專(zhuān)利名稱(chēng)：：選擇具有親本印記性狀的動(dòng)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及育種動(dòng)物或屠宰動(dòng)物的選擇方法，所述動(dòng)物具有需要的基因型或潛在的表型特征，尤其是與肌肉重量和/或脂肪沉積相關(guān)的特征。對(duì)于家畜的育種計(jì)劃目前主要集中于農(nóng)用性能性狀(farmperformancetrait)和胴體(carcass)品質(zhì)。本發(fā)明將使諸如繁殖成功性，乳汁產(chǎn)量，瘦肉/脂肪比率，多育性，生長(zhǎng)速率和飼養(yǎng)效率這樣的性狀有本質(zhì)的改善。相對(duì)簡(jiǎn)單的性能測(cè)試數(shù)據(jù)為這些改善打下了基礎(chǔ)，并且推測(cè)所選性狀受大量基因影響，每個(gè)基因只有小的作用(無(wú)窮小基因模型)。在該領(lǐng)域正發(fā)生著一些重要變化。首先，一些育種組織的育種目標(biāo)除了“傳統(tǒng)”的生產(chǎn)性狀外開(kāi)始包括了肉的質(zhì)量品質(zhì)。其次，有越來(lái)越多的事實(shí)表明現(xiàn)在所用新的育種目標(biāo)性狀可能涉及相對(duì)較大的作用(已知為大基因)，這與一直依賴(lài)的無(wú)窮小模型相反。現(xiàn)代的DNA技術(shù)提供了開(kāi)發(fā)這些主要基因的機(jī)會(huì)，并且這一技術(shù)是提高肉的品質(zhì)的非常有希望的途徑，特別在直接的肉的品質(zhì)評(píng)估對(duì)育種動(dòng)物是不現(xiàn)實(shí)的情況下。對(duì)于其它的性狀如瘦肉/肥肉比率，生長(zhǎng)速率和飼養(yǎng)效率，現(xiàn)代DNA技術(shù)也非常有效。這些性狀在活體動(dòng)物中也不易測(cè)量。一些主要基因的研究數(shù)據(jù)最早用分離分析，也就是沒(méi)有任何DNA標(biāo)記的信息時(shí)獲得。之后分子水平的研究用來(lái)檢測(cè)這些基因在遺傳圖譜上的定位。在應(yīng)用上，除了對(duì)于很大作用的等位基因，需要DNA研究解析在具有經(jīng)濟(jì)上重要性的大多數(shù)性狀的遺傳本質(zhì)。DNA標(biāo)記可用于對(duì)負(fù)責(zé)質(zhì)量性狀如皮毛顏色的基因或等位基因，并且也可用于檢測(cè)對(duì)數(shù)量性狀如生長(zhǎng)速率，IMF等有實(shí)質(zhì)性影響的基因或等位基因。在這種情況下，這一途徑稱(chēng)為QTL(數(shù)量性狀基因座)繪圖，其中QTL包含動(dòng)物核酸基因組的至少一部分，在該部分中定位有能影響(在所說(shuō)動(dòng)物或其后代中)所述數(shù)量性狀的遺傳信息。DNA水平上的信息不僅能幫助在一個(gè)群體中固定特異性主要基因，還可以輔助已選擇的數(shù)量性狀的選擇。表型數(shù)據(jù)外的分子信息可以提高選擇的準(zhǔn)確性和選擇應(yīng)答。肉的品質(zhì)或胴體品質(zhì)的提高不僅僅是改變嫩度或夾花肉等的性狀水平，也可增加肉質(zhì)的一致性。主要基因的存在為提高肉的品質(zhì)提供了一個(gè)良好的機(jī)會(huì)，因?yàn)樗沟孟蝾A(yù)定目標(biāo)前進(jìn)時(shí)步子更大。其次，它可有助于減少變異，原因是我們可在我們的產(chǎn)品中固定相關(guān)的基因。另一方面，主要基因的選擇可允許對(duì)特定的市場(chǎng)有所不同。研究正在幾個(gè)物種中展開(kāi)，尤其是豬、羊、鹿和牛。尤其是，對(duì)肉類(lèi)產(chǎn)品精密的選擇將獲得一些家畜物種達(dá)到極端好的肉類(lèi)(肌肉)和瘦肉的動(dòng)物。這些年對(duì)引起這些表型的基因定位和克隆變得可行，并且向更加高效的標(biāo)記輔助選擇，靶向藥物開(kāi)發(fā)(性能增強(qiáng)的產(chǎn)品)和轉(zhuǎn)基因方向發(fā)展。ryacodine受體(Fuji等，1991；MacLennan和Phillips，1993)和肌抑制素(myostatin)(Grobet等，1997；Kambadur等，1997；McPherron和Lee，1997)的突變顯示可以分別引起在豬和牛內(nèi)肌肉過(guò)度生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)肌肉度和/或脂肪沉積有主要影響的基因在豬內(nèi)定位于第4號(hào)染色體上(Andersson等，1994)，在羊內(nèi)定位于第18號(hào)染色體上(Cocket等，1996)。然而，盡管已成功鑒別了數(shù)量性狀基因座，但是目前這些相關(guān)信息在商業(yè)育種程序中應(yīng)用有限。本領(lǐng)域內(nèi)的許多工作人員總結(jié)出很有必要鑒別QTL中的特定基因。這是一個(gè)巨大的任務(wù)，因?yàn)镼TL區(qū)一般相對(duì)較大并且可能含有許多基因。從許多基因中鑒別相關(guān)基因因此仍是農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物的重大困難。本發(fā)明提供了選擇具有需要的基因型或潛在表型特征的動(dòng)物的一種方法，包括測(cè)試所述動(dòng)物中是否存在親本印記的質(zhì)量或數(shù)量性狀基因座(QTL)。本文中家畜被定義為已經(jīng)選擇的或來(lái)源于已選擇過(guò)的具有需要的基因型或潛在表型的動(dòng)物。家畜提供了基因和表型差異的豐富的資源，傳統(tǒng)的飼養(yǎng)包括選擇具有目的基因型或潛在表型特征的動(dòng)物或其后代。這個(gè)選擇程序在上世紀(jì)因?yàn)槊系聽(tīng)栠z傳定律的掌握和應(yīng)用而有所促進(jìn)。家畜育種程序中的一個(gè)主要問(wèn)題是生殖能力和生產(chǎn)性狀之間在遺傳上是負(fù)比例關(guān)系。這樣的例子包括牛(高的牛奶產(chǎn)量導(dǎo)致牛比較瘦)，在禽類(lèi)中(肉禽的蛋產(chǎn)量很低，蛋禽通常肌肉生長(zhǎng)低)，在豬中(高產(chǎn)的母豬一般很肥且肉相對(duì)少)或在羊中(高產(chǎn)的育種羊胴體品質(zhì)差，反之亦然)。本發(fā)明提供了不同性狀的親本印記特點(diǎn)的知識(shí)，使得可以選擇如針對(duì)例如與肌肉生產(chǎn)或生長(zhǎng)連鎖的親本印記QTL是純合的種公畜品系；因此這種性狀的選擇在母畜品系中嚴(yán)格性可較低，有利于繁殖品質(zhì)。遺傳上或親本印記的現(xiàn)象從沒(méi)應(yīng)用于家畜的選擇中，以前也從沒(méi)考慮將這種難懂的遺傳特征用于育種應(yīng)用程序中。本發(fā)明提供了一個(gè)育種程序，其中本文證實(shí)的所需性狀的親本印記性狀的知識(shí)得到一育種程序，如使用修飾的動(dòng)物模型的BLUP程序。這增加了育種價(jià)值評(píng)估的精確性并且和傳統(tǒng)育種方法相比提高了選擇速度。到現(xiàn)在，親本印記的性狀在傳統(tǒng)的BLUP程序中的評(píng)估中的作用都被忽略。象本發(fā)明提供的，掌握并利用所需性狀的親本特點(diǎn)可使得即使沒(méi)有DNA測(cè)試也可進(jìn)行親本印記的選擇。例如，提供了具有親本印記特征的基因的選擇以助于提高一致性；“好的或需要的”等位基因的純合(最終)親代可以將它們傳給所有的后代，而不管其它的親本等位基因如何，并且所有后代也會(huì)表達(dá)所需的親本等位基因。結(jié)果是產(chǎn)生更加一致的后代。等位基因此處指來(lái)自母本的令人感興趣的或有利的等位基因或來(lái)自父本的有相對(duì)作用的等位基因。例如在肉類(lèi)動(dòng)物如豬中，與肉的品質(zhì)性狀(如肌肉中脂肪或肌肉質(zhì)量)連鎖的等位基因可以固定在母畜品系中，而和降低的背部肥肉連鎖的等位基因可固定于種公畜品系。其它理想的結(jié)合是例如雌性動(dòng)物中的多產(chǎn)和/或乳汁生產(chǎn)與雄性動(dòng)物中的生長(zhǎng)速率和/或肌肉質(zhì)量相組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有需要的遺傳或潛在表型特征的家畜的選擇方法，包括測(cè)試來(lái)自所述動(dòng)物的核酸樣品是否存在親本印記的數(shù)量性狀基因座(QTL)。核酸樣品可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法從動(dòng)物的不同部分得到。傳統(tǒng)上核酸測(cè)試的樣品來(lái)于血液樣品或皮膚或粘膜表面樣品，從其它組織來(lái)的樣品也同樣可用，尤其是精液樣品，卵母細(xì)胞或胚胎樣品都可使用。在這種樣品中，可以用本領(lǐng)域已知的方法，如本領(lǐng)域中已知的雜交或核酸擴(kuò)增或測(cè)序技術(shù)測(cè)定特異核酸即DNA或RNA的存在和/或其序列。本發(fā)明提供了檢測(cè)一個(gè)樣品中是否存在核酸的方法，其中QTL或其相關(guān)的等位基因與親本印記現(xiàn)象相關(guān)，例如所述方法可確定所述QTL的來(lái)自于父本或母本的等位基因能否在所述動(dòng)物中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。家養(yǎng)動(dòng)物育種計(jì)劃的目標(biāo)是通過(guò)優(yōu)化遺傳組成而提高動(dòng)物性能。本質(zhì)上這種促進(jìn)提高是通過(guò)增加影響目的性能的基因的最有利的等位基因的頻率來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這些基因指QTL。直到九十年代初，遺傳上的改進(jìn)是通過(guò)用生物統(tǒng)計(jì)的方法實(shí)現(xiàn)的，而不是利用QTL的分子生物學(xué)知識(shí)。從九十年代開(kāi)始，以及最近基因組學(xué)的發(fā)展，識(shí)別決定一感興趣性狀的QTL是可行的。本發(fā)明提供了親本印記的QTL的識(shí)別和使用方法，而QTL可以通過(guò)數(shù)量性狀基因座繪圖來(lái)選擇動(dòng)物。同樣，遺傳上或親本印記的知識(shí)從沒(méi)用于選擇家畜，過(guò)去認(rèn)為將這種不確定的遺傳特征用于實(shí)際育種程序是不可行的。例如Kovacs和Kloting(Biochem.Mol.Biol.Int.44399-405)在沒(méi)有提到和建議親本印記方法的情況下，發(fā)現(xiàn)在雌性大鼠中一性狀的連鎖，這一性狀并不在雄性大鼠中出現(xiàn)，暗示這種性別特異性可能位于染色體的某一區(qū)域，當(dāng)然就排除了親本印記，而親本印記是指一親本的印記性狀優(yōu)選地而不是性別決定地在他或她的后代中表達(dá)的現(xiàn)象。本發(fā)明也提供了通過(guò)用遺傳標(biāo)記的連鎖分析而進(jìn)行的親本印記QTL最初定位，以及親本印記基因及其相應(yīng)突變的實(shí)際鑒定。親本印記的QTL的分子學(xué)知識(shí)對(duì)育種提供了更有效的手段。親本印記QTL分子學(xué)知識(shí)在育種程序中的應(yīng)用包括標(biāo)記輔助的分離分析以鑒定目的群體中功能上不同的親本印記QTL等位基因的分離；通過(guò)提高選擇的準(zhǔn)確性，選擇強(qiáng)度或通過(guò)利用已了解的親本印記現(xiàn)象降低代與代間隔而在品系內(nèi)進(jìn)行的標(biāo)記輔助選擇(MAS)以提高遺傳應(yīng)答；標(biāo)記輔助的漸滲(MAI)以有效地將有用的親本印記QTL等位基因從供體轉(zhuǎn)移到受體群體；利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)識(shí)別的親本QTL的遺傳工程和育種家畜的遺傳修飾，利用靶向藥物研究開(kāi)發(fā)所述QTL的分子知識(shí)研制提高性能的產(chǎn)品。本發(fā)明人通過(guò)兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)來(lái)確定QTL親代印記的實(shí)際應(yīng)用。第一個(gè)實(shí)驗(yàn)是在前述的Pietrain×大白豬雜種中進(jìn)行的，數(shù)據(jù)可能性在父本(僅父本等位基因表達(dá))或母本(僅母本等位基因表達(dá))印記模型下進(jìn)行計(jì)算，并和傳統(tǒng)的“孟德?tīng)枴盦TL模型的數(shù)據(jù)可能性進(jìn)行比較。結(jié)果令人驚奇地表明QTL確實(shí)是父本表達(dá)的，從F1代的母豬中遺傳下來(lái)的QTL等位基因(Pietrain或大白豬)對(duì)于F2代后代的胴體品質(zhì)或數(shù)量無(wú)任何作用?？梢钥闯霎?dāng)測(cè)試父本表達(dá)的QTL的存在時(shí)獲得非常顯著的lodscores，然而在研究通過(guò)母豬遺傳的染色體時(shí)沒(méi)有QTL的分離的證據(jù)。所有的性狀都有相同的趨勢(shì)表明相同的印記基因負(fù)責(zé)不同性狀上觀察到的作用。表1報(bào)道了通過(guò)遺傳父本QTL等位基因分選的F2后代最大可能(ML)表型平均值。第二個(gè)實(shí)驗(yàn)，是在野豬(WildBoar)×大白豬雜種中進(jìn)行的，通過(guò)測(cè)試印記作用的存在的統(tǒng)計(jì)模型用第2號(hào)染色體圖譜進(jìn)行身體組成，脂肪，肉的品質(zhì)和生長(zhǎng)性狀的QTL分析。清楚的證據(jù)表明父本表達(dá)的QTL位于2p染色體的最末端(圖2；表1)。QTL的明顯的父本表達(dá)通過(guò)最小均方而證實(shí)，所述最小均方根據(jù)父本遺傳的等位基因的起源群體而分為兩類(lèi)(表1)。對(duì)于一特定的父本印記的QTL，標(biāo)記輔助分離分析、選擇(MAS)和漸滲作用(MAI)的實(shí)施，都可通過(guò)和QTL連鎖的遺傳標(biāo)記，和QTL不穩(wěn)定平衡連鎖的遺傳標(biāo)記或用QTL內(nèi)的實(shí)際相應(yīng)突變來(lái)操作。對(duì)于親本的起源對(duì)QTL特點(diǎn)的作用使得其對(duì)QTL在育種程序得以最佳利用。的確，一親本印記模型的標(biāo)記輔助分離分析可以產(chǎn)生更好的QTL等位基因作用的估測(cè)。此外，它還可以應(yīng)用最佳開(kāi)發(fā)QTL的特定的育種程序。本發(fā)明中一具體實(shí)例是，最有利的QTL等位基因可固定于育種動(dòng)物品系中，也可通過(guò)標(biāo)記輔助選擇(MAS，品系內(nèi))和標(biāo)記輔助漸滲(MAI，品系之間)而用于產(chǎn)生商業(yè)價(jià)值的雜交雄性動(dòng)物。在另一實(shí)例中，最差的QTL等位基因也可固定于動(dòng)物品系中用于通過(guò)MAS(品系內(nèi))和MAI(品系之間)產(chǎn)生有商業(yè)價(jià)值的雜交雌性動(dòng)物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所說(shuō)動(dòng)物是豬。值得注意的是例如本發(fā)明提供了一個(gè)觀點(diǎn)就是目前商業(yè)上普遍的Pietrain×大白豬雜種的一半后代遺傳了一個(gè)不利的大白豬肌肉質(zhì)量QTL，象本發(fā)明指出的那樣引起了相當(dāng)?shù)膿p失，而本發(fā)明現(xiàn)在提供選擇在此方面較好的一半種群的可能性。然而，也有可能選擇富含大雄豬中的不良等位基因的商用品系使得這些母豬可以擁有其它如生殖目的更理想的等位基因。本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述QTL位于相應(yīng)于在豬的第2號(hào)染色體上定位的QTL的相應(yīng)位置。例如，從人和豬之間有相比性的繪圖數(shù)據(jù)包括雙向染色體著色可知，SSC2p與HSA11pter-q1311，12同源。HSA11pter-q13已知攜帶一簇印記基因IGF2，INS2，H19，MAH2，P57KIP2，KyLQTL1，Tapal，/CD81，Orct12，Impt1和Ip1。定位于HSA11pter-q13上的這一簇印記基因的特征在于8個(gè)母本表達(dá)的基因H19，MASH2，P57KIP2，KyLQTL1，TAPA1/CD81，ORCTL2，IMPT1和IP1及兩個(gè)父本表達(dá)的基因IGF2和INS。然而Johnanson等人(基因組25682-690，1995)和Reik等人(遺傳趨勢(shì)13330-334，1997)等指出這些基因在各種動(dòng)物中的位置不清楚。例如HSA11和MMU7基因座相互無(wú)關(guān)聯(lián)，MMU7和SSC2基因座之間無(wú)相互關(guān)聯(lián)，而HSA11和SSC2基因座看上去相互關(guān)聯(lián)，并且沒(méi)有跡向表明上面明確的父本表達(dá)各個(gè)基因中的任一個(gè)或多個(gè)在三個(gè)種動(dòng)物染色體上的定位。其它家畜，如牛、綿羊、禽類(lèi)和魚(yú)在它們的基因組有攜帶這一簇印記基因或QTL的相似的區(qū)域，本發(fā)明提供了其它家畜的這些直向同源區(qū)域在將親本印記現(xiàn)象應(yīng)用于育種程序中的應(yīng)用。在豬中，所述一簇基因定位于第2號(hào)染色體的2p1.7位置附近，然而本發(fā)明提供的方法可將所述母本或父本表達(dá)的直向同源或同源的基因或QTL(片段)更好應(yīng)用于其它動(dòng)物進(jìn)行育種和選擇程序。例如，提供了一種方法，其中所述QTL與潛在的肌肉質(zhì)量和/或脂肪沉積相關(guān)，優(yōu)選地對(duì)其它如肉的品質(zhì)和所述動(dòng)物每日增重有有限作用，或其中所述QTL包括胰島素樣生長(zhǎng)因子2(IGF2)等位基因的至少一部分。Reik(遺傳趨勢(shì)，13330-334，1997)等解釋該基因在人體中和Beckwith-Wiedemann綜合癥相關(guān)，該病是一種表象為父本遺傳的疾病，最通常見(jiàn)于胎兒，該基因在胎兒出生前的發(fā)育中有很重要的作用。沒(méi)有現(xiàn)象或證據(jù)表明與(家養(yǎng))動(dòng)物肌肉發(fā)育或脂肪有關(guān)的分娩后發(fā)育相關(guān)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種選擇具有需要的基因型或潛在表型特征的豬的方法，包括檢測(cè)豬的樣品是否含有第2號(hào)染色體上2p1.7位上數(shù)量性狀基因座(QTL)。具體地，本發(fā)明還涉及豬第2p染色體端粒末端的遺傳標(biāo)記在標(biāo)記選擇(MAS)影響豬胴體產(chǎn)量和品質(zhì)的親本印記的數(shù)量性狀基因座(QTL)中的應(yīng)用。此外，本發(fā)明還涉及與IGF2基因座相關(guān)的遺傳標(biāo)記，如，例如圖4-10所示的多態(tài)性和微衛(wèi)星及其它特征性核酸序列在豬中MAS的應(yīng)用。在一優(yōu)選實(shí)例中，本發(fā)明提供了位于Susscrofa第2號(hào)染色體遠(yuǎn)端的QTL，其影響胴體品質(zhì)和數(shù)量的測(cè)量，尤其是肌肉質(zhì)量和脂肪沉積。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，QTL繪圖分析用于大白豬×野豬雜種的F2代200個(gè)后代中。F2代動(dòng)物在大于80公斤小于190日齡被宰殺。收集出生重量，生長(zhǎng)，脂肪沉積，身體組成，內(nèi)部器官重量和肉的品質(zhì)的表型數(shù)據(jù)。關(guān)于具體的表型性狀的描述由Andersson等1和Andersson-Eklund等4提供。以前本發(fā)明人還報(bào)道了位于第2染色體近末端的一未鑒別基因座的QTL(對(duì)背部肥肉厚度沒(méi)有任何明顯作用)對(duì)肌肉質(zhì)量有中等作用，并且與本文報(bào)道的親本印記的QTL有30cM距離的，然而現(xiàn)提供的QTL有很大作用，解釋了至少20～30％的差異，并使本發(fā)明QTL很有商業(yè)吸引力，由于該QTL是親本印記的，商業(yè)吸引力甚至更大。作為本發(fā)明的一部分，2p染色體的標(biāo)記圖譜通過(guò)加入微衛(wèi)星標(biāo)記而改進(jìn)，以覆蓋整個(gè)染色體臂。下列微衛(wèi)星標(biāo)記被用到Swc9，Sw2443，Sw2623，Swr2516，這些都位于2p遠(yuǎn)端7。在第2號(hào)染色體新的圖譜下對(duì)動(dòng)物的身體組成，脂肪，肉的品質(zhì)和生長(zhǎng)性狀進(jìn)行了QTL分析。QTL位于第2p染色體最遠(yuǎn)端的證據(jù)已找到(圖1，表1)。QTL對(duì)豬胴腿肉中瘦肉含量有很大作用并且可解釋F2群體中令人驚異的30％的殘余表型差異。還注意到QTL對(duì)于背部最長(zhǎng)肌，心臟重量，和背部肥肉(皮下脂肪層)的厚度的較大作用。對(duì)于一種肉的品質(zhì)性狀即反射度有中等影響。QTL對(duì)腹部腹肪，出生體重，生長(zhǎng)，肝、腎或脾臟的重量沒(méi)作用。位于這一QTL的大白豬等位基因和較大的肌肉質(zhì)量及減少的皮下脂肪厚度相關(guān)，這與大白豬和野豬品種之間的差異是一致的。第二個(gè)實(shí)驗(yàn)，在Piextrain×大白豬雜種的1125個(gè)F2后代個(gè)體中進(jìn)行了QTL繪圖。大白豬和野豬的親本品種在一些商業(yè)重要的表型上有所差異。Pietrain以肌肉非常發(fā)達(dá)和瘦肉出名10(圖2)，而大白豬有出眾的生長(zhǎng)性能。對(duì)F2后代所有個(gè)體都記錄了21個(gè)不同的測(cè)量生長(zhǎng)行為(5)，肌肉發(fā)達(dá)(6)，脂肪沉積(6)和肉的品質(zhì)(4)的表型。為了定位決定這些品種間遺傳差異的QTL，本發(fā)明人用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)677個(gè)F2代個(gè)體的初始樣品進(jìn)行了全基因組掃描。下面的微衛(wèi)星標(biāo)記圖譜用來(lái)分析第2號(hào)染色體，W2445，SWC9，SW2623，SWR2516-(0，20)-SWR783-(0，29)-SW240-(0，20)-SW776-(0，08)-S0010-(0，04)-SW1695-(0，36)-SWR308。用最大可能性多點(diǎn)算法對(duì)豬的第2號(hào)染色體的分析發(fā)現(xiàn)在第2號(hào)染色體短臂的末端的6個(gè)決定肌肉度的表型(％瘦肉切段(leancuts)，％豬酮腿肉(ham)，％背肉(loin))和6個(gè)測(cè)量脂肪沉積的表型中(后背脂肪厚度(BFT)，％背脂肪，％脂肪切段)各有3個(gè)達(dá)到很高的lodscore(達(dá)20)(圖1)。在其余6個(gè)肌肉度和脂肪表型的相應(yīng)染色體區(qū)域有正的lodscore，然而沒(méi)有達(dá)到實(shí)驗(yàn)上顯著的閾值(α＝5％)。。沒(méi)有證據(jù)表明相應(yīng)QTL和生長(zhǎng)性能(包括出生重量)或所記錄的肉的質(zhì)量測(cè)定有關(guān)(數(shù)據(jù)未示出)。為證實(shí)該發(fā)現(xiàn)，對(duì)355個(gè)F2后代的其余樣品針對(duì)四個(gè)最遠(yuǎn)的2p標(biāo)記做了基因型分析，并對(duì)在第一次分析中產(chǎn)生最高lodscore的性狀進(jìn)行了QTL分析。lodscore從2.1到7.7，清楚證明該區(qū)域有一主要的QTL存在。表2是三個(gè)基因分型平均值和剩余方差相應(yīng)的ML評(píng)估。基于標(biāo)記輔助分離分析的證據(jù)指示在Pietrain豬群體內(nèi)的該基因座的殘余分離。這些實(shí)驗(yàn)清楚表明豬的2p染色體臂的端粒末端存在著對(duì)胴體品質(zhì)和數(shù)量有主要影響的QTL，并且該QTL處可能至少存在有三個(gè)等位基因系列野豬＜大白豬＜Pietrain豬，并且在Pietrain品種中的分離中可能更大。所鑒別的QTL在肌肉質(zhì)量和沉積上的效果很大，和CRC基因座的作用一樣，QTL明顯沒(méi)有對(duì)肉的品質(zhì)的有害作用。我們估計(jì)兩個(gè)基因座合起來(lái)可以解釋Pietrain和大白豬在肌肉度和瘦肉度上接近50％的差異的原因。QTL對(duì)豬胴腿肉中瘦肉含量有很大的作用，并可以解釋為什么F2群體的殘余表型中差異為令人吃驚的30％。對(duì)背部最長(zhǎng)肌面積，心臟重量和背部肥肉厚度(皮下脂肪)的作用也引起注意。指出了對(duì)一種肉品質(zhì)性狀反射度有中等作用。QTL對(duì)腹部脂肪、出生重量、生長(zhǎng)、肝、腎或脾的重量沒(méi)有明顯作用(數(shù)據(jù)未示出)。在這一QTL的大白豬等位基因與野豬等位基因相比，與更高的肌肉質(zhì)量以及降低的背部肥肉厚度相關(guān)，這與這一品種與野豬群之間的差異一致。對(duì)于所有被影響的性狀觀察到的強(qiáng)印記作用，表明了僅有一相應(yīng)的基因座參與。對(duì)骨骼肌質(zhì)量和心臟大小的多效性作用從生理角度似乎是適應(yīng)的，因?yàn)檩^大的肌肉質(zhì)量需要較大的心臟的輸出。在另一實(shí)例中，本發(fā)明提供了選擇具有需要的基因型或潛在表型的豬的方法，該方法包括在所述豬的樣品中測(cè)試QTL在Susscrofa第2號(hào)染色體2p1.7位置上的存在，其中該QTL包括至少一部分Susscrofa胰島素樣生長(zhǎng)因子2(IGF2)等位基因或和它緊密相關(guān)的基因組區(qū)域，如多態(tài)性，微衛(wèi)量和其它特征性核酸序列，如圖4到10所示。從“敲除”小鼠和其是人的Beckwith-Widedemann病的致病因子中可知IGF2在出生前發(fā)育中的作用。本發(fā)明證實(shí)了IGF2區(qū)域的重要作用，也闡明了對(duì)于出生后發(fā)育的重要性。為表明Igf2的功能，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了如下三個(gè)實(shí)驗(yàn)通過(guò)篩選豬BAC的基因文庫(kù)分離得到了基因組IGF2克隆。對(duì)這一BAC克隆行FISH分析發(fā)現(xiàn)它在2p染色體的末端部分給出高度一致信號(hào)。小鼠(GenBankU71085)、人(GenBankS62623)和馬(GenBankAF020598)的IGF2的3′端UTR有一多態(tài)的微衛(wèi)星。用BAC克隆經(jīng)IFG23′端UTR直接測(cè)序表明了相應(yīng)的豬的微衛(wèi)星可能存在。在終止密碼子下游800bp處有一復(fù)合微衛(wèi)星，序列比較結(jié)果顯示該微衛(wèi)星和以前描述的匿名的微衛(wèi)星Swc96相同。該標(biāo)記在開(kāi)始的QTL繪圖實(shí)驗(yàn)中就用到，它在遺傳圖譜中的定位可能和Pietrain與大白豬雜交后代及大白豬與野豬雜交后代中的QTL的最可能位置相一致。對(duì)來(lái)自10周齡豬胎(其是豬IGFII基因第二外顯子的nt241(G-A)轉(zhuǎn)換和SWC9雜合的)的骨骼肌和肝cDNA的分析表明IGFII基因在豬的組織中很穩(wěn)定遺傳，它僅從父本的等位基因表達(dá)。根據(jù)已發(fā)表的成年豬的肝cDNA序列16，本發(fā)明人設(shè)計(jì)引物對(duì)用于從成年豬的骨骼肌cDNA中擴(kuò)增完整IgfII編碼序列，其具有222bp前導(dǎo)序列及280bp尾序列。比較Pietrain和大白豬的RT-PCR產(chǎn)物序列，結(jié)果表明該編碼序列與Pietrain、大白豬兩品種已發(fā)表序列相同。然而，在對(duì)應(yīng)于人的外顯子2的前導(dǎo)序列中發(fā)現(xiàn)一個(gè)G和A的轉(zhuǎn)換。按傳統(tǒng)專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)，該多態(tài)性稱(chēng)為nt241(G-A)。我們?cè)谶B接擴(kuò)增反應(yīng)(LAR)的基礎(chǔ)上為這一單核苷酸多態(tài)性9(SNP)建立了一篩選實(shí)驗(yàn)，使我們能對(duì)我們家譜材料的基因型進(jìn)行分析。通過(guò)這些數(shù)據(jù)，我們可以看見(jiàn)IgfII和SWC9微衛(wèi)星標(biāo)記定位在一起(θ＝0％)，即最終與QTL最可能的位置一致，并在QTL95％支持間隔區(qū)域內(nèi)。隨后的序列分析表明微衛(wèi)星標(biāo)記SWC9定位于IgfII基因的3′UTR端。如前所述，該QTL的知識(shí)為選擇動(dòng)物如具有改善的胴體價(jià)值的豬提供了一種方法。本發(fā)明包括了不同的實(shí)施方案，如標(biāo)記輔助分離分析以鑒別目的群體中功能上不同的QTL等位基因的分離；在品系內(nèi)進(jìn)行的標(biāo)記輔助選擇(MAS)以通過(guò)增加選擇精確度、選擇強(qiáng)度或通過(guò)降低代間間隔而增加遺傳應(yīng)答；標(biāo)記輔助漸滲(MAI)以有效將有用QTL等位基因從供體轉(zhuǎn)到受體，而增強(qiáng)受體群中的遺傳應(yīng)答。標(biāo)記輔助分離分析，MAS，MAI的實(shí)施可以通過(guò)和QTL連鎖的遺傳標(biāo)記，和QTL不平衡連鎖的遺傳標(biāo)記以及QTL區(qū)實(shí)際突變來(lái)進(jìn)行。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了選擇具有需要的基因型或潛在表型的豬的方法，該方法包括在所述豬樣品中測(cè)試QTL在SusScrofa第2號(hào)染色體2p1.7位置上的存在，其中所述QTL是通過(guò)父本表達(dá)的，即通過(guò)父本等位基因表達(dá)。在人和小鼠中，已知Igf2僅由父本等位基因在一些組織中印記和表達(dá)。分析SNP和/或SWC9雜合的豬的骨骼肌cDNA，結(jié)果顯示在豬中也具有同樣的印記。如本發(fā)明發(fā)述對(duì)于QTL由親本決定的理解可以使其最好地用于育種。事實(shí)上，目前商業(yè)上普遍的Pietrain和大白豬雜交后代的一半都遺傳了大白豬不良的等位基因而造成相應(yīng)的損失。用本發(fā)明所提供的方法可以解決這個(gè)問(wèn)題。本發(fā)明還提供了一分離的和/或重組的核酸序列或其功能片段，其包含可由一親本等位基因優(yōu)勢(shì)表達(dá)的親本印記的數(shù)量性狀基因座(QTL)或其片段。本發(fā)明提供的核酸可構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，在其中優(yōu)良基因可通過(guò)一親本等位基因唯一或優(yōu)勢(shì)表達(dá)，從而使所述動(dòng)物的后代對(duì)于具有和所表達(dá)的該親本等位基因相關(guān)的所需性質(zhì)的所需性狀是純合的。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一分離的和/或重組的核酸或其片段，其包括合成的親本印記的QTL或從至少一條染色體衍生的其功能片段。本文的“合成的”是指這樣一種親本表達(dá)的QTL，其中來(lái)源于一種或多種動(dòng)物的基因組的不同位置各種元件結(jié)合在一起。本發(fā)明提供了一重組核酸，其中和一種QTL的親本印記相關(guān)的序列與和第二種QTL的基因或有用等位基因相關(guān)的序列結(jié)合在一起。這種基因構(gòu)建體可用于獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述第二種QTL具備了與由含該第二種QTL的親本動(dòng)物直接遺傳得到的相反的親本印記。這種第二種QTL可以從親本印記區(qū)所在的相同的染色體中得到，也可以從相同或不同物種的不同染色體得到。在豬中，這種第二種QTL可以例如和雌激素受體(ESR)基因(Rothschild等，PNAS93，201-201，1996)或FAT-QTL(Andersson，科學(xué)，263，1771-1774，1994)相關(guān)，例如從其它豬的染色體如染色體4得來(lái)。另外，第二種QTL或其它QTL也可以從其它(家養(yǎng))動(dòng)物或人類(lèi)得到。本發(fā)明還提供一分離和/或重組的核酸或其功能片段，其至少部分相應(yīng)于豬的位于Susscrofa的第2號(hào)染色體的2p1.7位置的QTL相關(guān)，其中所述QTL與所述豬的潛在的肌肉質(zhì)量和/或脂肪沉積有關(guān)，和/或其中所述QTL包括至少一部分Susscrofa胰島素樣生長(zhǎng)因子2(IGF2)等位基因，優(yōu)選地至少跨越INS和H19之間的區(qū)域，或優(yōu)選地衍生自家豬，如Pietrain，Meishan，Duroc，Laudrace，大白豬或來(lái)自野豬。例如基因組IGF2克隆是通過(guò)篩選豬BAC文庫(kù)得到的。對(duì)該克隆進(jìn)行FISH分析，發(fā)現(xiàn)在2p染色體末端給出強(qiáng)一致信號(hào)。在小鼠(GenBankU71085)，人(GenBankS62623)或馬(GenBank，AF020598)的IGF2基因3′UTR末端有一多態(tài)的微衛(wèi)星。通過(guò)對(duì)BAC克隆的IGF2基因的3’UTR端直接測(cè)序發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的豬的微衛(wèi)星也可能存在。在終止子的下游800bp處識(shí)別了一復(fù)合微衛(wèi)星，序列比較發(fā)現(xiàn)該微衛(wèi)星和前面描述過(guò)的匿名微衛(wèi)星Swc9相同。設(shè)計(jì)PCR引物，發(fā)現(xiàn)該微衛(wèi)星(IGF2ms)在2個(gè)野豬建立者的三個(gè)不同的等位基因及8個(gè)大白豬中另外二個(gè)等位基因中有高度多態(tài)性。IGf2ms在雜種中是充分了解的，因?yàn)橛N來(lái)源和親本來(lái)源對(duì)于每個(gè)F2代動(dòng)物中每個(gè)等位基因均是可確定的。在雜交譜系統(tǒng)中對(duì)IGF2ms和微衛(wèi)星Sw2443，Sw2623和Swr2516進(jìn)行了連鎖分析，這些微衛(wèi)星都位于2p染色體的末端7。IGF2也位于2p染色體，并有很高的lodscore(例如相對(duì)于Swr2516，Z＝89.0，θ＝0.003)。包括以前分型的染色體2標(biāo)記在內(nèi)的多點(diǎn)分析顯示下列順序的基因座(性別—平均圖譜距離，以KosambicM表示)Sw2443/Swr2516-0.3-IGF2-14.9-Sw2623-10.3-Sw256。在Sw2443和Sw2516之間沒(méi)有任何重組，且與這些基因座相關(guān)的推測(cè)的IGF2的最近端位置是基于一單一重組，并且對(duì)于所報(bào)道的順序的lodscore支持為0.8。我們以前的QTL研究中的最遠(yuǎn)端的標(biāo)記Sw256，定位于該連鎖組的最遠(yuǎn)端約25厘米處。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的核酸或由其衍生的功能片段在本發(fā)明方法中的應(yīng)用。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法用于選擇具有所需的基因型或潛在表型性質(zhì)的育種動(dòng)物或屠宰動(dòng)物，或這些動(dòng)物的胚胎或精子。特別是本發(fā)明還提供了這樣的應(yīng)用，其中所述性質(zhì)和肌肉質(zhì)量和/或脂肪沉積相關(guān)。本發(fā)明提供的QTL可用于通過(guò)群體內(nèi)標(biāo)記輔助選擇或群與群之間的有用的等位基因的標(biāo)記輔助漸滲而改善例如瘦肉含量或背部肥肉厚度。使用本發(fā)明提供的QTL的標(biāo)記輔助選擇的例子是標(biāo)記輔助分離分析，使用了連鎖標(biāo)記或不平衡標(biāo)記以鑒別功能上不同的QTL等位基因。此外，QTL因果突變的識(shí)別現(xiàn)在也是可行的，同樣使得可鑒別功能不同的QTL等位基因。這種功能不同的QTL等位基因位于2p染色體遠(yuǎn)末端，其對(duì)骨骼肌質(zhì)量，心臟大小和背部肥肉厚度有很強(qiáng)的作用。在大白豬和野豬雜交后代及Pietrain和大白豬雜交后代中觀察到的相似QTL作用證明了至少有3個(gè)功能上不同的等位基因存在。此外，標(biāo)記輔助分離分析的初步證據(jù)表明在Pietrain群體內(nèi)在該基因座上有殘余分離(數(shù)據(jù)未顯示)。本發(fā)明提供的等位基因發(fā)生可確定因果多態(tài)性，基于所觀察到的作用的數(shù)量性質(zhì)，該多態(tài)性很可能不是由于基因改變而是由于細(xì)微的調(diào)控突變而來(lái)。三個(gè)等位基因?qū)∪赓|(zhì)量的作用在三個(gè)品種的豬之間處于相同順序，即Pietrain豬比大白豬有更多肌肉，大白豬又比野豬有更多瘦肉。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的等位基因在種系選擇或使用連鎖標(biāo)記、不平衡標(biāo)記或包括因果突變的等位基因的標(biāo)記輔助漸滲中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供用本發(fā)明方法選擇出來(lái)的動(dòng)物。如，已選擇到特征為位于SusScrofa第2號(hào)染色體2p1.7位置上的QTL內(nèi)的等位基因是純合的豬。因?yàn)樗鯭TL和所述豬的潛在肌肉質(zhì)量和/或脂脂沉積有關(guān)，和/或所述QTL包括至少一部分Susscrofa胰島素樣生長(zhǎng)因子2(IGF2)的等位基因，因此可能選到理想的豬用于育種或屠宰。本發(fā)明尤其提供了雄性動(dòng)物。這樣的雄性動(dòng)物，或其精液或胚胎都可很好地用作育種動(dòng)物產(chǎn)生育種系或產(chǎn)生最終被屠宰的育種動(dòng)物。在這樣的用途的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，雄性動(dòng)物或其精液特意被選作引起肌肉生長(zhǎng)率和瘦肉率的等位基因是純合的，用它來(lái)生產(chǎn)含有該等位基因的異源雜合子后代。由于所述等位基因的父本表達(dá)，其后代也會(huì)顯示和肌肉質(zhì)量等相關(guān)的優(yōu)良性狀，即使母本有著不同的遺傳背景。此外，現(xiàn)在可主動(dòng)選擇有不同性狀的母本，如和多產(chǎn)相關(guān)并且又對(duì)從選擇的雄性動(dòng)物的等位基因繼承的肌肉質(zhì)量性狀沒(méi)有負(fù)作用。例如，早期這種雄性動(dòng)物偶而在Pietrain中可見(jiàn)，但在遺傳方面卻不知怎樣在育種過(guò)程中有效利用這些性狀。此外，本發(fā)明提供了一轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，它的精液和胚胎，其包含本發(fā)明提供的合成的親本印記的QTL或其功能片段，即本發(fā)明提供它用以引入一良好的重組等位基因。如引入與動(dòng)物幼仔大小增加相關(guān)的雌激素受體的基因座，其在祖代親本動(dòng)物(例如如果該區(qū)域是親本印記的并且祖父是野豬，則是雜交母豬的父親)的親本印記區(qū)域是純合的，引入有利的脂肪相關(guān)的等位基因或肌肉質(zhì)量相關(guān)的重組等位基因到父本印記的區(qū)域，等等。重組等位基因是由母本而來(lái)的有意義或有利的，或通常由父本而來(lái)的有相反作用的等位基因。例如，在肉類(lèi)動(dòng)物(如豬)中，和肉的品質(zhì)性狀(如肌肉內(nèi)的脂肪或肌肉質(zhì)量)連鎖的重組等位基因可在母畜品系中固定，而和減少的背部肥肉連鎖的重組等位基因可固定在種公畜品系中。其它理想的組合是例如在雌性品系中的多產(chǎn)性和/或乳汁產(chǎn)量與雄性品系中的生長(zhǎng)速率和/或肌肉質(zhì)量的組合。以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)解釋?zhuān)皇窍拗票景l(fā)明。實(shí)施例1野豬(WildBoar)和大白豬(LargeWhite)雜交方法IGF2BAC克隆的分離和熒光原位雜交(FISH)基于豬IGF2cDNA序列(GenBankX56094)設(shè)計(jì)IGF2引物(F5’-GGCAAGTTCTTCCGCTAATGA-3’和R5’-GCACCGCAGAATTACGACAA-3’)以經(jīng)PCR擴(kuò)增最后外顯子的一部分和3′UTR。該引物用于篩選豬的BAC基因文庫(kù)，分離到了253G10克隆。粗制BACDNA按所述方法24準(zhǔn)備。BACDNA用EcoRV消化成線(xiàn)性，并用QIAEXII純化(QIAGEN有限公司，德國(guó))?？寺∮肎IBCO-BRLBionick標(biāo)記系統(tǒng)(BRL18246-015)進(jìn)行生物素-14-dATP標(biāo)記。豬中期染色體通過(guò)用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從美洲商陸(Seromed)刺激的淋巴細(xì)胞得到。將玻片在室溫下放置兩天后，-20℃保存直到使用。FISH分析如前所述25。在雜交混合物中所用探針的終濃度是10ng/μl。豬的基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)濃度抑制重復(fù)序列。在雜交后洗脫后，生物素標(biāo)記的探針用兩層抗生物素蛋白-FITC(VectorA-2011)檢測(cè)。染色體用0.3mg/ml的DAPI負(fù)染(4，6-二氨基-2-phenylindole；SigmaD9542)，產(chǎn)生G帶型類(lèi)似模式。不需要雜交后顯帶，因?yàn)榈?號(hào)染色體不顯帶就能容易地認(rèn)出來(lái)。共檢測(cè)了20個(gè)中期染色體涂片，所用顯微鏡為OlympusBX-60型熒光顯微鏡，和IMAC-CCDS30相機(jī)相連，并裝有ISIS1.65軟件(Metasystems)。測(cè)序，微衛(wèi)星和連鎖分析約2μg線(xiàn)狀且純化的BACDNA用于直接測(cè)序，使用20pmol的引物和BigDye終止反應(yīng)化學(xué)法(PerkinElmer，USA)。DNA測(cè)序從最后一外顯子的3’末端到UTR3′端，直到檢測(cè)到微衛(wèi)星的存在。設(shè)計(jì)了一對(duì)引物[F5’-GTTTCTCCTGTACCCACACGCATCCC-3’和R5’-熒光素-CTACAAGCTGGGCTCAGGG-3’]來(lái)PCR擴(kuò)增IGF2微衛(wèi)星，該微衛(wèi)星長(zhǎng)約250bp，在終止密碼子下游800bp處。該微衛(wèi)星用熒光標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用ABI377測(cè)序儀，GeneScanGenotyper軟件(PerkinElmer，USA)進(jìn)行基因分型。用Cri-Map軟件26進(jìn)行了兩點(diǎn)和多點(diǎn)連鎖分析。動(dòng)物和表型數(shù)據(jù)雜交譜系包括2只歐洲雄性野豬和8只大白母豬，4只雄性F1，22只雌性F1，和200只F2子代1。F2代動(dòng)物在活體重大于80公斤或在小于190日齡被殺掉。收集關(guān)于出生重量，生長(zhǎng)，脂肪沉積，身體組成，內(nèi)部器官重量和肉的品質(zhì)的表型數(shù)據(jù)；Andersson等1和Andersson-Eklund等人4詳盡描述了這些表型性狀。統(tǒng)計(jì)分析間隔繪圖測(cè)試QTL的存在用開(kāi)發(fā)用于分析遠(yuǎn)系雜交品系的最小平方方法來(lái)進(jìn)行。該方法建立在兩不同品系有可以相互替代的QTL等位基因的假設(shè)的前提之下?？紤]到祖本的每個(gè)基因座的等位基因，其F2代有四種可能的基因型，這使得其可適應(yīng)三種不同效果添加的，優(yōu)勢(shì)的和印記的2。最后一種的評(píng)估是兩種雜合子之間的差異，其中一個(gè)通過(guò)F1種公畜而獲得了野豬的等位基因，另一個(gè)通過(guò)F1母畜獲得等位基因。用該模型(具3.d.f.)相對(duì)于無(wú)QTL作用的降低模型計(jì)算了第2號(hào)染色體每cM的F比率。QTL的最可能位置是F比率最大時(shí)的位置?；蚪M一些重要閾值根據(jù)描述2的互變測(cè)驗(yàn)28得來(lái)。包括印記作用的QTL模型與沒(méi)有印記作用的QTL模型(具有1d.f.)相比較以檢驗(yàn)印記作用是否顯著。統(tǒng)計(jì)學(xué)模型還包括與各自性狀相關(guān)的固定作用和相關(guān)變異，見(jiàn)Andersson-Eklund等4對(duì)所用統(tǒng)計(jì)模型的更詳盡描述。本發(fā)明還包括家族以考慮背景遺傳作用和母本作用。胴體重量也被包括作為相關(guān)變異解釋QTL對(duì)相關(guān)性狀的作用，這表明所有和身體組成相關(guān)的結(jié)果在相等的重量比較。IGF2基因座中每種基因型的最小均方通過(guò)用SAS的GLM程序29的單點(diǎn)分析來(lái)得到，本模型包括間隔繪圖分析中所用的相同的固定模型和相關(guān)變異。QTL顯示了一清楚的親本起源特異性表達(dá)，圖譜位置與IGF2基因相同，表明IGF2就是因果基因。在該基因座也以觀察到一非常明顯的分離畸形(過(guò)量的來(lái)源于野豬的等位基因)。這一結(jié)果表明IGF2區(qū)域在出生后的發(fā)育中有很重要的作用，同時(shí)由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)或?qū)?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理時(shí)忽略了在人和嚙齒類(lèi)動(dòng)物中也可能存在有親本表達(dá)的與IGF2連鎖的QTL。本研究在數(shù)量遺傳理論和實(shí)際豬育種中也有重要應(yīng)用。IGF2被鑒別為是這一QTL的位置候補(bǔ)基因，因?yàn)樵谪i的2p染色體和人的11p染色體觀察到二者的相似性。通過(guò)篩選豬BAC文庫(kù)而分離到了一IGF2基因組克隆。對(duì)該BAC克隆進(jìn)行的FISH分析顯示在2p染色體末端信號(hào)高度一致(圖1)。在小鼠(GenBankU71085)，人(GenBankS62623)和馬(AF020598)的IGF23′UTR有一多態(tài)微衛(wèi)星存在。通過(guò)用BAC克隆對(duì)IGF23′UTR的直接測(cè)序發(fā)現(xiàn)豬的相應(yīng)微衛(wèi)星也可能存在。在終止子下游800bp處有一復(fù)合的微衛(wèi)星，序列比較發(fā)現(xiàn)該微衛(wèi)星和前面描述過(guò)的無(wú)名微衛(wèi)星Swc96序列相同。設(shè)計(jì)了PCR的引物，并且發(fā)現(xiàn)該微衛(wèi)星(IGF2ms)與2個(gè)野豬建立者中的3個(gè)不同等位基因及8個(gè)大白豬建立者中的另外2個(gè)等位基因是高多態(tài)性的。IGF2ms在雜種中能提供充分的信息，因?yàn)橛N的起源和親本的起源可確定每個(gè)F2動(dòng)物的每個(gè)等位基因。用雜種譜系做的連鎖分析用IGF2ms和全部來(lái)自2p染色體7遠(yuǎn)末端的微衛(wèi)量Sw2443，Sw2623，Swr2516進(jìn)行。IGF2由于高度顯著的lodscore(例如對(duì)于Swer2516，Z＝89.0，θ＝0.003)而被明確地定位于2p染色體。多點(diǎn)分析，包括以前分型的第2號(hào)染色體標(biāo)記8在內(nèi)的分析，揭示下列順序的基因座(性別—平均圖譜距離，以KosambicM表示)Sw2443/Swr2516-0.3-IGF2-14.9-Sw2623-10.3-Sw256。在Sw2443和Swr2516之間沒(méi)觀察到重組，且與這些基因座相關(guān)的推測(cè)的IGF2的最近端位置是基于一單一重組，并且對(duì)于所報(bào)道的順序的lodscore支持為0.8。我們以前的QTL研究中的最遠(yuǎn)端的標(biāo)記Sw256，定位于該連鎖組的最遠(yuǎn)端約25厘米處。身體組成，脂肪，肉品質(zhì)和生長(zhǎng)性狀的QTL分析在新的第2染色體圖譜基礎(chǔ)上進(jìn)行，使用統(tǒng)計(jì)模型測(cè)試IGF2預(yù)期印記作用的存在。一父本表達(dá)的QTL位于2p染色體最遠(yuǎn)端的明顯證據(jù)也已得到(圖2，表1)。該QTL對(duì)豬胴腿肉中的瘦肉含量有非常大作用，并解釋了F2群體中有令人驚異的30％的殘余表型差異。該QTL對(duì)背最長(zhǎng)肌面積，對(duì)心臟重量和背部肥肉厚度(皮下脂肪)的較大作用已注意到。并且還顯示該QTL對(duì)一種肉的品質(zhì)性狀即反射度值有中等的作用。該QTL對(duì)腹部脂肪，出生重量，生長(zhǎng)、肝、腎或脾的重量沒(méi)有顯示作用(數(shù)據(jù)未顯示)。大白豬位于該QTL的等位基因和較大的肌肉質(zhì)量和減少的背部肥肉厚度有關(guān)，這和大白豬與野豬群之間的不同是相一致的。對(duì)所有受影響性狀觀察到的強(qiáng)的印記作用強(qiáng)烈表明只有一個(gè)因果基因座存在。對(duì)于骨骼肌質(zhì)量和心臟大小的多效性作用從生理學(xué)角度來(lái)看是適應(yīng)的，因?yàn)檩^大的肌肉質(zhì)量需要一較大的心臟輸出。QTL的明顯父本表達(dá)通過(guò)最小平方平均值證實(shí)，其根據(jù)父本遺傳的等位基因的來(lái)源不同分為兩類(lèi)(表1)。值得注意的是對(duì)該兩個(gè)雜合類(lèi)別有一不明顯的傾向，即數(shù)值越來(lái)越不極端，尤其是對(duì)背最長(zhǎng)肌面積的估計(jì)作用。這可能由于機(jī)會(huì)的原因，但也可有一個(gè)生物學(xué)解釋?zhuān)匆灿幸恍┠副具z傳的等位基因的表達(dá)，或存在對(duì)所討論的性狀有微小作用的連鎖的、非印記的QTL。IGF2連鎖的QTL及第4號(hào)染色體1，9上的FAT1QTL目前是對(duì)野豬雜交種中分離的身體組成和脂肪有最大作用的兩個(gè)基因座。IGF2QTL主要控制肌肉質(zhì)量，而FAT1對(duì)脂肪沉積包括腹部脂肪沉積有主要作用，而IGF2QTL對(duì)此無(wú)作用(圖2)。在這兩個(gè)基因座之間沒(méi)明顯的相互作用，它們控制很大比例的F2代剩余表型方差。一包括這兩個(gè)QTL的模型解釋了豬胴腿肉內(nèi)瘦肉百分比的33.1％的方差，瘦肉+背骨百分比的31.3％方差，以及平均背部肥肉厚度的26.2％的方差(與僅包括染色體2作用的模型相比，表1)。這兩個(gè)QTL一定在大白豬家豬的瘦肉生長(zhǎng)和肌肉質(zhì)量選擇中有主要作用。在IGF2區(qū)域(過(guò)量的野豬衍生的等位基因)內(nèi)觀察到的非常顯著的分離畸形如表1所示(x2＝11.7，d.f.＝2；p＝0.003)。野豬衍生的IGF2等位基因的頻率是59％，而預(yù)期的是50％，并且“野豬”純合子是“大白豬”的2倍。這種偏差在遠(yuǎn)末端的所有三個(gè)基因基因座都觀察到，而并不是分型錯(cuò)誤。這種偏差也在其它基因座上發(fā)現(xiàn)，但畸形的程度隨著與染色體遠(yuǎn)末端的距離而降低。制備DNA的血液樣品在12周齡被收集，并且我們確認(rèn)與預(yù)期的孟德?tīng)柋嚷实钠x在出生時(shí)就存在，因?yàn)椴裳皢适У膭?dòng)物數(shù)不足以引起其偏差。所分析的這一譜系的超過(guò)250個(gè)基因座中沒(méi)有其它基因座顯示這種明顯的分離畸形(L.Andersson，未公開(kāi))。分離畸形沒(méi)有顯示印記作用，因?yàn)閮苫シ搭?lèi)型的雜合子的頻率是相等的(表1)。這并不排除QTL作用和分離畸形是受同一基因座控制的可能。分離畸形可能由于配子形成過(guò)程時(shí)減數(shù)分裂驅(qū)動(dòng)有利于父本表達(dá)等位基因引起的，因?yàn)镕1親本均和雄性野豬交配。另一種可能是在胚胎發(fā)育的一重要時(shí)間和/或一些組織內(nèi)父本和母本的等位基因共表達(dá)而引起分離畸形。雙等位基因的IGF2表達(dá)在人發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)有過(guò)報(bào)道10，11，有意義的是最近在Musmusculus和Musspretus的一種雜交后代中發(fā)現(xiàn)IGF2的表達(dá)強(qiáng)烈受親本的種屬影響12。還有意義的是和IGF2緊密連鎖的胰島素基因處的VNTR多態(tài)性和人出生時(shí)的大小有關(guān)13。豬中和IGF2連鎖的QTL可能對(duì)出生體重有微小的作用，但在我們的資料中這種作用遠(yuǎn)不是重要的(圖2)，并且沒(méi)有顯示印記作用。本研究在IGF2基因座的生物重要性的一般知識(shí)上來(lái)說(shuō)是先進(jìn)的。從“敲除”小鼠14和其是人的Beckwith-Widedemann病的致病因子中可知IGF2在出生前發(fā)育中的作用。本發(fā)明證實(shí)了IGF2區(qū)域的重要作用，也闡明了對(duì)于出生后發(fā)育的重要性。應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是遠(yuǎn)系之間的雜交對(duì)用對(duì)多個(gè)性狀的親本專(zhuān)一起源作用來(lái)檢測(cè)QTL很有力。這是因?yàn)槎鄠€(gè)等位基因是分離的，并且我們可以推導(dǎo)出一異源雜合的F2代動(dòng)物是否獲得的Boar野豬等位基因是來(lái)源于父親還是來(lái)源于母親。很可能在人類(lèi)研究中我們忽略了父本表達(dá)和IGF2相連的QTL的分離對(duì)如肥胖等性狀的影響，及它對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物同系雜交中性狀的影響，這可能由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)或?qū)Y料統(tǒng)計(jì)處理導(dǎo)致。因?yàn)?個(gè)等位基因有各自的基因基因座分離，所以在兩自多系之間的近親雜種中沒(méi)檢測(cè)到遺傳作用。我們的研究結(jié)果顯著支持以下幾點(diǎn)未來(lái)的分析胰島類(lèi)IGF2區(qū)域遺傳多型性和I型糖尿病、肥胖病間關(guān)系，以及人類(lèi)出生體重13的不同，以及用嚙齒動(dòng)物模型研究復(fù)合性狀的遺傳解析。在家養(yǎng)豬和野生祖先之間雜交的強(qiáng)大動(dòng)力可以開(kāi)發(fā)繪圖和識(shí)別應(yīng)答的主要基因位點(diǎn)的可能性。我們現(xiàn)在證明在第2(未研究)、第4染色體上有兩個(gè)單一QTL可以解釋F2代瘦肉含量表型不同的1/3。這是數(shù)量遺傳理論中極小模型為假設(shè)前提的粗略偏差，也就是說(shuō)數(shù)量性狀受許多基因位點(diǎn)影響，每一位點(diǎn)都有很小的作用。如果兩個(gè)不同種系之間遺傳上有很高比例的不同(例如，野豬和大白豬)受很少的基因位點(diǎn)控制，那么就可以假設(shè)選擇將很快確定有很強(qiáng)影響的QTL等位基因。然而這不是在動(dòng)物育種過(guò)程中的經(jīng)驗(yàn)，也不是選擇實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)中長(zhǎng)期選則反映能得到，受影響的群體大小很大。對(duì)這種顛倒現(xiàn)象的可能解釋是QTL等位基因可能由于一系列的突變而影響兩群體間遺傳上的差異。而這些突變就發(fā)生在相同基因或影響同一性狀的密切相連的一些基因。有爭(zhēng)議說(shuō)新的突變主要導(dǎo)致長(zhǎng)期選擇反映19，但是那種突變的基因組分布還不清楚。研究單一的原因突變認(rèn)為是對(duì)小鼠遺傳缺陷分析和人類(lèi)單一基因紊亂的畸形分析。我們提議這對(duì)正在大量群體的家養(yǎng)動(dòng)物，谷物或自然群體內(nèi)進(jìn)行選擇的基因位點(diǎn)不是關(guān)鍵的。這個(gè)假設(shè)前提是主要QTL處存在有多等位基因。這一點(diǎn)從我們最近對(duì)豬皮毛顏色多樣性特點(diǎn)研究中得到了支持。我們發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)主要白色的等位基因和黑斑點(diǎn)等位基因和野生型等位基因不同，不同是在負(fù)責(zé)對(duì)KIT和MCIR基因基因座上表型作用至少分別有2個(gè)連續(xù)突變20，21。很有趣的是我們?cè)谙嚯S的例子中發(fā)現(xiàn)了和IGF2QTL相連的第三個(gè)等位基因。三個(gè)等位基因?qū)∪赓|(zhì)量的作用的順序和它們?cè)趧?dòng)物中被發(fā)現(xiàn)的品種順序相同，也就是Pietrain豬比大白豬有更多肌肉，大白豬比野豬有更多肌肉。有很好的理由決定IGF2就是現(xiàn)在報(bào)道的QTL的致病基因。首先，與基因定位非常一致性(圖2)。其次，已證明象QTL，IGF2在鼠、人和現(xiàn)在豬內(nèi)是父本表達(dá)的。在小鼠和人體內(nèi)IGF2附近區(qū)有幾個(gè)其它印刻基因(Mash2，INS2，H19，KVLQT1，TAPA1/CD81和CDKNIC/p57KIP2)，但只有IGF2在成體組織內(nèi)是父本表達(dá)的。我們相信該基因座提供了QTL分子定性的獨(dú)特機(jī)會(huì)。明顯的父本表達(dá)可用于排除沒(méi)有這種遺傳方式的基因。此外，等位基因系列的存在有助于解決原因突變和中性多樣性之間不同的難題。我們已經(jīng)證明在Pietrain和大白豬內(nèi)的IGF2等位基因的編碼區(qū)序列是相同的，這說(shuō)明原因突變發(fā)生在調(diào)控序列，重要的一步是對(duì)整個(gè)IGF2基因和從三個(gè)種群來(lái)的多個(gè)啟動(dòng)子進(jìn)行測(cè)序分析。最近報(bào)道在胰島素基因啟動(dòng)區(qū)(INS)中的VNTR多態(tài)性影響IGF2的表達(dá)23，這說(shuō)明原因突變離IGF2編碼序列有一定距離。這個(gè)結(jié)果對(duì)豬育種工場(chǎng)有一些重要的應(yīng)用。它們顯示遺傳印刻不是內(nèi)部學(xué)術(shù)問(wèn)題，而是需要有實(shí)際育種中仔細(xì)考慮。在野豬，Pietrain和大白豬中檢測(cè)到的三個(gè)不同等位基因表明在商業(yè)用群體中還有等位基因和IGF2相連QTL分離存在。QTL的父本表達(dá)有助于，利用大的與父本半同胞家族進(jìn)行檢測(cè)，而可忽略母本貢獻(xiàn)。QTL可以通過(guò)用群體內(nèi)標(biāo)記輔助選擇或用標(biāo)記輔助互補(bǔ)將良性等位基因從一群體引入到另一群體來(lái)提高瘦肉含量。實(shí)施例2Pietrain和大白豬雜交方法譜系材料用以QTL繪圖的譜系材料選自于前面描述的Pietrain和大白豬雜交的F2代＞1800個(gè)體6，7中取得。為獲取材料，用27頭Pietrain公豬和20頭大白豬交配，產(chǎn)生F1代456個(gè)體。從1984年到1989年，用F1代31只野豬公豬和82只F1母豬交配共產(chǎn)生F2代1862個(gè)體。F1代公豬平均和7只母豬交配，F(xiàn)1代母豬平均和2.7只公豬交配，每只公豬平均后代60只，每只母豬平均后代23只。表型信息(1)數(shù)據(jù)收集在F2代中共記錄了21種不同的表型6，7。它們包括—5種生長(zhǎng)性狀出生重(克)，斷奶體重(千克)，生長(zhǎng)期幼豬體重(千克)，肥育豬體重(千克)和平均每日增重(ADG；千克/日；生長(zhǎng)到肥育豬時(shí)期)；—2個(gè)身體比例測(cè)量值胴體長(zhǎng)度(厘米)；形體數(shù)值(0-10評(píng)分，參考文獻(xiàn)6)；—屠宰后胴體冷凍24小時(shí)后獲得的胴體組成10種測(cè)量值，這些包括肌肉度測(cè)量值％豬胴腿肉(豬胴腿肉重/胴體重)；％背肉(背肉重/胴體重)；％肩(肩重/胴體重)；％瘦肉部位(％豬胴腿肉+％背肉+％肩)；以及脂肪測(cè)量值平均背部肥肉厚度(BFT；厘米)，％背部肥肉(背部肥肉重/胴體重)，％腹肉(腹肉重/胴體重)，％背脂(背脂重/胴體重)，％頰肉(頰肉重/胴體重)，“％脂肪部位”(％背部肥肉+％腹肉+％背脂+％頰肉)?！?個(gè)肉質(zhì)測(cè)量值pHLD1(屠宰1小時(shí)后的背最長(zhǎng)肌)，pHLD24(屠宰24小時(shí)后的背最長(zhǎng)肌)，pHG1(屠宰1小時(shí)后的薄肌)，PHG24(屠宰24小時(shí)之后的薄肌)。(ii)數(shù)據(jù)處理單個(gè)表型先按已證明顯著影響相應(yīng)性狀的固定作用(種公畜，母畜，CRC基因型，性別，一年季節(jié)，奇偶)和相關(guān)變異(幼仔尺寸，出身重量，斷奶重量，生長(zhǎng)期幼豬重，肥育豬重)預(yù)調(diào)整。按逐漸退化原則選擇包括在模型中的變量。標(biāo)記基因型確定一對(duì)引物被用于微衛(wèi)星標(biāo)記的PCR擴(kuò)增中。標(biāo)記照物基因型確定方法如前所述。CRC和MyoD位點(diǎn)基因型按描述9，12過(guò)的傳統(tǒng)方法確定。按Baron等人21的方法研制了Igf2SNP的LAR測(cè)定方法，用了一對(duì)引物(5’-CCCCTGAACTTGAGGACGAGCAGCC-3’；5’-ATCGCTGTGGGCTGGGTGGGCTGCC-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用3條引物(5’-FAM-CGCCCCAGCTGCCCCCCAG-3’；5’-HEX-CGCCCCAGCTGCCCCCCAA-3’；5’-CCTGAGCTGCAGCAGGCCAG-3’)進(jìn)行LAR測(cè)定。基因圖譜構(gòu)建標(biāo)記圖譜用CRIMAP盒中的兩點(diǎn)，構(gòu)建和CHROMPIC方法構(gòu)建。為應(yīng)用該盒，和野豬或母豬親緣關(guān)系較近的分開(kāi)，各自處理。通過(guò)這種方法，一些潛在可用信息被忽略或產(chǎn)生，然而，對(duì)這重組頻率可公正評(píng)估。QTL繪圖(1)孟德?tīng)朡TL繪圖傳統(tǒng)QTL繪圖用多點(diǎn)最大可能的方法進(jìn)行。應(yīng)用模型假定每染色體有一分離的QTL，可替代QTL等位基因在親本系中被遺傳，(PietrainCP)和大白豬(LW)。研制特異性專(zhuān)一分析程序考慮親代中丟失的基因型，結(jié)果顯示F1代的染色體的親本源不能確定。用一典型的“間隔繪圖”策略，用一使用者決定步驟可將一假設(shè)的QTL沿標(biāo)記的繪圖移動(dòng)。在每一位置上，譜系數(shù)據(jù)的可能性(L)按下式計(jì)算P或正確染色體P)，對(duì)r個(gè)F1代親本，共有2r種組合。Πi=1′′nF2]]>第i個(gè)F2后代，有4個(gè)可能QTL基因型P/P，P/LW，LW/P和LW/LWP(G|Mi，θ，)Mi第i個(gè)F2代后代和F1親本的標(biāo)記基因型。(2)在相鄰標(biāo)記之間和假設(shè)QTL和其相鄰標(biāo)記之間的重組幾率矢量。(3)θ指F1代中標(biāo)記和QTL的相結(jié)合。重組率和F1代親本標(biāo)記連鎖期間，在計(jì)算可能值時(shí)假定是知道的。兩者在繪圖構(gòu)建過(guò)程中都可用CRIMAP決定(見(jiàn)上述)。P(yi/G)yi)指第i個(gè)后代的QTL基因型。其可能性由正常密度函數(shù)計(jì)算得到P(yi|G)=12πσe-(yi-μG)22σ2]]>G指QTL基因型(PP，PL，LP或LL)的表型平均；σ2指殘基變數(shù)，對(duì)于四種基因型，σ2被認(rèn)為相同。μpp，μpL＝μLP，μLL和a2最大值L值用GEMINT方法決定。在該可替代H1假設(shè)中的可能性和沒(méi)有QTL假設(shè)H0中相比較，在后一假設(shè)中四種QTL基因型的表型均值被認(rèn)為是相同的。在相應(yīng)可能性的對(duì)數(shù)中的不同生成了一測(cè)量QTL在相應(yīng)圖上位置的對(duì)數(shù)值。(2)重要閾值按Lander和Botstein，對(duì)數(shù)值閥值(T)和選擇的基因組顯著水平相關(guān)，按下式計(jì)算α＝(C+9.21GT)X22(4.6T)C指染色體的數(shù)目(＝19)，G指基因組的長(zhǎng)度Morgans(＝29)，X22(4.6T)指一個(gè)數(shù)減去2d.f分布k2的積累分布功能。單一點(diǎn)的21n(LR)假定作為含有2個(gè)自由度的k2的分布，就象我們的附屬和主要組成部分。我們做多個(gè)性狀的分析是解釋一個(gè)事實(shí)，通過(guò)用Bonferoni校正來(lái)確定重要性水平，而這個(gè)確定α和分析的獨(dú)立的有效性狀個(gè)數(shù)有關(guān)。這個(gè)有效數(shù)目根據(jù)Spelman25等人描述的方法約為16。所有這些可使我們?cè)O(shè)立和實(shí)驗(yàn)顯著水平為5％相關(guān)的對(duì)數(shù)閾值為5.8。要確證所驗(yàn)QTL在一獨(dú)立樣品中時(shí)，用相同的方法，然而將C設(shè)為1，G＝25厘米，校正4.5個(gè)獨(dú)立性狀的分析(因?yàn)樵谠摌颖局袃H分析之多性狀)，產(chǎn)生錯(cuò)誤率5％時(shí)的相關(guān)的對(duì)數(shù)基閾值為2。(3)遺傳QTL測(cè)試為測(cè)試一遺傳QTL。我們假定只有QTL等位基因通過(guò)特定性別的親本印記，并對(duì)表型有作用，而由另一親本印記的QTL等位基因稱(chēng)為“中性”。在該假設(shè)下的血親數(shù)據(jù)的可能性用等式1計(jì)算。為計(jì)算P(yi/G)，四種QTL基因型的表型值設(shè)為μpp＝μpL＝μp，μLP＝μLL＝μL，此時(shí)測(cè)試僅有父本表達(dá)的等位基因的QTL，設(shè)μpp＝μLP＝μp，μpL＝μLL＝μL時(shí)測(cè)試僅由母本表達(dá)的等位基因的QTL。在該概念中假定第一個(gè)下標(biāo)指父本等位基因，第2個(gè)下標(biāo)指母本等位基因。H0定義為沒(méi)有QTL時(shí)的無(wú)效假設(shè)，H1是孟德?tīng)朡TL存在測(cè)試；H2是父本表達(dá)QTL存在的測(cè)試；H3是母本表達(dá)QTL存在的測(cè)試。RT-PCR用Chingwin等人26方法從骨骼肌中提取總RNA。用Gene-AmpRNAPCR試劑盒做RT-PCR。PCR產(chǎn)物用QiaQuickPCR純化試劑盒(Wiagen)純化，用“染料終止子循環(huán)測(cè)序準(zhǔn)備反應(yīng)”(Perkin-Elmer)和ABI373自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。在第2個(gè)實(shí)施便中，我們報(bào)道定位于豬2p1.7位置上對(duì)肌肉質(zhì)量和脂肪沉積有重要作用的QTL的驗(yàn)證。本QTL有親本印記的明確證據(jù)強(qiáng)烈表明它在Igf2基因基因座中。-Pietrain和大白豬雜交后產(chǎn)生1125個(gè)F2代后代已述6，7。大白豬和Pietrain親本血緣僅在一些商業(yè)重要表型不同。Pietrain因超群的肌肉度和瘦肉而聞名8(圖2)，大白豬則有不凡的生長(zhǎng)速度。在所有F2后代中共測(cè)了21個(gè)不同的表型(i)5個(gè)生長(zhǎng)表型5；(ii)肌肉性狀(6)；(iii)脂肪沉積相關(guān)性狀(5)；(iv)4個(gè)肉的品質(zhì)性狀4。為繪決定這些品系遺傳差別的QTL圖譜，我們對(duì)677個(gè)F2后代的起始樣品用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行了完整基因組掃描。用ML多點(diǎn)互除法，分析豬的第2號(hào)染色體，發(fā)現(xiàn)在第2染色體短臂末端負(fù)責(zé)肌肉度和脂肪沉積的12個(gè)表型中有6個(gè)有很高的對(duì)數(shù)值(達(dá)20)(圖3a)。對(duì)剩下的6個(gè)表型也有正的對(duì)數(shù)值，然而，并沒(méi)達(dá)到基因組明顯的閾值(5％)。為確證該發(fā)現(xiàn)，355個(gè)F2代個(gè)體剩余樣品進(jìn)行了2p染色體最末端5個(gè)標(biāo)記的基因型測(cè)定，并對(duì)在第一次分析中有最高對(duì)數(shù)值的性狀進(jìn)行QTL分析。對(duì)數(shù)值從2.1到7.7，清楚證明該區(qū)域有一定主要QTL存在。表2介紹了相應(yīng)3個(gè)基因型均值的ML分析及相應(yīng)的殘基多樣性。雙向染色體繪圖在SSC2p和HSA11pter-q139，10之間建立了聯(lián)系。對(duì)于人該區(qū)最少有2個(gè)系列侯補(bǔ)基因圖譜肌源螺旋一環(huán)一螺旋因子，MgoD，位于HSA11p15.4位置，而Igf2到HSA11p15.5。MyoD圖是肌肉發(fā)生的主要調(diào)控子，是發(fā)育期間打開(kāi)的第一個(gè)功能肌生作用標(biāo)記。以前所述的豬MyoD基因中擴(kuò)增的序列多形態(tài)，證明在我們F2代動(dòng)物中是分離的，基因型顯示出精確對(duì)應(yīng)于兩個(gè)異源雜子基因型中點(diǎn)的表型值。這正是一些人預(yù)言的當(dāng)對(duì)遺傳QTL分析時(shí)，預(yù)期異源雜合子的后代一半繼承了P等位基，另一半繼承了LW等位基因。因此這些資料證明了我們關(guān)于一遺傳基因從父本等位基因獨(dú)特地表達(dá)的假設(shè)。在人和小鼠中觀察到的鑒別的染色體片段和印刻區(qū)域相同這一現(xiàn)象暗示在豬中它是直向同源進(jìn)化區(qū)域。文獻(xiàn)記載至少該區(qū)域有7個(gè)遺傳基因被記錄(Igf2，Ins2，H19，Mash2，p57KIP2，kvLQTL1和TDAG51)。它們中(參考15和AndrewFeinberg，個(gè)人通信)僅有Igf2和Ins2是父本表達(dá)的。然而我們不能排除觀察到的QTL作用是因?yàn)樵搮^(qū)域的未鑒別的遺傳基因的結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)，體外肌生成作用的效果可能是Igf2，尤其是在轉(zhuǎn)基因小鼠中由于肌肉專(zhuān)一啟動(dòng)子過(guò)量表達(dá)Igf2同時(shí)也觀察到的肌肉過(guò)量表達(dá)是對(duì)該假設(shè)的支持。INSVNTR的，等位基因變異顯示它和人出生時(shí)的大小有關(guān)，證明相同的VNTR影響Igf2表達(dá)的水平。在大白豬和野豬雜種中相同QTL效果的觀察結(jié)果表明至少存在一系列三個(gè)功能上不同的等位基因。此外標(biāo)記輔助分離分析基礎(chǔ)上的初步證據(jù)表明在Pietrain群體中該位點(diǎn)有殘基分離(數(shù)據(jù)未顯示)。等位基因系列的存在在鑒別原因多態(tài)性時(shí)可能沒(méi)什么價(jià)值，多態(tài)性是觀察到作用效果的數(shù)量本質(zhì)，這些多態(tài)性不可能是基因替代，而更象微小調(diào)控突變。識(shí)別的QTL對(duì)肌肉質(zhì)量和脂肪沉積的作用是很主要的，盡管對(duì)于肉的品質(zhì)沒(méi)有相關(guān)的壞作用，但對(duì)CRC位點(diǎn)6.7有同等重要作用。我們估計(jì)這兩個(gè)基因基因座解釋Pietoain和大白豬雜交種在肌肉度和瘦肉度上50％的差別。對(duì)該位點(diǎn)親本起源效果特征的理解有助于在育種中最好的利用。事實(shí)上，商業(yè)上普遍的Pietrain和大白豬雜交豬一半的后代遺傳了大白豬引起損失的不良等位基因。本論文描述的QTL是家畜中基因影響肌肉發(fā)育的第2個(gè)例子，顯示非孟德?tīng)栠z傳模式的存在。事實(shí)上我們前面也證明該多態(tài)位點(diǎn)(與數(shù)量性狀相關(guān)，其中肌肉是雙倍的)特點(diǎn)通過(guò)極性超優(yōu)勢(shì)控制，其中僅僅從親本那兒遺傳了CLPG突變的異源合子個(gè)體表達(dá)雙肌肉度表型。這表明由親本起源作用影響產(chǎn)生性狀的基因在家養(yǎng)動(dòng)物中是相對(duì)普遍的。實(shí)施例3豬中IGF2參比序列和相鄰位點(diǎn)的生成本發(fā)明提供了一定位于豬IGF2位點(diǎn)的對(duì)肌肉質(zhì)量有巨大作用的遺傳的QTL，并且用該QTL作工具用于標(biāo)記輔助選擇中。為在標(biāo)記輔助選擇中更好用QTL也為更好識(shí)別一原因突變，我們建立了一參比序列，該序列包括全部豬的IGF2序列和其相鄰基因。為得到該序列，我們以IGF2為探針從豬BAC基因文庫(kù)中篩到兩個(gè)BAC。證明BAC-PIGF2-1含有INS和IGF2基因，而B(niǎo)AC-PIGF2-2含有IGF2和H19基因。NotI圖譜和兩個(gè)BAC的相對(duì)位置如圖5所示。BAC-PIGF2-1用標(biāo)準(zhǔn)程序點(diǎn)掃描測(cè)序和自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用標(biāo)準(zhǔn)軟件處理，產(chǎn)生115個(gè)毗連群。相應(yīng)序列見(jiàn)表6。在豬的毗連群和人的同向起源序列之間進(jìn)行了相同的研究，檢測(cè)到18個(gè)毗連群有顯著、同源性，見(jiàn)圖7。對(duì)BAC-PIGF-2，對(duì)BAC-PIGF2-1中沒(méi)有的24kbNotI片段再克隆，用ELTN轉(zhuǎn)座子方法和BAI自動(dòng)儀序列進(jìn)行了測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用Phred-Phrap-consed程序處理，產(chǎn)生7個(gè)不同的毗連群(見(jiàn)圖8)。毗連群序列和用GCG單位比較和點(diǎn)打印程序進(jìn)行處理的人的同向起源序列進(jìn)行了比較排列。相應(yīng)結(jié)果見(jiàn)圖9。實(shí)施例4IGF2和相鄰基因座的DNA序列多態(tài)性的確定在實(shí)施例1描述的參比序列的基礎(chǔ)上，我們對(duì)來(lái)源于Pietrain，大白豬和Boar野豬個(gè)體的基因組DNA的IGF2的部分和其相鄰基因座進(jìn)行了重新測(cè)序，使得可以對(duì)圖10中報(bào)道的DNA序列多態(tài)性進(jìn)行鑒定。圖1野豬大白豬雜交種中第2號(hào)染色體QTL分析中獲得的測(cè)試統(tǒng)計(jì)曲線(xiàn)。曲線(xiàn)代表的是F比率，它檢測(cè)在染色體上一特定位置的單一QTL對(duì)特定性狀的作用的特設(shè)。RosambiCentiMorgom標(biāo)記之間的距離的標(biāo)記圖譜標(biāo)記x-軸?？v座標(biāo)表示基因組重要性(P＜0.05)，和豬胴腿肉內(nèi)瘦肉性狀水平；其它性狀也有相似的重要閾值。圖2特征性的肌肉過(guò)度生長(zhǎng)的Pietrain豬。圖3豬染色體2上測(cè)定肌肉質(zhì)量和脂肪沉積的6個(gè)表型在Pietrain和大白豬雜交實(shí)驗(yàn)獲得里的對(duì)數(shù)數(shù)值曲線(xiàn)。顯示了微衛(wèi)星標(biāo)記繪圖的連鎖分析測(cè)定的Igf2和MyOD基因的最可能位置。H0指沒(méi)有QTL的無(wú)義假設(shè)；H1指孟爾定律QTL的存在檢測(cè)；H2指父本表達(dá)QTL的存在檢測(cè)；H3指母本表達(dá)QTL的存在檢測(cè)。3alog10(H1/H0)；3blog(H2/H0)；3clog(H3/H0)圖4A.根據(jù)參考17的人類(lèi)Igf2基因結(jié)構(gòu)，以及參考16報(bào)道的豬成年肝cDNA序列進(jìn)行對(duì)比排列。圖中也示出nt241(G-A)轉(zhuǎn)換位置和Swc9微衛(wèi)星的位置。B.相應(yīng)的標(biāo)記用來(lái)證明10周齡的胚胎中骨骼肌和肝中Igf2的單一等位基因(父本)表達(dá)。nt421(G-A)多態(tài)性和基因組DNA中Swc9中微衛(wèi)星的PCR擴(kuò)增可清楚表明胚胎的異源性，而只有父本的等位基因在肝(nt421(G-A)和SWC9)和肌肉的cDNA中被檢測(cè)出來(lái)。從一胚胎肌肉的nt421(G-A)RT-PCR產(chǎn)物的缺乏證明該組織中包括外顯子2在內(nèi)的mRNA的缺乏。胎兒等位基因的親本起源由雌、雄性親本的基因型決定(數(shù)據(jù)未顯示)。圖5一個(gè)NotI限制性圖譜；表明了BAC-PIGF2-1(包括INS和IGF2基因)和BAC-PIGF2-2(包括IGF2和H19基因)的相對(duì)位置。圖6從BAC-PIGF2-1中來(lái)的毗連群1至115的核酸序列，是用標(biāo)準(zhǔn)方法和自動(dòng)測(cè)序儀點(diǎn)掃射測(cè)序。圖7圖6的豬毗連群和人的直向同源基因間的序列相似性。圖8從BAC-PIGF2-2中來(lái)的毗連群1到7的核酸序列(在BAC-PIGF2-1中未存在的24kbNotI片段)，它們用EZ∷TN轉(zhuǎn)座子方法和ABI自動(dòng)測(cè)序儀亞克隆并測(cè)序。圖9圖8的豬的毗連群和人的直向同源基因間的序列相似性。圖10從Pietrain，大白豬和Boar野豬分離的基因組DNA的IGF2和其鄰基因位點(diǎn)的DNA序列多態(tài)性。參考文獻(xiàn)實(shí)施例1中所引用的文獻(xiàn)1.Andersson，L.等，負(fù)責(zé)豬生長(zhǎng)及肥瘦的數(shù)量性狀基因座的遺傳作圖，科學(xué)263，1771-1774(1994)。2.Knott，S.A.等，野豬和大白豬的雜交種中數(shù)量性狀基因座的多重標(biāo)記作圖，遺傳學(xué)149，1069-1080(1998)。3.Edfors-Lilja，I.等，負(fù)責(zé)豬的免疫能力的數(shù)量性狀基因座的作圖，免疫學(xué)雜志161，829-835(1998)。4.Andersson-Eklund，L.等，野豬和大白豬雜交種中負(fù)責(zé)胴體和肉的品質(zhì)性狀的數(shù)量性狀基因座的作圖，動(dòng)物科學(xué)雜志76，694-700(1998)。5.Fronicke，L.，Chowdhary，B.P.，Scherthan，H.和Gustavsson，I.，豬和人基因座的對(duì)比圖譜證實(shí)ZOO-FISH和基于基因作圖的染色體同源性，哺乳動(dòng)物基因組7，285-90(1996)。6.Alexander，L.J.等，含有微衛(wèi)星體的68個(gè)豬粘粒和λ克隆的物理對(duì)比，哺乳動(dòng)物基因組7，368-372(1996)。7.Rohrer，G.A.等，豬基因組的完整圖譜，基因組研究6，371-3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