一種以含殺菌劑衣膜包囊植物組培外植體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬農(nóng)林領(lǐng)域的植物組織培養(yǎng)技術(shù)，具體涉及降低植物組培外植體培養(yǎng)污染 率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物組織培養(yǎng)技術(shù)種苗生產(chǎn)、脫除病毒、種質(zhì)改良等具有廣闊的市場前景。目前 植物組織培養(yǎng)技術(shù)環(huán)節(jié)中，外植體污染的防治是組織培養(yǎng)成功的主要難點。外植體所攜帶 微生物包括表面雜菌和內(nèi)生菌，表面雜菌主要是真菌和細(xì)菌，通過短時間的浸泡消毒比較 容易清除，首選的外植體消毒方法都是浸泡法，先用70%酒精浸泡10-30s，0. 1%氯化汞浸 8-12min或用2%次氯酸鈉(飽和次氯酸鈣溶液)浸泡15-20 min，氯化汞對人毒性極強，對環(huán) 境危害大，次氯酸鹽消毒效果也不盡人意。內(nèi)生菌存在于組織內(nèi)部，主要是細(xì)菌，液體消毒 劑短時間不易滲入殺滅，而內(nèi)生菌潛伏期長（5天以上)，造成培養(yǎng)期間大面積污染，雖然有 在培養(yǎng)基添加抗生素，但抗生素殺菌范圍窄，微生物易產(chǎn)生抗藥性?？傊?，外植體除菌目前 仍沒理想的方法，外植體污染的防治是組織培養(yǎng)成功的主要難點。
[0003] 目前已經(jīng)公告的專利，一些外植體消毒劑專利仍使用氯化汞或次氯酸鈉，如公 布號 101933459A、1628507A、102499077A、101138317 A、102326514 A、102349438A、 102577975A、101946809 A，不含汞或次氯酸鈉(鈣）的外植體消毒劑專利有公布號 101632392、101461329、102742506A，上述專利均采用浸泡消毒法。將殺菌劑加入培養(yǎng)基 抑菌的專利有公布號：101946809A和101138317。公布號103283604A采用無菌去離子水 浸泡百合外植體，可以使外植體表層細(xì)胞破裂，內(nèi)生菌溢出，再浸泡消毒除菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明以衣膜(混合殺菌劑）包囊整個組培外植體再接種到培養(yǎng)基培養(yǎng)，衣膜透水 透氣，對植物細(xì)胞沒明顯傷害，培養(yǎng)基營養(yǎng)及激素能被外植體吸收，細(xì)胞呼吸不受影響。與 常規(guī)的外植體消毒相比，具時間上和空間上的優(yōu)勢，（1)與常規(guī)的短時間浸泡消毒不同，本 發(fā)明衣膜包囊整個外植體接種，殺菌劑有較長時間(整個培養(yǎng)期間）作用于外植體表面抑殺 雜菌，也有足夠時間滲入組織殺滅內(nèi)生菌。（2)抑制外植體污染也經(jīng)常在培養(yǎng)基添加抗菌 劑，該方法只有與培養(yǎng)基接觸的外植體部分，抗菌劑才起抑殺作用，本發(fā)明衣膜包囊整個外 植體，防止雜菌繁殖擴散到培養(yǎng)基，尤其是衣膜封堵了外植體切面，防止內(nèi)生菌繁殖擴散到 培養(yǎng)基造成污染。由于本發(fā)明殺菌劑應(yīng)用上具時間上和空間上的優(yōu)勢，衣膜劑可含較低的 殺菌劑使用劑量，對植物組織傷害小，還可選用低毒環(huán)保的殺菌劑。
[0005] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下： 一種含殺菌劑衣膜包囊植物組培外植體方法，其特征在于，衣膜劑透氣、透水，透光性 好，不與培養(yǎng)基成分發(fā)生反應(yīng)，對植物細(xì)胞傷害小。成膜劑采用海藻酸鈉，衣膜劑的營養(yǎng)成 分、激素、酸堿度與培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分、激素、酸堿度一致，殺菌劑在衣膜劑酸堿度下具殺菌 能力。
[0006] 所述的成膜劑海藻酸鈉濃度2%_5%，海藻酸鈉交聯(lián)固化劑為2%氯化鈣溶液。殺菌 劑一種或幾種組合，在衣膜劑中的濃度分別為：抗生素〇. 〇〇5%-〇. 03%、3_羥基-5-甲基異惡 唑(惡霉靈)〇. 02-0. 2%、3_ (二甲氨基)丙基氨基甲酸丙酯鹽酸鹽(霜霉威鹽酸鹽)0. 1-0. 5%、 三乙磷酸鋁0. 1-0. 5%、甲酚磺酸0. 05-0. 5%、異噻唑啉酮0. 05-0. 5%、十二烷基二甲基芐基 溴化銨(新潔爾滅)〇. 02-0. 2%、重氮烷基咪唑脲(極美-11)0. 1-0. 5%、亞硫酸氫鈉0. 1-0. 5%、 六亞甲基四胺(烏洛托品）0. 1-0. 5%。
[0007] 海藻酸鈉衣膜劑配制方法：海藻酸鈉先用少量水溶化，附加的營養(yǎng)成分、植物激素 與培養(yǎng)基成分相同，能耐高壓滅菌的成分(包括殺菌劑）按常規(guī)方法配成水溶液，與海藻酸 鈉混合，定容，調(diào)pH與培養(yǎng)基相同，高壓滅菌，得粘稠液冷卻待用。不耐高壓滅菌的營養(yǎng)成 分、植物激素、殺菌劑混合液過濾除菌，加入已經(jīng)高壓滅菌的海藻酸鈉，攪拌混勻待用。氯化 鈣單獨高壓滅菌。接種時將已經(jīng)消毒的外植體泡入含附加成分的海藻酸鈉衣膜劑，取出輕 輕抖掉多余衣膜劑粘稠液，粘有衣膜劑的外植體投入氯化鈣溶液，固化數(shù)分鐘，取出投入無 菌水洗去多余氯化鈣，在無菌濾紙上吸去無菌水，接種在培養(yǎng)基表面，輕壓外植體使其稍陷 入培養(yǎng)基瓊脂塊。
[0008] 本發(fā)明的有益效果在于：含殺菌劑衣膜包囊植物組培外植體，較常規(guī)抑制外植體 微生物污染方法，擴大了殺菌劑與外植體的接觸面積和時間，而且殺菌劑有足夠時間滲入 外植體組織殺滅內(nèi)生菌，阻止或減慢外植體所帶雜菌(包括內(nèi)生菌）傳染到培養(yǎng)基造成大面 積污染。該方法操作簡便，提高外植體接種成活率效果明顯，便于推廣應(yīng)用。
【具體實施方式】
[0009] 實施例一 三角梅（及|葉片流水沖洗30分鐘，浸入75%乙醇30秒鐘， 無菌水洗滌2次，于0. 1%氯化汞浸泡10分鐘，無菌水漂洗5次，濾紙吸干表面水分，培養(yǎng)基 成分 MS+2. 0 mg/L 6-BA+1. 0 mg/L NAA+ 30g/L 鹿糖，pH 至 5. 8 (高壓滅菌后降至 5. 6)，葉 片切成小塊，對照組直接接種。衣膜包囊外植體方法，海藻酸鈉濃度4%，附加與培養(yǎng)基成分 一致的營養(yǎng)成分和激素，調(diào)pH至5. 8(高壓滅菌后降至5. 6)，高壓滅菌后冷卻待用。殺菌劑 3-羥基-5-甲基異惡唑(惡霉靈)混合六亞甲基四胺(烏洛托品)母液，加入已高壓滅菌的海 藻酸鈉與營養(yǎng)、激素的混合液，使惡霉靈終濃度〇. 1%、烏洛托品終濃度〇. 2%，調(diào)pH至5. 6,備 用。另2%氯化鈣高壓滅菌冷卻待用。接種時將已經(jīng)常規(guī)消毒的葉切塊泡入含殺菌劑的海 藻酸鈉衣膜劑，取出輕輕抖掉多余粘稠液，投入氯化鈣溶液，固化3分鐘，取出投入無菌水 洗去多余氯化鈣，在無菌濾紙上吸去無菌水，接種外植體平鋪培養(yǎng)基表面，輕壓使其稍陷入 瓊脂培養(yǎng)基。每瓶接種6個切片，每次5瓶，重復(fù)3次，每處理合計90片外植體。接種后在 25°C、15001ux 光下培養(yǎng)，光照 12h/d。
[0010] 表1三角梅葉切塊的衣膜包囊外植體培養(yǎng)法效果觀察*
【主權(quán)項】
1. 一種以含殺菌劑衣膜包囊植物組培外植體的方法，其特征在于：衣膜劑包括海藻酸 鈉、殺菌劑、營養(yǎng)成分、植物激素，衣膜劑粘液透水、透氣，基本無色透明，將經(jīng)表面消毒的外 植體浸入衣膜劑粘液，取出投入氯化鈣溶液固化，接種于培養(yǎng)基培養(yǎng)。
2. 如權(quán)利要求1所述的以含殺菌劑衣膜包囊植物組培外植體的方法，其特征在于：所 述海藻酸鈉濃度為2%-5%，高壓滅菌。
3. 如權(quán)利要求1所述的以含殺菌劑衣膜包囊植物組培外植體的方法，其特征在于：所 述的氯化鈣溶液濃度2%，高壓滅菌。
4. 如權(quán)利要求1所述的以含殺菌劑衣膜包囊植物組培外植體的方法，其特征在于：所 述的衣膜劑的營養(yǎng)成分、激素、酸堿度與培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分、激素、酸堿度一致。
5. 如權(quán)利要求1所述的以含殺菌劑衣膜包囊植物組培外植體的方法，其特征在于： 所述殺菌劑在衣膜劑酸堿度下保持殺菌能力，殺菌劑在衣膜劑中的終濃度分別為：抗生素 0. 005%-0. 03%、3-羥基-5-甲基異惡唑（惡霉靈）0. 02-0. 2%、3-(二甲氨基）丙基氨基甲酸 丙酯鹽酸鹽(霜霉威鹽酸鹽）〇. 1-0. 5%、三乙磷酸鋁0. 1-0. 5%、甲酚磺酸0. 05-0. 5%、異噻唑 啉酮0. 05-0. 5%、十二烷基二甲基芐基溴化銨(新潔爾滅）0. 02-0. 2%、重氮烷基咪唑脲(極 美-II) 0. 1-0. 5%、亞硫酸氫鈉0. 1-0. 5%、六亞甲基四胺(烏洛托品）0. 1-0. 5%，可選用其中 一種或數(shù)種組合應(yīng)用。
6. 如權(quán)利要求1所述的以含殺菌劑衣膜包囊植物組培外植體的方法，其特征在于：所 述的營養(yǎng)成分、植物激素、殺菌劑，耐高壓滅菌的混溶于海藻酸鈉溶液一起高壓滅菌，不耐 高壓滅菌的過濾除菌后混溶于已高壓滅菌海藻酸鈉溶液。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種在植物組培中，以含殺菌劑衣膜包囊外植體以降低微生物污染率的方法，屬農(nóng)林領(lǐng)域的植物組織培養(yǎng)技術(shù)。包括以透氣、透水、透光性好，對植物組織傷害小的衣膜包囊組培外植體。成膜劑為海藻酸鈉溶液，附加殺菌劑、營養(yǎng)成分、植物激素后包囊外植體，投入氯化鈣溶液交聯(lián)固化，接種培養(yǎng)。含殺菌劑衣膜包囊組培外植體擴大了殺菌劑與外植體的接觸面積，延長殺菌劑作用時間，有效殺滅外植體表面污染菌及內(nèi)生菌。該方法操作簡便，降低外植體污染率效果明顯，成本低廉，便于推廣應(yīng)用。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號】CN104521762
【申請?zhí)枴緾N201510033462
【發(fā)明人】劉福平
【申請人】福建省亞熱帶植物研究所
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2015年1月23日