植物抗病原體系統(tǒng)的制作方法
【專利說明】植物抗病原體系統(tǒng)
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00980132913. 6、申請(qǐng)日為2009年8月4日、發(fā)明名稱為"植 物抗病原體系統(tǒng)"的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[000引提交數(shù)據(jù)
[0003] 本申請(qǐng)涉及且要求于2008年8月5日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/086, 444的優(yōu)先 權(quán)，所述專利的完整內(nèi)容通過引用合并入本文。
[0004] 領(lǐng)域
[0005] 總的來說，本發(fā)明涉及植物不受植物病原體且特別是不受真菌病原體的保護(hù)。本 發(fā)明特別提供了抑制植物中的病原體感染且改善對(duì)敏感植物的損害的多價(jià)方法。
[000引背景
[0007] 在本說明書中由作者參考的出版物的書目細(xì)節(jié)在說明書結(jié)束時(shí)按字母順序收集。
[0008] 在本說明書中提及任何現(xiàn)有技術(shù)并非且不應(yīng)視為承認(rèn)或W任何形式暗示該個(gè)現(xiàn) 有技術(shù)構(gòu)成任何國(guó)家中的共有一般知識(shí)的部分。
[0009] 由于通過植物病原體例如真菌病原體的感染的農(nóng)作物損失是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的主 要問題，并且每年在殺真菌劑應(yīng)用上花費(fèi)數(shù)百萬美元W制止該些損失（Oerke和Dehne， 2004)。需要鑒定用于處理通過病原體例如真菌感染的新抗微生物劑和策略?？紤]到病原 體發(fā)展抗性的傾向，該是特別重要的。
[0010] 已進(jìn)化出抗微生物膚W保護(hù)生物體不受病原體。它們的特異性在很大程度上依賴 于它們?cè)从谄涞纳矬w，可能是由于由各種病原體置于該些生物體的進(jìn)化壓力。像該樣，與 真菌病原體相比較，從哺乳動(dòng)物物種中分離出的膚一般顯示出針對(duì)細(xì)菌病原體更高程度 的活性，推測(cè)是由于來自細(xì)菌感染的更高風(fēng)險(xiǎn)。相比之下，由于由植物面對(duì)的真菌感染的更 高風(fēng)險(xiǎn)，植物抗微生物膚一般顯示出更高的抗真菌活性。
[0011] 植物防御素代表一類抗微生物膚（由Lay和Anderson, 2005綜述）。存在具有不 同空間和時(shí)間表達(dá)模式和活性譜的廣泛多樣的防御素。
[0012] 該些膚的特異性的潛在機(jī)制仍是未知的，盡管推測(cè)涉及與質(zhì)膜組分的相互作用。 因?yàn)槟ね富窃S多抗微生物膚的共同活性，并且各種細(xì)胞類型的膜組成是高度可變的，所 W特異性脂質(zhì)的存在推測(cè)在某些情況下負(fù)責(zé)抗微生物膚的功效。特別地，細(xì)菌細(xì)胞的質(zhì)膜 在外層中包含帶負(fù)電荷的磯脂，而哺乳動(dòng)物細(xì)胞則不是（Matsuzaki，1999)。該些帶負(fù)電 荷的脂質(zhì)可W與帶正電荷的抗微生物膚相互作用。為支持該個(gè)假設(shè)，體外研究已證實(shí)帶負(fù) 電荷的脂質(zhì)的存在對(duì)于許多抗微生物膚的膜透化活性是重要的（Matsuzaki等人，1995 ; Matsuzaki, 1999 ;E；pand 等人，2006)。
[0013] 膜透化已暗示為關(guān)于某些植物防御素的作用機(jī)制，盡管透化機(jī)制仍未得到研究。 在植物防御素RSAFP2和DmAMPl的情況下，提出透化涉及在細(xì)胞表面上的特定受體。在質(zhì)膜 中特異性銷脂的存在也是該些防御素的活性所需的，可能作為結(jié)合位點(diǎn)（Thevissen等人， 2000 ;Thevissen 等人，2004 ;Thevissen 等人，2005 ;Ramamoo;rthy 等人，2007)。
[0014] 植物病原體誘導(dǎo)顯著的植物產(chǎn)量損失，并且目前用于病原體控制的策略是昂貴的 且對(duì)環(huán)境潛在性損害的?？紤]到改善農(nóng)業(yè)生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)的需要，需要新策略用于保護(hù)農(nóng)業(yè)和觀 賞上重要的植物不受一系列疾病，特別是真菌病。
[00巧]概述
[0016] 本文公開的是用于減少經(jīng)由病原體例如真菌因子引起的對(duì)農(nóng)作物和觀賞植物的 損害的系統(tǒng)。傳統(tǒng)控制方法涉及化學(xué)殺真菌劑的應(yīng)用。該增加了農(nóng)作物和花生產(chǎn)的成本。 依照本發(fā)明，鑒定了在植物防御素和蛋白酶抑制劑之間令人梅訝的協(xié)同作用，導(dǎo)致預(yù)防和 改善植物中的疾病狀況的功效增加。
[0017] 因此，本發(fā)明提供了用于保護(hù)植物不受與經(jīng)由病原體感染相關(guān)的疾病的系統(tǒng)，該 系統(tǒng)包括給植物的細(xì)胞提供植物防御素和蛋白酶抑制劑或任一或兩者的前體或功能同系 物、類似物、衍生物或其變體。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，植物病原體是真菌。提及"植物"在 一個(gè)方面包括植物及其后代。
[0018] 因此，本發(fā)明尤其提供了用于保護(hù)植物不受經(jīng)由真菌病原體感染和/或用于減少 真菌病原體相關(guān)疾病的嚴(yán)重度發(fā)生率的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括使用至少一種防御素和一種蛋白 酶抑制劑的組合的多價(jià)方法。出乎意料地，給定防御素和給定蛋白酶抑制劑對(duì)給定真菌病 原體的組合作用是協(xié)同的，即當(dāng)它們?cè)谥参锃h(huán)境中組合時(shí)（至少）2種組分的抗病原體活性 大于蛋白酶抑制劑或防御素單獨(dú)作用的抑制效應(yīng)的總和。
[0019] 因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于保護(hù)植物不受與經(jīng)由病原體感染相關(guān)的疾病的系 統(tǒng)，該系統(tǒng)包括W協(xié)同有效量給植物的細(xì)胞提供植物防御素和蛋白酶抑制劑或任一或兩者 的前體或功能同系物、類似物、衍生物或其變體，W減少經(jīng)由病原體的感染。
[0020] 提及"系統(tǒng)"包括植物管理系統(tǒng)、方案和方法。如上所述，在一個(gè)特定實(shí)施方案中， 病原體是真菌病原體。
[0021] 提及"提供植物的細(xì)胞"包括從外源來源提供防御素和蛋白酶抑制劑，或從細(xì)胞內(nèi) 提供兩者或一種外源提供和一種細(xì)胞內(nèi)提供。
[0022] 本發(fā)明進(jìn)一步考慮了植物防御素和蛋白酶抑制劑或任一或兩者的前體形式在制 造遺傳修飾植物中的用途，所述遺傳修飾植物對(duì)真菌感染較不敏感或顯示出更少的真菌感 染相關(guān)損害。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方案中，存在用于保護(hù)農(nóng)作物或觀賞植物不受真菌病的系統(tǒng)，其包括 給植物提供植物防御素和蛋白酶抑制劑或其功能同系物、類似物或變體或等價(jià)物。在該個(gè) 實(shí)施方案中，與每種組分單獨(dú)的組合分開效應(yīng)相比較，由2種組分的真菌抑制程度被視為 協(xié)同的。在一個(gè)實(shí)施方案中，存在通過至少一種植物防御素例如NaDl或其抗真菌變體和 各種蛋白酶抑制劑中的至少一種的組合對(duì)鑲刀菌屬（化sarium)物種的協(xié)同抑制，所述蛋 白酶抑制劑包括但不限于來自植物的半脫氨酸蛋白酶抑制劑或絲氨酸蛋白酶抑制劑例如 StPinlA(如美國(guó)專利號(hào)7, 462, 695中所述W前稱為化tlA的馬鈴墓I型抑制劑）或牛膜蛋 白酶抑制劑I-P。對(duì)通過系統(tǒng)組分各自抑制分別敏感的任何真菌通過使用組合比單獨(dú)使用 任一組分可W更有效地得到控制。
[0024] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于保護(hù)植物不受與經(jīng)由真菌病原體感染相關(guān)的疾病的系 統(tǒng)。該系統(tǒng)包括給植物的細(xì)胞提供植物防御素和蛋白酶抑制劑或任一或兩者的前體或功能 同系物、類似物、衍生物或其變體。
[0025] 本發(fā)明的多價(jià)方法包括包括協(xié)同作用的植物防御素和蛋白酶抑制劑。該些組分可 W通過重組方法在植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生且任選從植物細(xì)胞輸出或輸入到植物細(xì)胞內(nèi)。備選地， 組分可w局部地提供給植物細(xì)胞，例如w噴霧劑、氣溶膠、粉劑的形式或作為服料或植物食 物的部分。如上所述，在另外一個(gè)備選方案中，防御素或蛋白酶抑制劑之一通過重組方法提 供，并且該些組分的另一種外源提供。
[0026] 本發(fā)明的另一個(gè)方面考慮了用于抑制真菌生長(zhǎng)、復(fù)制、感染和/或維持的方法，該 方法包括使真菌暴露于植物防御素和蛋白酶抑制劑的組合。
[0027] 再次，與由任一組分W用于組合暴露的相同劑量與真菌單獨(dú)接觸提供的抑制總和 相比較，在防御素和蛋白酶抑制劑的存在下的真菌抑制程度是協(xié)同的。
[0028] 如果可W顯示每種組分單獨(dú)地發(fā)揮針對(duì)真菌的抑制活性，或組合中的組分發(fā)揮協(xié) 同的組合抑制效應(yīng)，那么真菌對(duì)經(jīng)由系統(tǒng)的個(gè)體組分各自"的抑制是敏感的"。
[0029] 本發(fā)明延伸至系統(tǒng)組分對(duì)真菌細(xì)胞透性的作用的測(cè)量。采用可W鑒定其定位的物 質(zhì)，無論是在真菌細(xì)胞內(nèi)部還是外部。該物質(zhì)在本文中特別被稱為"透性指示劑化合物"。 透性指示劑化合物是其在細(xì)胞內(nèi)部或外部的存在可W依靠具有可檢測(cè)性質(zhì)進(jìn)行可檢測(cè)測(cè) 量的化合物，所述可檢測(cè)性質(zhì)例如英光、放射性標(biāo)記、免疫學(xué)特征等。此外，透性指示劑化合 物是該樣的化合物，其在正常條件下保持在細(xì)胞外，并且除非細(xì)胞透性已從細(xì)胞的正常生 理?xiàng)l件改變，否則將無法在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)出。原則上，透性的指示劑還可W是正常保留在細(xì)胞 內(nèi)，僅在異常條件下滲漏出去的化合物，但前面一種類型的指示劑更常見。可W用于監(jiān)控從 細(xì)胞外到細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的移動(dòng)的透性指示劑化合物的例子包括與核酸結(jié)合的英光染料例如 SYT0X⑩Green,或楓化丙巧。其他例子包括FITC標(biāo)記的右旋糖酢或免疫金標(biāo)記的抗體， 其定位可W通過顯微鏡檢查進(jìn)行檢測(cè)。英光標(biāo)記的防御素其自身也可W用作透性指示劑化 合物。從細(xì)胞內(nèi)環(huán)境釋放到細(xì)胞外環(huán)境的ATP的測(cè)量（如通過引用合并入本文的美國(guó)專利 申請(qǐng)?zhí)朥S12/362, 657中公開的）也可W用作透性的指示劑。術(shù)語"可檢測(cè)的量"意欲傳達(dá) 透性指示劑化合物的量方面的差異可W半定量地進(jìn)行評(píng)估，足W用于比較目的。為了比較 植物防御素對(duì)真菌細(xì)胞透性的可能作用的目的，使用植物防御素NaDl作為用于比較的基 礎(chǔ)。
[0030] 本發(fā)明的實(shí)施方案包括其中防御素是具有針對(duì)至少一種致病性真菌的殺真菌和/ 或抑制真菌活性的任何防御素的那些。此類抗真菌防御素的例子包括但不限于來自蘿h的 NaDl、化D1A、化02、Tomdef2、RsAFP2、RsAFPl、RsAFP3 和 RsAFP4,來自大麗花（d址lia)的 DmAMPl,來自走葉樹（Aesculus hippocatanum)的 MsDefl、MtDef2、CtAMPl、PsDl、HsAFPl、 VaDl、化D2、ZmESR6、AMMPl 和 AMMP4,來自首薦（alfalfa)的 AflAFP，來自魏豆的 NaD2、 八乂1、4《2、8501、66401、狀41?1、11-2、？曲1、502、5〇02、胖1'1、9139和91230。嵌合防御素分 子和/或保留抗真菌活性的防御素變體也可W用于本發(fā)明的系統(tǒng)中W用于植物保護(hù)。
[0031] 嵌合防御素分子和/或保留抗真菌活性的防御素變體也可W用于本發(fā)明的系統(tǒng) 中W用于