一種快速提高燈盞花中燈盞乙素含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)和植物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到快速提高燈盞花中燈盞乙素 含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 燈蓋花是菊科植物短葶飛蓬Erigeronbreviscapus(Vant. )Hand-Mazz的干燥全 草，又名燈盞細(xì)辛、東菊，主要分布于我國西南地區(qū)，尤以云南較多。短葶飛蓬中提取的黃酮 類混合物燈盞花素素由燈盞甲素，燈盞乙素和咖啡?？鼘幩嶂惤M成。普遍認(rèn)為燈盞乙素 (5, 6, 4-三羥基黃酮-7-葡萄糖醛酸苷）是其主要活性物質(zhì)。具有抗缺血損傷、抗血小板聚 集、改善器官血流動力學(xué)和微循環(huán)等多方面作用，對缺血性心腦血管疾病有顯著療效。
[0003] 在植物體內(nèi)類黃酮的生物合成途徑普遍存在，并產(chǎn)生極其豐富的次生代謝產(chǎn)物， 統(tǒng)稱類黃酮化合物，野黃芩苷（燈盞乙素）也是其中的一員。在燈盞花中，通過上游苯丙 素途徑，苯丙氨酸在L-苯丙氨酸解氨酶（PAL)，肉桂酸4-羥化酶（C4H)和4-香豆酰CoA 連接酶（4CL)催化苯丙氨酸生成對香豆酰輔酶A，再通過下游黃酮途徑，通過查爾酮合成酶 (CHS)，查爾酮異構(gòu)酶（CHI)，黃烷酮6-羥化酶（F6H)，黃酮合成酶II(FNSII)和UDP-葡萄 糖醛轉(zhuǎn)移酶（F7GAT)催化生成燈盞乙素（圖1)。
[0004] 但是自燈盞花被研發(fā)成為藥品后，這一野生資源就被大量采摘，可觀的經(jīng)濟(jì)利益 導(dǎo)致燈盞花資源過度開發(fā)，環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞，野生資源日益減少，逐漸造成如今燈盞花資 源緊缺的現(xiàn)狀。面對這一問題，云南在2002年就開始嘗試燈盞花人工種植，但是由于對燈 盞花相關(guān)遺傳研究滯后及其遺傳背景狹窄等問題，雜交育種的難度極大，因此到目前為止 均為野生株系的栽培，后代穩(wěn)定性差，給燈盞花規(guī)?；耘嘁约癎MP管理帶來了巨大的挑 戰(zhàn)。
[0005] 因此提高燈盞花中有效成分的含量，尤其是燈盞乙素的含量，對培育優(yōu)異的燈盞 花資源具有重要意義。
[0006]目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道燈盞花植株培養(yǎng)提高燈盞乙素含量的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種快速提高燈盞花中燈盞乙素含量的方法，使用燈盞花植 株培養(yǎng)方法，提高燈盞花中有效成分--燈盞乙素的含量。
[0008] 本發(fā)明的主要技術(shù)方案是：將種子播種于土壤，取生長90天的燈盞花植株作為處 理對象，通過茉莉酸甲酯（MeJA)進(jìn)行誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)快速提高燈盞乙素含量的目的。
[0009] 本發(fā)明提供了一種快速提高燈盞花中燈盞乙素含量的方法，也即一種獲得燈盞乙 素積累量最大的燈盞花植株的培養(yǎng)方法、或一種通過茉莉酸甲酯誘導(dǎo)提高燈盞花中有效成 分燈盞乙素的方法，該方法是生長80-100天（最優(yōu)為90天）的長勢良好的燈盞花植株作 為處理對象，將I. 5mM的MeJA溶液15mL/株均勻噴灑于燈盞花葉片上，培養(yǎng)3天以上；培養(yǎng) 過程中光照強(qiáng)度為2500-3500LUX，溫度為25°C。
[0010] 本發(fā)明方法的具體步驟如下：
[0011] A.種子的萌發(fā)：將燈盞花種子播種于土壤，覆蓋透明塑料薄膜保持水分，在光照 12小時(shí)/天，光照強(qiáng)度2500-3500LUX條件下培養(yǎng)，溫度為25°C，待發(fā)芽后去除塑料薄膜，30 天后得到顏色有光澤呈鮮綠色，生長旺盛的幼苗；
[0012] B.移栽幼苗：每株幼苗移栽至獨(dú)立的土壤環(huán)境，于同樣條件下（光照12小時(shí)/天， 光照強(qiáng)度2500-3500LUX，溫度25°C)培養(yǎng)60天（無塑料薄膜），選取長勢良好的燈盞花植 株作為誘導(dǎo)對象；
[0013] C.茉莉酸甲酯誘導(dǎo)燈盞花植株：取長勢相近的燈盞花植株（5-7片葉，ll-14cm 長），將I. 5mM的MeJA溶液15mL/株均勻噴灑于燈盞花葉片上，隨后立即將整個(gè)植株套入透 明塑料袋中；
[0014]D.如上述條件，即光照12小時(shí)/天，光照強(qiáng)度2500-3500LUX，溫度25°C下繼續(xù)培 養(yǎng)3天后，即得燈盞乙素積累量最大的燈盞花植株。
[0015] 優(yōu)選的，步驟A、B和D中的光照強(qiáng)度優(yōu)選3000LUX。
[0016] 其中步驟C中，MeJA溶液配制方法為：取純度大于95% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的MeJA溶 于丙酮和水得到MeJA終濃度為I. 5mM(丙酮體積為總體積的1% )的溶液作為工作濃度。 MeJA-定要噴灑均勻，保證每片葉的正面反面都充分與其解除。套袋要迅速，以免MeJA揮 發(fā)流失過多。
[0017] 其中播種前需進(jìn)行種子的處理，處理步驟具體為：將干燥燈盞花種子浸泡于純水 中30min，去除漂浮表面的雜質(zhì)。
[0018] 術(shù)語解釋，本文中"Lux"是指光照強(qiáng)度。
[0019] 本文中"獨(dú)立的土壤環(huán)境"是指將每株植株幼苗分開種植，但是其他條件包括土 壤，光照，溫度都保持相同。
[0020] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0021] 本發(fā)明克服了燈盞花中燈盞乙素含量較低，有效成分不穩(wěn)定的問題。本發(fā)明經(jīng)高 效液相-三重四極桿質(zhì)譜（HPLC-MS/MS)實(shí)驗(yàn)證明，有效成分燈盞乙素含量顯著提高。
[0022] 本發(fā)明的方法操作簡單，能夠培育出燈盞乙素含量高的燈盞花植株，滿足了市場 需求。
【附圖說明】
[0023] 圖1燈盞花取樣圖，圖中顯示即為長勢相近的燈盞花植株（5-7片葉，ll-14cm 長）。
[0024] 圖2茉莉酸甲酯（MeJA)對燈盞乙素代謝的影響。圖中方塊Scutellarin為燈盞 乙素，其他化合物是代謝流中的化合物。結(jié)果表示三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均結(jié)果。
[0025] 圖3茉莉酸甲酯（MeJA)對基因表達(dá)影響?？瞻讓φ沼冒咨硎?，誘導(dǎo)組用黑色表 示，其中A、B、C和D分別表示基因CHI、CHS、F3H和FNSII在誘導(dǎo)前后表達(dá)量的變化。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例和附圖，對本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。
[0027] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商 所建議的條件。
[0028] 實(shí)施例1 :
[0029] 1.種子的處理：將干燥燈盞花種子30mg浸泡于純水中30min，去除漂浮表面的雜 質(zhì)，將篩選后的種子均勻鋪于提前潤濕的土壤中，再于表面覆蓋一層土壤。
[0030] 2.發(fā)芽：在土壤上覆蓋一層透明的塑料薄膜，以保存水分。置于光照強(qiáng)度為 3000LUX條件下培養(yǎng)，光照12小時(shí)/天，溫度為25°C，待發(fā)芽后去除塑料薄膜，30天后得到 顏色有光澤呈鮮綠色，生長旺盛的幼苗。
[0031] 3.培養(yǎng)：將每株幼苗移栽至獨(dú)立的土壤環(huán)境，繼續(xù)同樣條件培養(yǎng)60天。
[0032] 4?誘導(dǎo)：取長勢符合要求（5-7片葉，ll-14cm長）的燈盞花植株（見圖1)，將 I. 5mM的MeJA溶液均勻噴灑于燈盞花每張葉片上，每株噴灑15mL，隨后立即套袋。在與步 驟2相同的條件下繼續(xù)培養(yǎng)至第3天即得到燈盞乙素含量高的植株。
[0033] 實(shí)施例2 :LC_MS/MS測定燈盞花中燈盞乙素及其前提化合物含量
[0034] 1.取滿足實(shí)例1中的燈盞花共27株，于誘導(dǎo)第0，1，2,3,4,5,6,7天起取樣。
[0035] 2.對照品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備以及色譜分離條件
[0036] 用乙醇將標(biāo)準(zhǔn)品野黃芩苷（燈盞乙素），芹菜素-7-葡萄糖醛酸（燈盞甲素），野 黃芩素，芹菜素和芹菜素-7-葡萄糖苷（大波斯菊苷），稀釋到5微克/毫升為工作液濃度。
[0037] 將得到的燈盞花植株置于37°C恒溫烘箱中干燥，干燥后研磨成粉，稱取2.Omg，過 100目篩，70%乙醇ImL,超聲提取兩次，每次30min，15000rpm離心30min，濾液定容至2mL, 濾液用〇. 2yM微孔有機(jī)濾膜過濾，進(jìn)樣。
[0038]色譜柱：美國Agilent公司，AgilentZorbaxSBC18 3. 5um150X2.ImmID，米 用等梯度洗脫方式，流速〇. 3mL/min，進(jìn)樣量10iiL，流動相：乙腈-水（30:70)，柱溫30°C， 分析時(shí)間2.Omin。
[0039] 3.質(zhì)譜檢測條件及LC-MS/MS測定丹參中酚酸類化合物的方法學(xué)考察
[0040] 采用ESI離子源、負(fù)離子檢測，選擇MRM工作方式進(jìn)行一 /二級質(zhì)譜分析。質(zhì)譜檢 測工作參數(shù)如下：氣體流速（GasFlow)10L/min、氣體溫度（GasTemp)35(TC、噴霧器壓力 (Nebulizer)40帕、毛細(xì)管電壓（Capillary)4000V。優(yōu)化的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM)參數(shù)見表1。
[0041] 表1優(yōu)化的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM)參數(shù)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速提高燈盞花中燈盞乙素含量的方法，其特征在于，該方法如下：生長 80-100天的長勢良好的燈盞花植株作為處理對象，將I. 5mM的茉莉酸甲酯溶液15mL/株均 勻噴灑于燈盞花葉片上，培養(yǎng)3天以上；培養(yǎng)過程中光照強(qiáng)度為2500-3500Lux，溫度為25°C 〇
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速提高燈盞花中燈盞乙素含量的方法，其特征在于， 該方法按照下述步驟進(jìn)行： A、 種子的萌發(fā)：將燈盞花種子播種于土壤，覆蓋透明塑料薄膜保持水分，在光照12小 時(shí)/天，光照強(qiáng)度2500-3500LUX條件下培養(yǎng)，溫度為25°C，待發(fā)芽后去除塑料薄膜，30天后 得到顏色有光澤呈鮮綠色，生長旺盛的幼苗； B、 移栽幼苗：每株幼苗移栽至獨(dú)立的土壤環(huán)境，于同樣光照12小時(shí)/天，光照強(qiáng)度 2500-3500Lux，溫度25°C條件下無塑料薄膜培養(yǎng)60天，選取長勢良好的燈盞花植株作為誘 導(dǎo)對象； C、 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)燈盞花植株：取長勢相近的5-7片葉，ll-14cm長的燈盞花植株，將 I. 5mM的茉莉酸甲酯溶液15mL/株均勻噴灑于燈盞花葉片上，隨后立即將整個(gè)植株套入透 明塑料袋中； D、 在光照12小時(shí)/天，光照強(qiáng)度2500-3500Lux，溫度25°C條件下繼續(xù)培養(yǎng)3天后，即 得燈盞乙素積累量最大的燈盞花植株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種快速提高燈盞花中燈盞乙素含量的方法，其特征在于， 步驟A、B和D中的光照強(qiáng)度均為3000LUX。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種快速提高燈盞花中燈盞乙素含量的方法，其特征在于， 其中步驟C中，茉莉酸甲酯溶液配制方法為：取純度大于95%的茉莉酸甲酯溶于丙酮和水 得到茉莉酸甲酯終濃度為I. 5mM的溶液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種快速提高燈盞花中燈盞乙素含量的方法，其特征在于， 其中步驟A在播種前需進(jìn)行種子的處理，處理步驟具體為：將干燥燈盞花種子浸泡于純水 中30分鐘，去除漂浮表面的雜質(zhì)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速提高燈盞花中燈盞乙素含量的方法，屬于生物技術(shù)和植物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。發(fā)明的主要技術(shù)方案是：將種子播種于土壤，取生長90天的燈盞花植株作為處理對象，通過茉莉酸甲酯(MeJA)進(jìn)行誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)快速提高燈盞乙素含量的目的。本發(fā)明克服了燈盞花中燈盞乙素含量較低，有效成分不穩(wěn)定的問題。本發(fā)明經(jīng)高效液相-三重四極桿質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)實(shí)驗(yàn)證明，有效成分燈盞乙素含量顯著提高。
【IPC分類】A01G1-00, A01G7-06, A01G7-04
【公開號】CN104541885
【申請?zhí)枴緾N201510006715
【發(fā)明人】張磊, 陳瑞兵, 黃鑫, 劉江華
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月7日