一種紅掌脫毒培養(yǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種紅掌種苗脫毒培養(yǎng)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]紅掌(Anthurium andraenum)又稱花燭、安祖花,是天南星科花燭屬多年生草本植物，在許多熱帶國家和地區(qū)是僅次于熱帶蘭的主要切花品種，同時(shí)也是主要的盆栽花卉。在我國紅掌產(chǎn)業(yè)經(jīng)歷20多年的發(fā)展，也已成為主要的盆栽花卉和切花。但隨著生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大和種植年份的增加，大棚和田間感染病毒的植株比例也在逐年提高。紅掌規(guī)模生產(chǎn)的種苗絕大部分是組培苗，但國產(chǎn)組培苗大部分不是脫毒苗。
[0003]脫毒苗生產(chǎn)的關(guān)鍵是脫毒技術(shù)，獲得無病毒植株的方法有多種，例如熱處理脫毒、莖尖培養(yǎng)脫毒和莖尖微嫁接脫毒等方法。普遍采用的是莖尖培養(yǎng)脫毒法，具體的步驟是:切取植物莖尖的頂端分生組織，誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽或愈傷組織，從愈傷組織再分化產(chǎn)生芽，長成小植株得到脫毒苗。但是這種莖尖分生組織脫毒法存在的問題是:1、要切取很小的莖尖分生組織，需在顯微鏡下進(jìn)行，操作難度大，同時(shí)容易造成污染；2、切取莖尖越小，成活率越低。3、分生組織體積較常規(guī)組培小很多，因此產(chǎn)生較多不定芽或愈傷團(tuán)塊所需時(shí)間較常規(guī)組培要長得多；4、若切取莖尖偏大，往往不能完全脫除病毒。因此，紅掌脫毒組培苗生產(chǎn)存在脫毒材料獲得率低、操作費(fèi)工、生產(chǎn)周期長、脫毒不徹底等問題，脫毒效率低影響了脫毒技術(shù)在紅掌組培苗生產(chǎn)中的應(yīng)用。熱處理脫毒在紅掌脫毒苗生產(chǎn)中也未見應(yīng)用。
[0004]申請?zhí)枮镃N201310724001的中國專利，公開了一種山葵脫毒苗的培養(yǎng)方法，申請?zhí)枮镃N201410336067.2的中國專利，公開了一種大薯脫毒組培苗的培養(yǎng)方法，這兩個(gè)專利都是采用莖尖培養(yǎng)方法進(jìn)行脫毒的，兩種作物的組培都是通過莖尖分生組織誘導(dǎo)不定芽的途徑進(jìn)行。山葵脫毒專利還對莖尖進(jìn)行了熱處理脫毒，但由于植物和病毒的不同難以直接應(yīng)用于紅掌脫毒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決紅掌脫毒組培苗生產(chǎn)存在的操作難度大、脫毒效率低、生產(chǎn)周期長等問題，本發(fā)明提出一種紅掌脫毒培養(yǎng)的方法，本方法是一種操作簡便、脫毒材料獲得率高、速度快的紅掌種苗脫毒培養(yǎng)方法。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種紅掌脫毒培養(yǎng)的方法，所述脫毒培養(yǎng)的方法為以下步驟:
[0007](I)外植體準(zhǔn)備:取紅掌葉及葉柄，經(jīng)滅菌處理，作為組培用的外植體；
[0008]選取紅掌新展的嫩葉及葉柄進(jìn)行滅菌處理，滅菌處理過程為:用流水沖洗30分鐘后用70%酒精浸泡0.5?1.0分鐘，用無菌水沖洗后再用0.1 %的升汞溶液浸泡8?10分鐘，再經(jīng)無菌水沖洗5?7次。
[0009](2)誘導(dǎo)培養(yǎng):將步驟(I)的外植體切段或切片接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)50?90天誘導(dǎo)出肉眼可見黃色愈傷組織小顆粒；
[0010](3)增殖培養(yǎng):將步驟⑵愈傷組織接種在增殖培養(yǎng)基上，增殖繼代若干次；
[0011](4)變溫?zé)崽幚?將步驟(3)增殖培養(yǎng)后的愈傷組織先置于38?36°C環(huán)境中8?12小時(shí)，再置于32?26°C環(huán)境中12?16小時(shí)，再回到38?36°C環(huán)境，如此循環(huán)25?35天;
[0012](5)分化培養(yǎng):將經(jīng)步驟(4)處理成活的愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上分化出苗；
[0013](6)準(zhǔn)脫毒母株誘導(dǎo)培養(yǎng):將步驟(5)分化出的苗作為準(zhǔn)脫毒母株切去根部，每株單獨(dú)接種到增殖培養(yǎng)基上；
[0014](7)準(zhǔn)脫毒母株增殖和分化:將步驟(6)準(zhǔn)脫毒母株基部產(chǎn)生的愈傷組織增殖繼代，增殖到一定量后將愈傷組織任意分割成兩部分，其中一部分增殖繼代，另一部分接種到分化培養(yǎng)基上，每株準(zhǔn)脫毒母株產(chǎn)生的愈傷組織單獨(dú)接種并標(biāo)記，由同一母株愈傷組織分化產(chǎn)生的小植株組成一個(gè)株系；
[0015](8)準(zhǔn)脫毒株系生長:將步驟(7)愈傷組織在分化培養(yǎng)基上分化出的小植株按株系分別轉(zhuǎn)接到壯苗生根培養(yǎng)基培養(yǎng)；
[0016](9)病毒檢測:當(dāng)步驟(8)的株系植株生長達(dá)到病毒檢測所需的生長量時(shí)，對株系進(jìn)行病毒檢測。病毒檢測方法選用RT-PCR法，RT-PCR廣泛應(yīng)用于病毒檢測和遺傳病的診斷。
[0017](10)脫毒材料增殖分化:將經(jīng)步驟(9)檢測為脫毒苗的株系對應(yīng)的愈傷組織進(jìn)行增殖培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化出苗；
[0018](11)脫毒苗壯苗生根:將步驟(10)脫毒愈傷組織上長出的組培苗轉(zhuǎn)入壯苗生根培養(yǎng)基，待苗高3?4厘米時(shí)可出瓶種植，即為用于紅掌生產(chǎn)的脫毒組培苗成品。
[0019]所述的培養(yǎng)基，包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的組分與每升含量為:其中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5?2.0mg/L+2.4-D0.3?m0.8g/L，所述的增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5?3.0mg/L,所述的分化培養(yǎng)基為MS+6-BA0.1?1.0mg/L,所述壯苗生根培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA0 ?0.8mg/L+ 活性碳 0.5 ?lg/L。
[0020]所述的MS為基本培養(yǎng)基中添加蔗糖或白糖為30g/L，瓊脂為5?6g/L，pH調(diào)節(jié)為5.6?6.0 ;1/2MS基本培養(yǎng)基中添加蔗糖或白糖為20g/L，瓊脂為5?6g/L，pH調(diào)節(jié)為
5.6 ?6.0。
[0021 ] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0022](I)本發(fā)明以愈傷組織為脫毒處理材料，適用于紅掌這類可通過愈傷增殖途徑進(jìn)行組培的植物，相比于通常采用的莖尖脫毒，具有體積大、操作容易、污染率低、變溫?zé)崽幚沓苫盥事劦膬?yōu)點(diǎn)，因此，脫毒效率較莖尖脫毒聞。
[0023](2)以愈傷組織為脫毒處理材料，獲得準(zhǔn)脫毒母株數(shù)量較以莖尖為脫毒材料要多得多，即使整體脫毒率不高，也能在短期內(nèi)獲得較大數(shù)量的脫毒愈傷，縮短了生產(chǎn)周期。
[0024](3)采用組培苗作為病毒檢測材料并分別標(biāo)記，以對應(yīng)脫毒愈傷為擴(kuò)繁材料，保證了生產(chǎn)組培苗對所檢測病毒的脫毒效果。
[0025](4)提出了對紅掌愈傷組織熱處理脫毒方法和適宜的溫度、時(shí)間。
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0027]實(shí)施例中MS培養(yǎng)基中添加蔗糖為30g/L，瓊脂均為6g/L，pH為5.8 ；1/2MS培養(yǎng)基中添加鹿糖20g/L，瓊脂為6g/L，pH為5.8。
[0028]實(shí)施例1:
[0029]取紅掌阿拉巴馬新展的嫩葉及葉柄為外植體，經(jīng)滅菌處理:先用流水沖洗30分鐘后用70%酒精浸泡1.0分鐘,用無菌水沖洗后再用0.1 %的升汞溶液浸泡8分鐘，再經(jīng)無菌水沖洗5次。然后外植體切片、切段接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA1.0mg/L+2.4_D 0.5mg/L上。60天后外植體上可見黃色顆粒狀愈傷組織。將米粒大的愈傷組織連外植體一起接種到增殖培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0mg/L上，增殖培養(yǎng)80天后，已有若干直徑0.5?2厘米的愈傷團(tuán)塊，表面有分化的小芽。去除小芽，將愈傷組織置于38°C的人工氣候箱8小時(shí)，再置于28°C的人工氣候箱16小時(shí)，如此循環(huán)30天。經(jīng)此變溫?zé)崽幚砑s有2/3的愈傷組織存活，將其接種到分化培養(yǎng)基MS+6-BA0.2mg/L上，40天肉眼可見表面小芽產(chǎn)生。將每個(gè)小芽單獨(dú)接種到增殖培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0mg/L上，已長根的切去根部。30?60天后芽基部膨大產(chǎn)生愈傷組織。將此愈傷組織一部分增殖繼代，一部分接種到分化培養(yǎng)基上，每株的愈傷單獨(dú)接種并標(biāo)記。愈傷組織分化出的小植株按株系分別轉(zhuǎn)接到壯苗生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0.4mg/L+活性炭0.8g/L，待生長量足夠時(shí)對株系進(jìn)行RT-PCR法的病毒檢測。RT-PCR法檢測結(jié)果組培苗已脫去大棚取樣植株所感染的芋花葉病毒，組培苗樣品經(jīng)檢測80%脫毒。將檢測為脫毒苗的株系對應(yīng)的愈傷組織進(jìn)行增殖培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化出苗，再經(jīng)壯苗生根培養(yǎng)，獲得無芋花葉病毒的阿拉巴馬脫毒組培苗。
[0030]實(shí)施例2