一種提高多倍體楊樹(shù)配子育性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用現(xiàn)有多倍體植物資源的方法，特別涉及一種提高多倍體植物 配子育性的方法，屬于植物遺傳育種領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 利用多倍體材料作為親本是植物染色體工程育種、創(chuàng)育多倍體新種質(zhì)最直接的手 段。然而，由于多倍體植物減數(shù)分裂過(guò)程同源染色體聯(lián)會(huì)及分離的不規(guī)律性，聯(lián)會(huì)多價(jià)體在 中期I時(shí)排列取向不規(guī)則，后期I染色體不均等分離，產(chǎn)生大量染色體數(shù)非整倍的配子，當(dāng) 配子中缺少某條具功能染色體，或者雖然沒(méi)有缺失具功能染色體，而基因間的協(xié)調(diào)性受到 影響時(shí)，必然會(huì)造成配子敗育，導(dǎo)致形成正常可育配子的概率極低，不利于有性雜交產(chǎn)生后 代。
[0003] 現(xiàn)有獲得多倍體植物的重要途徑是利用理化方式處理使得染色體加倍，誘導(dǎo)植 物未減數(shù)（2n)配子進(jìn)行雜交而成。在楊樹(shù)倍性育種研宄中，張志毅、康向陽(yáng)等均通過(guò)秋 水仙堿和高溫處理等方式獲得過(guò)高達(dá)80%以上的2n花粉得率（張志毅，李鳳蘭.白 楊染色體加倍技術(shù)研宄及三倍體育種（I)--花粉染色體加倍技術(shù).北京林業(yè)大學(xué)學(xué) 報(bào)，1992, 14(增 3):52-58;ZhangZY,LiFL,ZhuZT,KangXY.Doublingtechnologyof pollenchromosomeofPopulustomentosaanditshybrid.J.BeijingFor.Univ. (EnglishEd. )，1997, 6 (2): 9-20;康向陽(yáng)，朱之悌，林惠斌.楊樹(shù)花粉染色體加倍有效處 理時(shí)期的研宄.林業(yè)科學(xué)，1999, 35(4) : 21-24)，并利用加倍后花粉進(jìn)行雜交獲得過(guò)楊樹(shù)三 倍體后代。
[0004] 然而，與對(duì)應(yīng)樹(shù)種的正?；ǚ巯啾龋颖逗蟮奈礈p數(shù)花粉普遍存在萌發(fā)進(jìn) 程遲緩等問(wèn)題，由于存在正常單倍性花粉的競(jìng)爭(zhēng)，致使參與受精的競(jìng)爭(zhēng)力低下（康 向陽(yáng)，朱之悌.白楊2n花粉生命力測(cè)定方法及萌發(fā)特征的研宄.云南植物研 宄，1997, 19 (4): 402-406)，直接導(dǎo)致了授粉雜交后的三倍體得率（不足0? 1% )遠(yuǎn)遠(yuǎn)低 于用于授粉的混合花粉中的2n花粉比率。這種加倍花粉生活力低下的原因被認(rèn)為可能 與加倍花粉自身遺傳上的不平衡和在花粉中殘余的秋水仙藥液的影響等因素有關(guān)。類(lèi)似 未減數(shù)花粉萌發(fā)率低、萌發(fā)遲緩的現(xiàn)象在杜鵑紅山茶、杜仲等材料中均有所報(bào)道（王有 兵，徐斌，張方秋，等.杜鵑紅山茶2n花粉自然發(fā)生及其誘導(dǎo)初步研宄.廣東林業(yè)科 技，2011，27(6) :9-15;毛彥科.高溫誘導(dǎo)杜仲配子染色體加倍技術(shù)研宄.北京林業(yè)大學(xué) 碩士學(xué)位論文，2012)，表明加倍處理盡管能獲得較高的2n花粉得率，但是與對(duì)應(yīng)樹(shù)種的 正?；ǚ巯啾?，其生活力卻可能顯著下降。正因如此，近年來(lái)，在楊樹(shù)等樹(shù)種的多倍體誘導(dǎo) 研宄中，已較少采用理化處理誘導(dǎo)花粉染色體加倍，并利用加倍花粉進(jìn)行雜交的方式來(lái)獲 取多倍體，而普遍選用三倍體誘導(dǎo)率較高的雌配子染色體加倍途徑（康向陽(yáng)，張平冬，高 鵬，等.秋水仙堿誘導(dǎo)白楊三倍體新途徑的發(fā)現(xiàn).北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004, 26(1): 1-4; Wang J，Li DL，Kang XY. Induction of unreduced megaspores with high temperature during megasporogenesis in Populus. Annals of Forest Science，2012,69(1):59-67 ; Xi XJ，Guo LQ，Xu WT, et al. Megasporogenesis, megagametogenesis, and induction of 2n eggs with colchicine in poplar section Aigeiros. Scandinavian Journal of Forest Research, 2014, 29(6) :527-536.) 〇
[0005] 眾所周知，植物產(chǎn)生花粉的數(shù)量巨大，一次收獲花粉可以滿(mǎn)足大量的雜交需求，如 能開(kāi)發(fā)一種新的技術(shù)手段，獲得較高比例加倍花粉的同時(shí)，提高加倍花粉的生活力，必將對(duì) 植物多倍體的大規(guī)模創(chuàng)制做出巨大貢獻(xiàn)?？迪蜿?yáng)等曾提出利用不同倍性花粉對(duì)Y射線(xiàn)的 輻射耐受性差異，提高加倍花粉的萌發(fā)競(jìng)爭(zhēng)力的方法（康向陽(yáng)，朱之悌，林惠斌.白楊不 同倍性花粉的輻射敏感性及其應(yīng)用.遺傳學(xué)報(bào)，2000, 27(1) : 78-82.)，并在育種中加以利 用，將該途徑的三倍體得率提高到了 12.9% (康向陽(yáng)，朱之悌，張志毅.銀腺楊與毛新楊 正反交三倍體選育.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000, 22(6) :8-11)。然而，該技術(shù)操作繁瑣，且存 在輻射危害性，不同樹(shù)種的輻射劑量存在差異，在實(shí)際生產(chǎn)中難以推廣。因此，有必要?jiǎng)?chuàng)新 技術(shù)手段，推動(dòng)理化處理誘導(dǎo)植物花粉染色體加倍選育多倍體技術(shù)進(jìn)步，提高加倍后的花 粉的生活力的同時(shí)，確保操作的便捷性、安全性和實(shí)用性，從而消除對(duì)花粉染色體加倍途徑 選育植物多倍體的技術(shù)偏見(jiàn)。
[0006] 將多倍體植株用作育種親本，一條可行的途徑是誘導(dǎo)形成高度異源四倍體植株， 由于異源四倍體植株在減數(shù)分裂過(guò)程中，幾乎不存在同源染色體配對(duì)紊亂的問(wèn)題，因此可 正常完成減數(shù)分裂過(guò)程，形成可育的染色體減數(shù)配子。然而，異源四倍體的誘導(dǎo)需要利用來(lái) 源不同的2n雌雄配子融合，或者對(duì)遠(yuǎn)緣雜種實(shí)施體細(xì)胞染色體加倍，誘導(dǎo)難度大，而且，即 便獲得異源四倍體，還需要等待其開(kāi)花才能有性利用，周期長(zhǎng)。因此，開(kāi)發(fā)一種即時(shí)、有效、 可靠的提高多倍體楊樹(shù)配子育性的方法，對(duì)于充分利用現(xiàn)有多倍體品種資源，通過(guò)多倍體 有性雜交途徑提高多倍體新種質(zhì)創(chuàng)育效率，創(chuàng)制大量多倍體種質(zhì)資源，推動(dòng)楊樹(shù)多倍體育 種研宄進(jìn)展具有重要價(jià)值和實(shí)踐意義，同時(shí)對(duì)于其他類(lèi)似植物的多倍體植株配子育性提高 技術(shù)具有重要的借鑒意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有多倍體植物配子育性低，配子敗育率高，不利于有性雜 交產(chǎn)生后代的技術(shù)問(wèn)題，提供一種顯著提高現(xiàn)有多倍體植物配子育性的方法，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)有多 倍體植物尤其是多倍體楊樹(shù)品種的有性利用，為多倍體新種質(zhì)創(chuàng)育服務(wù)，而且本發(fā)明方法 在提高多倍體楊樹(shù)配子育性方面具有較強(qiáng)的即時(shí)性、有效性、可靠性。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提供一種提高多倍體植物配子育性的方法， 包括對(duì)處于減數(shù)分裂時(shí)期的孢母細(xì)胞進(jìn)行誘變處理，其中所述誘變處理是對(duì)花芽注射化學(xué) 藥劑。
[0009] 其中，所述化學(xué)藥劑為秋水仙堿溶液。
[0010] 特別是，所述秋水仙堿溶液的重量百分比濃度為〇. 1-0. 5%，優(yōu)選為0. 5%。
[0011] 其中，在所述誘變處理過(guò)程中，向花芽?jī)?nèi)注射4-6次的秋水仙堿溶液；相鄰兩次注 射的時(shí)間間隔為3-5h ;誘變處理時(shí)環(huán)境溫度為5-KTC。
[0012] 特別是，在所述誘變處理過(guò)程中，向花芽?jī)?nèi)注射5次的秋水仙堿溶液；相鄰兩次注 射的時(shí)間間隔為4h。
[0013] 其中，所述多倍體植物為多倍體楊樹(shù)。
[0014] 特別是，所述多倍體楊樹(shù)選擇三倍體楊樹(shù)雜種或者同源四倍體楊樹(shù)。
[0015] 尤其是，所述三倍體楊樹(shù)雜種選擇三倍體'銀中楊'（Populus albaXP. berolinensis 'Yinzhong'）、三倍體白楊雜種、三倍體青楊雜種、三倍體黑楊雜種；所述四 倍體楊樹(shù)選擇四倍體白楊雜種或四倍體青楊雜種。
[0016] 其中，所述孢母細(xì)胞處于減數(shù)分裂的粗線(xiàn)期或終變期。
[0017] 特別是，按照如下步驟確定所述處于減數(shù)分裂時(shí)期的孢母細(xì)胞：首先采集雄花芽， 用Farmer氏固定液于4°C進(jìn)行固定30分鐘；接著將花藥從花芽上取下并置于載玻片上； 然后用2%醋酸洋紅染色液染色并夾碎花藥，于明場(chǎng)顯微鏡下觀(guān)察，確定孢母細(xì)胞的發(fā)育時(shí) 期。
[0018] 尤其是，所述Farmer氏固定液由體積之比為3 :1的95 %乙醇和乙酸組成。
[0019] 特別是，還包括將誘變處理后的雄花芽在溫度為15-25°C的條件下培養(yǎng)至雄花序 發(fā)育成熟。
[0020] 本發(fā)明提高多倍體植物配子育性的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0021] 1、本發(fā)明方法處理后的多倍體楊樹(shù)的配子育性顯著提高，花粉萌發(fā)率顯著提高， 經(jīng)過(guò)本發(fā)明方法處理的花粉的萌發(fā)率是為正常多倍體楊樹(shù)花粉萌發(fā)率的9. 9倍以上，甚至 達(dá)到18. 7倍。
[0022] 2、采用本發(fā)明方法處理的多倍體楊樹(shù)的花粉的直徑差異顯著，花粉中存較高比 例的大花粉，并且花粉直徑兩極分化明顯，直徑頻率分布呈雙峰分布；本發(fā)明方法處理使 得'銀中楊'部分花粉直徑增加，產(chǎn)生較高比例染色體數(shù)未減數(shù)的大花粉，大花粉比例達(dá)到 44. 7% 〇
[0023] 3、本發(fā)明方法為多倍體楊樹(shù)的各條染色體人為地提供同源染色體，幫助其完成配 對(duì)，克服多倍體材料減數(shù)分裂過(guò)程染色體配對(duì)、分離紊亂的問(wèn)題，顯著提高配子育性，從而 實(shí)現(xiàn)多倍體楊樹(shù)品種的有性利用，提高楊樹(shù)新種質(zhì)創(chuàng)育效率。
[0024] 4、本發(fā)明方法抑制多倍體楊樹(shù)減數(shù)第一次分裂過(guò)程紡錘絲形成，阻止多倍體材料 減數(shù)分裂過(guò)程染色體不平衡分離保證減數(shù)第二次分裂過(guò)程姊妹染色單體的平衡分離，從而 確保形成整倍性且染色體數(shù)量平衡的配子，顯著提高配子育性，實(shí)現(xiàn)多倍體楊樹(shù)品種的有 性利用，提高楊樹(shù)新種質(zhì)創(chuàng)育效率。
[0025] 5、本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)現(xiàn)有多倍體植物尤其是多倍體楊樹(shù)品種的有性利用，而且 本發(fā)明方法在提高多倍體楊樹(shù)配子育性方面具有較強(qiáng)的即時(shí)性、有效性、可靠性。
[0026] 6、本發(fā)明方法具有操作簡(jiǎn)單、周期短、使用的儀器易得，耗資較少，易于操作，結(jié)果 可靠，有助于對(duì)多倍體植物有性雜交繁殖。
[0027] 7、本發(fā)明提高多倍體楊樹(shù)配子育性的方法，對(duì)于充分利用現(xiàn)有多倍體品種資源， 通過(guò)多倍體有性雜交途徑提高多倍體新種質(zhì)創(chuàng)育效率，創(chuàng)