)果在表2中列出，其中1CAT值等于0-5000ng/g的檢出，2等于5001-10,000ng/g的檢出，3等于10,001-15,000ng/g。
實(shí)施例2土壤生長植物的另一處理在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，化合物溶解在含0.05％吐溫-20的50％丙酮，50％dH2O中形成200mg/ml溶液。將這些稀釋成1.5％和0.1％的溶液。從幼苗上摘下葉子的樣品作為“未誘導(dǎo)”的對(duì)照。在200μl 250mM TrispH8.0中粉碎葉片，離心，回收上清液并在4℃過夜貯存。將5ml溶液應(yīng)用于作為根浸液一式兩份處理的每2種植物的土壤中。22和65小時(shí)之后，從所處理的每兩種植物中除去葉子的樣品，按照實(shí)施例1中的描述提取，并在4℃貯存上清液。通過使用Boehringer MannheimCAT ELISA試劑盒分析樣品的分解代謝蛋白定量，并通過Bradford測定確定總蛋白水平。所測試的化合物和結(jié)果在表3中列出，其中CAT值代表的值在表2中列出。
表3
實(shí)施例3誘導(dǎo)之后開關(guān)表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程的確定為了確定在酯誘導(dǎo)之后，alc開關(guān)表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程，將若干化合物施用于暖房1 1/2pots中的5星期大的alccat煙草純合系30株植物的葉片或土壤上。將化合物溶解在含0.05％吐溫-20的50％丙酮，50％dH2O中以形成150mg/ml或50mg/ml溶液。然后以1/10稀釋形成1.5％或0.5％的溶液。從幼苗上摘下葉子的樣品作為“未誘導(dǎo)”的對(duì)照。在干冰/乙醇中冷凍葉片，并在-70℃貯存。施用5ml溶液作為根浸液或葉噴霧劑，至8株植物。在各時(shí)間點(diǎn)除去葉的樣品，并在干冰/乙醇中冷凍，在-70℃貯存。當(dāng)收獲和貯存所有的樣品后，在200μl250mM Tris pH8.0中提取葉片，離心，回收上清液并在4℃過夜貯存。通過使用Boehringer Mannheim CAT ELISA試劑盒分析樣品的cat蛋白定量，并通過Bradford測定確定總蛋白水平。所測試的化合物和結(jié)果在表4，5，6，7，8，9和10中列出。CAT單位在上面的實(shí)施例1中列出，每個(gè)連續(xù)的數(shù)字代表遞增的5,000ng/g的范圍。以陰影形式表示的結(jié)果是在不同批次，但是同樣的試驗(yàn)中獲得的。
表4
表5
表6
表7
表8
表9
表10
這些結(jié)果顯示，與醇對(duì)照，可以通過使用本發(fā)明的酯改變誘導(dǎo)的時(shí)間進(jìn)程。因此，酯的適宜選擇將引起有利的誘導(dǎo)形式。
權(quán)利要求
1.農(nóng)用可水解的酯在植物基因表達(dá)控制中的用途，所述的控制通過誘導(dǎo)型啟動(dòng)子完成，該誘導(dǎo)型啟動(dòng)子需要在可包含醇的外源性化學(xué)藥劑的存在下激活，其中所述農(nóng)用酯的水解導(dǎo)致所述醇的產(chǎn)生。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中農(nóng)用可水解的酯是式(I)的化合物 其中R1是低級(jí)烷基，R2是有機(jī)基團(tuán)，其可以在水解的時(shí)候，產(chǎn)生化學(xué)式為R2COOH的農(nóng)用酸；且所述的啟動(dòng)子需要式(II)醇的存在以用于它的激活。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中的式(II)化合物是低級(jí)烷醇，其中的烷基R1含1-4個(gè)碳原子且可以是支鏈的，或線性的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或權(quán)利要求3的用途，其中R2是任意取代的烷基，任意取代的環(huán)烷基，任意取代的鏈烯基，任意取代的炔基，任意取代的芳基或任意取代的雜環(huán)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其中R2是任意取代的C1-10烷基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其中R2是用烷氧基羰基或二烷基乙縮醛取代的。
7.根據(jù)前述任何一項(xiàng)權(quán)利要求的用途，其中式(I)化合物是2-正-戊基-3-氧代丁酸乙酯；2-羧基庚-1，7-二酸三乙酯；或2，4-二甲氧基苯甲酸乙酯。
8.一種控制植物中靶基因表達(dá)的方法，其中所述的植物是用化學(xué)-誘導(dǎo)的植物基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的，該盒包含有效連接到調(diào)節(jié)序列上的第一啟動(dòng)子，所述調(diào)節(jié)序列編碼調(diào)節(jié)蛋白以及有效地連接到靶基因上的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，該誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在有醇的情況下通過調(diào)節(jié)蛋白激活，所述的方法包含將農(nóng)用可水解的酯施用于所述植物，該酯水解的時(shí)候產(chǎn)生所述的醇，以便引起靶基因的表達(dá)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中的調(diào)節(jié)序列像前面描述的那樣編碼alcR蛋白，且誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是alcA啟動(dòng)子序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的方法，其中轉(zhuǎn)化植物，以便它表達(dá)或超表達(dá)酶或催化性抗體或其催化活性片段，其可水解的酯以形成所述的醇。
11.一種植物基因表達(dá)系統(tǒng)，包含(i)有效連接到調(diào)節(jié)序列上的第一啟動(dòng)子，該調(diào)節(jié)序列編碼調(diào)節(jié)蛋白，(ii)有效連接到靶基因上的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，在有前面定義的有效外源性誘導(dǎo)物醇的情況下，通過調(diào)節(jié)蛋白激活誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，借此醇的施用引起靶基因的表達(dá)；和(iii)編碼蛋白的序列，該蛋白在另一啟動(dòng)子的控制下，完成上述酯的水解，該另一啟動(dòng)子允許其在植物組織中的表達(dá)。
12.一種包含權(quán)利要求11的基因表達(dá)系統(tǒng)的植物細(xì)胞。
13.包含權(quán)利要求12的細(xì)胞的植物組織或植物，和從其衍生的植物或種子。
14.一種農(nóng)業(yè)組合物，包含與稀釋劑或載體組合的權(quán)利要求1定義的農(nóng)用酯。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的組合物，其中農(nóng)用酯是權(quán)利要求2中定義的式(I)化合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或權(quán)利要求15的組合物，其進(jìn)一步包含乳化劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的組合物，其中的乳化劑是PVA。
全文摘要
農(nóng)用可水解的酯,如式(I)的化合物在植物基因表達(dá)控制中的用途,其中在申請中定義了式(I)化合物中的R
文檔編號(hào)A01N37/02GK1338000SQ99815969
公開日2002年2月27日 申請日期1999年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月1日
發(fā)明者E·D·克拉克, E·J·T·克里斯塔, I·杰普森, J·A·M·派尼 申請人:辛甄塔有限公司