分子標(biāo)記輔助選擇多基因高抗稻瘟病材料的育種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分子標(biāo)記輔助選擇多基因高抗稻瘟病材料的育種方法，尤其是采用特異性的分子標(biāo)記輔助選擇聚合含多個抗稻瘟病基因的水稻材料，結(jié)合田間表型性狀和抗病性鑒定，選育目標(biāo)更加明確高效，屬于水稻育種領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]稻瘟病是由稻瘟病菌引起的水稻病害，其分布范圍十分廣泛。據(jù)統(tǒng)計，全世界有80余個國家均有發(fā)生，一般流行年份可造成10 % -20%的減產(chǎn)，嚴(yán)重發(fā)生時則達(dá)到40% -50%。20世紀(jì)90年代以來，我國稻瘟病的年發(fā)生面積均在380萬hm2以上，每年損失稻谷數(shù)億千克。隨著品種應(yīng)用的單一化、集中化以及氣候的影響，稻瘟病的危害也越來越嚴(yán)重。盡管人們在防害防治上耗費了巨大的精力和物質(zhì)投入，但限于諸多方面因素的影響，防治效果一直不盡人意，尤其在病害嚴(yán)重發(fā)生的年份，常常給生產(chǎn)育種造成了巨大的損失。以遼寧省為例，遼寧省主栽水稻品種遼星I號，近年來由于品種抗病性退化導(dǎo)致穗莖瘟大面積發(fā)生，嚴(yán)重影響了遼寧省粳稻的生產(chǎn)。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的根本原因就是主栽品種對稻瘟病病苗的抗譜狹窄，且單一化，集中化種植普遍，這樣一旦稻瘟病病菌流行小種發(fā)生變化，品種對稻瘟病的抗性便迅速下降。因此選育廣譜多基因聚合水稻品種很重要。
[0003]目前，在抗稻瘟病品種選育過程中，育種家主要采用系譜法。傳統(tǒng)的系譜法通過兩親本組配，從分離后代中擇優(yōu)選育品種，抗病表型依賴于田間自然鑒定或人工接種鑒定，鑒別難度大，準(zhǔn)確率很低。由于不了解親本的抗病基因型，育種者在親本選擇上非常盲目，通常是海量配組，海量選擇后代，工作量大，育種效率低。利用分子標(biāo)記結(jié)合田間抗病表現(xiàn)進行選擇，可以大大提高抗性品種選育的準(zhǔn)確性和效率。
[0004]P1-ta基因位于水稻第12染色體靠近著絲點附近的區(qū)域，定位于BAC克隆BAC142E8上(Bryan et al.，2000)，Pi_ta基因包含2個外顯子和I個1463bp的內(nèi)含子，編碼一個長度為928個氨基酸的細(xì)胞質(zhì)膜受體蛋白，該蛋白含NBS結(jié)構(gòu)域和富亮氨酸結(jié)構(gòu)域(LRD)，P1-ta位點上的抗感兩基因的編碼產(chǎn)物僅有一個氨基酸的差異，即第918氨基酸由抗病產(chǎn)物的丙氨酸變異為感病產(chǎn)物的絲氨酸，其抗病機制是P1-ta基因的編碼產(chǎn)物能與稻瘟病菌的無毒基因AVR-Pita表達(dá)產(chǎn)物相互作用引發(fā)抗病反應(yīng)(Bryan et al.,2000), Pita對遼寧地區(qū)的稻瘟病小種有一定的效果。
[0005]Ρ?5以前定位于第4染色體，與RG788連鎖(Wang et al.，1994);后被更正，重新定位于第9染色體上S04G03和C1454之間的170kb區(qū)間內(nèi)(Jeon et al.，2003)。研究表明Pi5與Pi3等位或緊密連鎖(Inukai et al.，1996)，而對Pi5/Pi3區(qū)間的測序表明它們實質(zhì)上就是同一個基因，而且它們的抗性供體不是Moroberekan和Pa1-Kan-Tao (Jeon etal.，2003)，最有可能的供體是Tetep (Yi et al.，2004)。此外，Pi5/Pi3與Pii位于同一位置，且抗譜一致，推測它們是同一個基因(Yi et al.，2004)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了高效選擇高抗稻瘟病新品種，有針對性、特異性的選擇針對遼寧地區(qū)，選育含有抗病基因Pita和pi5的育種材料，本發(fā)明提供了一種有效的育種方法。利用DNA標(biāo)記Al，A2和A3，A4對稻瘟病抗性基因Pita進行分子標(biāo)記輔助選擇，利用DNA標(biāo)記BI，B2對稻瘟病抗性基因Pi5進行分子標(biāo)記輔助選擇，結(jié)合田間不同分離世代的性狀選擇及抗性鑒定，在最佳世代進行抗病基因聚合，提聞了選育多基因聞抗水稻新材料的效率。
[0007]本發(fā)明提供以下解決方案:
[0008]利用含有稻瘟病抗性基因Pita的水稻材料Pl與遼寧感病材料遼星I號構(gòu)建抗感F2群體。利用特異分子標(biāo)記Al、A2、A3、A4篩選田間表型性狀優(yōu)良且含有Pita的單株，利用篩選出的抗病單株與感病親本遼星I號進行回交，得到回交群體BC1F1在海南進行加代；在天津正季播種BC1F2的種子，再次利用分子標(biāo)記A1、A2、A3、A4對稻瘟病抗性基因Pita進行篩選，同時結(jié)合田間表型及抗病性鑒定篩選抗病單株，利用抗病單株再與感病親本遼星I號進行回交，得到BC2F1群體在海南加代；在天津正季播種BC 2F2種子，利用分子標(biāo)記Al、A2、A3、A4對稻瘟病基因Pita進行篩選，篩選出的抗病單株進行自交加代，得到BC2F4代含有抗病基因Pita單株。
[0009]利用含有稻瘟病抗性基因Pi5的水稻材料P2與遼寧感病材料遼星I號構(gòu)建抗感F2群體。利用特異分子標(biāo)記B1、B2篩選田間表型性狀優(yōu)良且含有Pi5的單株，利用篩選出的抗病單株再與感病親本遼星I號進行同交，得到回交群體BCiF1在海南進行加代；在天津正季播種BC1F2的種子，再次利用分子標(biāo)記B1、B2對稻瘟病抗性基因Pi5進行篩選，同時結(jié)合田間表型及抗病性鑒定篩選抗病單株，利用抗病單株再與感病親本遼星I號進行回交，得到BC2F1群體在海南加代；在天津正季播種BC2F2種子，利用分子標(biāo)記B1、B2對稻瘟病基因Pi5進行篩選，篩選出的抗病單株進行自交加代，得到BC2F4代含有抗病基區(qū)pi5單株。
[0010]利用BC2F4代的含有抗病基因Pita單株與含有抗病基因pi5單株進行雜交，自交得到F2并利用分子標(biāo)記Al、A2、A3、A4，B1、B2對抗病基因Pita、pi5進行篩選，并結(jié)合田間的抗病性鑒定，選擇含有兩個抗病基因且田間表現(xiàn)優(yōu)良的單株進行自交加代。自交加代3代得到含有Pita，pi5抗病基且田間表現(xiàn)純和穩(wěn)定的抗病新品種。
[0011]一種檢測稻瘟病抗性基因Pita是否存在的引物對，如Al、A2、A3、A4。
[0012]Al 的引物序列為 5’ AGCAGGTTATAAGCTAGGCC-3’
[0013]A2 引物序列為 5 ’ -CTACCAACAAGTTCATCAA-3 ’
[0014]A3 的引物序列為 5 ’ AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT-3 ’
[0015]A4 的引物序列為 5 ’ CTACCAACAAGTTCATCAA-3 ’
[0016]一種檢測稻瘟病抗性基因Pi5是否存在的引物對，如B1、B2。
[0017]BI 的引物序列為 5’ ATAGATCATGCGCCCTCTTG-3’
[0018]B2 的引物序列為 5’ TCATACCCCATTCGGTCATT-3’
[0019]一種檢測水稻DNA中是否存在水稻稻瘟病抗性基因Pita的方法，以A1、A2、A3、A4所示序列為引物，擴增待檢測DNA。利用標(biāo)記Al和A2擴增產(chǎn)物有帶并A2和A3標(biāo)記擴增產(chǎn)物無帶這樣的情況為含有抗病基因Pita，如圖1，圖2所示。
[0020]一種檢測水稻DNA中是否存在水稻稻瘟病抗性基因Pi5的方法，以B1、B2所示序列為引物，擴增待檢測DNA。擴增產(chǎn)物含有P2帶型的為含有pi5抗病基因，如圖3所示。
[0021]一種多基因高抗稻瘟病材料的選育方法，以含有水稻稻瘟病抗性基因Pita、Ρ?5的水稻材料為親本，與感病水稻品種遼星I號進行雜交，對雜交后代分離群體單株提取基因組DNA，以Al、A2、A3、A4，B1、B2所示序列為引物進行PCR擴增，結(jié)合田間抗病性及表型鑒定，最終篩選含有稻瘟病抗性基因Pita、pi5并抗病性較好的單株
【附圖說明】
[0022]圖1是分子標(biāo)記A1、A2在稻瘟病抗性基因Pita的抗性親本Pl和感病品種遼星I號及后代分離群體的擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖:
[0023]圖2是分子標(biāo)記A3、A4在稻瘟病抗性基因Pita的抗性親本Pl和感病品種遼星I號及后代分離群體的擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖:
[0024]圖3是分子標(biāo)記B1、B2在稻瘟病抗性基因Pi5的抗性親本P2和感病品種遼星I號及后代分離群體的擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖:
[0025]M:2000bp 分子量標(biāo)記(片段長度分別為 2000bp, 100bp，750bp, 500bp, 250，10bp)
【具體實施方式】
[0026]實施例1:含稻瘟病抗性基因Pita的抗性親本Pl與感病親本遼星I號雜交構(gòu)建后代群體的鑒定篩選
[0027]含稻瘟病抗性基因Pita的抗性親本Pl與感病親本遼星I號雜交，再自交，然后自交F2代進行性狀篩選及抗稻瘟病病基因Pita篩選，選擇株高、生育期、豐產(chǎn)性等與遼星I號相似且含有抗病基因Pita的F2單株50株；然后與感病親本遼星I號第一次回交，自交得到BC1F2,再進行性狀篩選及抗病基因Pita的篩選，選中性狀優(yōu)良且含有抗病基因Pita的BC1F2單株50株；然后與感病親本遼星I號進行第二次回交，自交得到BC2F2，再進行性狀篩選及抗病基因Pita的篩選，選中性狀優(yōu)良且含有抗病基因的BC2F2單株部自交加代，選擇性狀優(yōu)良且含有抗病基因的BC2F3單株進行自交；得到BC2F4含有抗病基因且表型優(yōu)良的株系O
[0028]實施例2:含稻瘟病抗性基因Pi5的抗性親本P2與感病親本遼星I號雜交構(gòu)建抗感群體的鑒定篩選
[0029]含稻瘟病抗性基因Pi5的抗性親本P2與感病親本遼星I號雜交，再自交，然后自交F2代進行性狀篩選及抗稻瘟病病基因Pi5篩選，選擇株高、生育期、豐產(chǎn)性等與遼星I號相似且含有抗病基因Pi5的F2單株50株；然后與感病親本遼星I號第一次回交，自交得到BC1F2，再進行性狀篩選及抗病基因Pita的篩選，選中性狀優(yōu)良且含有抗病基因Pi5的BC1F2單株50株；然后與感病親本遼星I號進行第二次回交，自交得