一種減輕植物組培外植體褐化的衣膜包囊培養(yǎng)法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬農(nóng)林領(lǐng)域的植物組織培養(yǎng)技術(shù)，具體涉及降低植物組培外植體初代培養(yǎng) 褐化率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物組織培養(yǎng)技術(shù)種苗生產(chǎn)、脫除病毒、種質(zhì)改良等具有廣闊的市場(chǎng)前景。目前 植物組織培養(yǎng)技術(shù)環(huán)節(jié)還存在不少問(wèn)題，外植體(種子、芽、莖段、葉、根、花瓣、果實(shí)等）初代 誘導(dǎo)期間褐化死亡是制約組織培養(yǎng)成功的瓶頸。其原因?yàn)椋弘x體組織或器官切口細(xì)胞所含 酚類(lèi)物質(zhì)在空氣(氧氣）中酶促反應(yīng)成醌類(lèi)物質(zhì)，后者再通過(guò)非酶促反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)而導(dǎo) 致組織褐化并擴(kuò)散，抑制細(xì)胞其它酶的活性，影響細(xì)胞的正常代謝，導(dǎo)致整個(gè)組織死亡。 褐化在木本植物、多年生植物、熱帶植物等體內(nèi)單寧類(lèi)和羥酚類(lèi)化合物含量高的植物尤其 明顯。克服外植體褐化的方法主要有：選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w采集季節(jié)和部位；接種前用抗氧 化劑短時(shí)間浸泡外植體；培養(yǎng)基添加抗褐化劑(抗氧化劑、抗氧化酶活性促進(jìn)劑和酚類(lèi)物質(zhì) 吸附劑）；外植體熱激處理（45-50°C抑殺多酚氧化酶、苯并氨酸酶)，培養(yǎng)物多次轉(zhuǎn)移到新鮮 培養(yǎng)基，如專(zhuān)利公布號(hào) CN 103250645 A、CN 102986534、CN 102986533、CN 103004754 A、 CN 102805032 A、 CN 102823490 A、 CN 102577953 A、 CN 103125380 A、 CN 102318560 A、 CN102860255A、CN 102115727 A、CN 103202233 A、、CN 103004602 A、CN 102870677 A、CN 101148653、CN 1737142、CN1742564等。這些方法針對(duì)外植體褐化某一因素或只是被動(dòng)的 方法，效果都有局限性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明以衣膜(混合抗褐化齊[J、營(yíng)養(yǎng)、激素成分）包囊整個(gè)組培外植體再接種到培 養(yǎng)基培養(yǎng)，衣膜透水、透氣、透光，對(duì)植物組織沒(méi)有明顯傷害，細(xì)胞呼吸不受影響，培養(yǎng)基營(yíng) 養(yǎng)及激素能被外植體吸收不受影響。相對(duì)常規(guī)的抗褐化劑使用方法，優(yōu)越性為（1)衣膜包 囊整個(gè)外植體培養(yǎng)，擴(kuò)大了外植體與抗褐化劑的接觸作用的面積和時(shí)間；（2)衣膜包囊整 個(gè)外植體，隔絕了大部分空氣，減輕細(xì)胞酚類(lèi)物質(zhì)被酶促氧化成醌類(lèi)物質(zhì)而毒害組織細(xì)胞；
[3] 采用40°C _45°C卡拉膠包囊，熱激外植體降低褐化相關(guān)酶活性，減輕褐化，提高外植體 培養(yǎng)成活率。
[0004] 一種減輕植物組培外植體褐化的包囊培養(yǎng)法，其特征在于，包囊外植體所采用的 成膜劑配成的衣膜不與培養(yǎng)基成份起反應(yīng)，透氣、透水性好，耐高壓滅菌，凝固的衣膜透光 性好，對(duì)植物細(xì)胞傷害小，本發(fā)明采用海藻酸鈉或溫?zé)峥ɡz為成膜劑，附加成分包括抗褐 化劑、營(yíng)養(yǎng)成分、激素。營(yíng)養(yǎng)成分、激素、酸堿度依照外植體培養(yǎng)基所采用配方和酸堿度，抗 褐化劑在成膜劑酸堿度下有抗氧化能力，一般為弱酸性包括抗壞血酸、半胱氨酸鹽、檸檬 酸、亞硫酸氫鈉、硫脲，可選一種或一種以上組合。
[0005] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下： 衣膜劑各組分含量：所述的成膜劑海藻酸鈉濃度2%-5%，或卡拉膠濃度0. 5-0. 7%。海 藻酸鈉交聯(lián)固化劑為2%氯化鈣溶液?？购只瘎舛龋嚎箟难?0-300mg/L、半胱氨酸鹽 10-300mg/L、檸檬酸10-300mg/L、亞硫酸氫鈉10-300mg/L、硫脲10-300mg/L，一種或幾種組 合。
[0006] 海藻酸鈉衣膜劑配制、使用方法：海藻酸鈉先用少量水溶化，耐高壓滅菌的抗褐化 劑檸檬酸、亞硫酸鈉、硫脲用少量水溶化，耐高壓滅菌的營(yíng)養(yǎng)成分、激素按常規(guī)方法配成水 溶液，上述組分混合，用水定容，調(diào)pH與培養(yǎng)基相同，高壓滅菌，得粘稠液冷卻待用?？箟难?酸、半胱氨酸鹽溶液及不耐高壓滅菌的營(yíng)養(yǎng)成分、激素分別過(guò)濾除菌，加入已經(jīng)高壓滅菌的 海藻酸鈉衣膜劑，攪拌混勻待用。氯化鈣單獨(dú)高壓滅菌。接種前將已經(jīng)表面消毒的外植體 泡入海藻酸鈉衣膜劑，取出輕輕抖掉多余衣膜劑粘稠液，投入氯化鈣溶液，固化數(shù)分鐘，取 出投入無(wú)菌水洗去多余氯化鈣，在無(wú)菌濾紙上吸去無(wú)菌水，接種時(shí)輕壓外植體包囊使其稍 陷入瓊脂培養(yǎng)基里。
[0007] 卡拉膠衣膜劑配制、使用方法：0.5-0. 7%卡拉膠先用少量熱水溶化，耐高壓滅菌 的抗褐化劑檸檬酸、亞硫酸氫鈉、硫脲用少量水溶化，耐高壓滅菌的營(yíng)養(yǎng)成分、激素按常規(guī) 方法配成水溶液，上述組分混合，用水定容，調(diào)pH與培養(yǎng)基相同，高壓滅菌?？箟难帷腚?氨酸溶液及不耐高壓滅菌的營(yíng)養(yǎng)成分、激素分別過(guò)濾除菌，加入未冷凝的卡拉膠衣膜劑粘 液，攪拌混勻，調(diào)pH至與經(jīng)高壓滅菌培養(yǎng)基酸堿度相同（一般pH5. 6)，自然冷卻到45-50°C 包囊外植體，卡拉膠衣膜劑也可室溫保存，包囊時(shí)加熱到45-50°C溶化，在超凈工作臺(tái)將經(jīng) 表面消毒的外植體投入卡拉膠衣膜劑粘稠液，取出輕輕抖掉多余粘稠液，晾干凝固。接種時(shí) 輕壓外植體包囊使其稍陷入瓊脂培養(yǎng)基里。
[0008] 本發(fā)明的有益效果在于：一般的防止外植體褐化方法，接種前用抗褐化劑浸泡外 植體，褐化劑作用時(shí)間短，也有將抗褐化劑加入到瓊脂培養(yǎng)基，外植體接種于培養(yǎng)基表面， 與抗褐化劑接觸面積小，本發(fā)明將含抗褐化劑的衣膜劑包囊整個(gè)外植體進(jìn)行接種培養(yǎng)，擴(kuò) 大抗褐化劑作用面積，延長(zhǎng)作用時(shí)間，而且衣膜包囊整個(gè)外植體，能顯著隔絕外植體與空氣 接觸，極大減輕組織細(xì)胞酶促氧化而褐化死亡，45-5CTC卡拉膠粘液包囊外植體，還能抑殺 多酚氧化酶及苯丙氨酸酶，減輕褐化，提高組培外植體成活率。此外由于衣膜劑含與培養(yǎng)基 相同的營(yíng)養(yǎng)和激素成分，保證外植體誘導(dǎo)的正常進(jìn)行。上述因素的綜合作用，明顯減輕植物 組培外植體褐化程度，提高成活率，為外植體誘導(dǎo)成功提供保障。該方法操作簡(jiǎn)便，成本低 廉，效果明顯，便于推廣應(yīng)用。
[0009]
【具體實(shí)施方式】[0010] 實(shí)施例一 蝴蝶蘭)葉切塊流水沖洗30分鐘以上，在超凈臺(tái)用75%乙醇浸泡 30秒鐘，無(wú)菌水洗滌2次，2%次氯酸鈉浸泡30分鐘，無(wú)菌水漂洗3次，濾紙吸干表面水分， 切成小塊外植體，對(duì)照組外植體直接接種，培養(yǎng)基成分l/2MS+6-BA5mg/L+NAA0. 2mg/L+椰 子汁20% (V/V) +蔗糖20g/L，pH 5.8。衣膜包囊外植體方法，海藻酸鈉濃度3%，附加抗褐 化劑亞硫酸鈉終濃度l〇〇mg/L，營(yíng)養(yǎng)、激素成分同上述的培養(yǎng)基成分，調(diào)pH至5. 8,高壓滅 菌后冷卻待用，另2%氯化鈣高壓滅菌待用。接種時(shí)將已經(jīng)消毒的外植體泡入海藻酸鈉衣膜 齊U，取出輕輕抖掉多余粘稠液，投入氯化鈣溶液，固化3分鐘，取出投入無(wú)菌水洗去多余氯 化鈣，在無(wú)菌濾紙上吸去無(wú)菌水。接種時(shí)包囊衣膜的葉片外植體平放，下壓使葉片稍陷入培 養(yǎng)基。每瓶接種6個(gè)外植體，每次5瓶，重復(fù)3次。接種后在25°C、15001ux光下培養(yǎng)，光照 12h/d，結(jié)果見(jiàn)表1。
[0011] 表1蝴蝶蘭葉切塊的衣膜包囊外植體培養(yǎng)法效果觀(guān)察*
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種減輕植物組培外植體褐化的衣膜包囊培養(yǎng)法，其特征在于：由成膜劑混溶抗褐 化劑、營(yíng)養(yǎng)成分、激素所得衣膜劑粘液透氣透水、基本無(wú)色透明，成膜劑可以是海藻酸鈉，經(jīng) 表面消毒的外植體浸入海藻酸鈉溶液，取出表面沾粘有衣膜劑的外植體投入氯化鈣溶液固 化，接種培養(yǎng)；成膜劑也可以是溫?zé)峥ɡz粘液，浸入經(jīng)表面消毒的外植體后取出自然冷 卻，固化后接種培養(yǎng)。
2. 如權(quán)利要求1所述的減輕植物組培外植體褐化的衣膜包囊培養(yǎng)法，其特征在于：所 述的海藻酸鈉濃度為2%-5%。
3. 如權(quán)利要求1所述的減輕植物組培外植體褐化的衣膜包囊培養(yǎng)法，其特征在于：所 述的氯化鈣濃度2%，高壓滅菌。
4. 如權(quán)利要求1所述的減輕植物組培外植體褐化的衣膜包囊培養(yǎng)法，其特征在于：所 述的卡拉膠用溫水配制0. 5%-0. 7%溶度，高壓滅菌，45°C -50°C的粘液用于包囊外植體。
5. 如權(quán)利要求1所述的減輕植物組培外植體褐化的衣膜包囊培養(yǎng)法，其特征在于：所 述衣膜劑的營(yíng)養(yǎng)成分，激素、酸堿度與培養(yǎng)基所的營(yíng)養(yǎng)成分、激素、酸堿度一致。
6. 如權(quán)利要求1所述的減輕植物組培外植體褐化的衣膜包囊培養(yǎng)法，其特征在于： 所述的抗褐化劑在成膜劑酸堿度下有抗氧化能力，包括以下一種或數(shù)種組合：抗壞血酸 10_300mg/L、半胱氨酸鹽10_300mg/L、梓檬酸10_300mg/L、亞硫酸氫鈉10_300mg/L、硫脲 10-300mg/L〇
7. 如權(quán)利要求1所述的減輕植物組培外植體褐化的衣膜包囊培養(yǎng)法，其特征在于：抗 褐化劑檸檬酸、硫脲及耐高壓滅菌的營(yíng)養(yǎng)成分、激素混溶于海藻酸鈉或卡拉膠一起高壓滅 菌，抗褐化劑抗壞血酸、半胱氨酸鹽、亞硫酸氫鈉及不耐高壓滅菌營(yíng)養(yǎng)成分、激素過(guò)濾除菌， 加入經(jīng)高壓滅菌海藻酸鈉或卡拉膠粘液混溶。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種在植物組培中以含抗褐化劑的衣膜劑包囊外植體以減輕外植體褐化的方法，屬農(nóng)林領(lǐng)域的植物組織培養(yǎng)技術(shù)。包括以透氣、透水、透光性好、對(duì)植物組織安全的衣膜劑包囊外植體方法。衣膜劑由成膜劑混溶抗褐化劑及與培養(yǎng)基成分一致的營(yíng)養(yǎng)成分、激素，衣膜劑可以是海藻酸鈉溶液，包囊后以氯化鈣溶液交聯(lián)固化，衣膜劑也可以是45-50℃卡拉膠溶膠，包囊外植體后冷卻固化。本發(fā)明以衣膜劑包囊外植體，擴(kuò)大了外植體與抗褐化劑的接觸面積，隔絕空氣、或熱激效應(yīng)而有效抑制褐化，降低外植體培養(yǎng)死亡率。該方法操作簡(jiǎn)便，成本低廉，效果明顯，便于推廣應(yīng)用。
【IPC分類(lèi)】A01H4-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104521763
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510033463
【發(fā)明人】劉福平
【申請(qǐng)人】福建省亞熱帶植物研究所
【公開(kāi)日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2015年1月23日