一種青蒿轉(zhuǎn)基因育種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因育種，具體屬于一種青蒿轉(zhuǎn)基因育種方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 瘧疾是一種嚴(yán)重危害生命疾病，每年全世界大約有一百萬人死于瘧疾，并每年大 約有 350-500 萬新增病例（Grahametal. 2010;Grahametal. 2010;MilhousandWeina 2010)〇
[0003] 長期以來，青蒿就是一種用來治療瘧疾的特效藥用植物。青蒿素是一種倍半萜 烯內(nèi)酯內(nèi)過氧化物，是目前公認(rèn)最有效的抗耐多藥惡性瘧原蟲的化合物（Weina2008;Li etal.2006)。青蒿素還具有治療某些癌癥和其他病毒性疾病和寄生蟲病的能力（Efferth 2007;Efferthetal.2008;Weathersetal.2011) ?然而，由于青蒿植物中低青蒿素含量 (占干重0.01%-0.8%)。以青蒿素為基礎(chǔ)藥物的應(yīng)用受到了限制，特別是在發(fā)展中國 家（Nairetal. 1986;Klayman1985)。同時(shí)，青蒿素由于結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，一直未能實(shí)現(xiàn)全 化學(xué)合成。雖然部分化學(xué)合成青蒿素已經(jīng)實(shí)現(xiàn)，但是它成本較高，無法推廣應(yīng)用（Haynes， 2006年）。目前，青蒿素的大量生產(chǎn)仍是基于提高栽培青蒿中青蒿素的含量。所以，利用 青蒿轉(zhuǎn)基因技術(shù)選育高青蒿素含量的新品系將對(duì)于青蒿素的大量生產(chǎn)將會(huì)起到積極作用。
[0004] 青蒿轉(zhuǎn)基因工作開始于1996年和1997年，所用方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法（Banerjee etal. 1997;Vergauweetal. 1996年）。從那時(shí)起，研宄者在青蒿的轉(zhuǎn)基因方法上做了大 量的工作，然而收效甚微。許多研宄證明，青蒿轉(zhuǎn)基因是非常困難的，因?yàn)樗M(fèi)力、耗時(shí)，更 重要的是轉(zhuǎn)化效率很低（低于10%)(Liuetal.2011年）。一些研宄報(bào)道證明，青蒿的轉(zhuǎn) 化效率明顯受到外植體類型、土壤農(nóng)桿菌菌株，外植體的年齡等因素的影響（Teixeirada Silva2003;Vergauweetal. 1998;Ghoshetal. 1997)。因此，高效的青蒿轉(zhuǎn)基因技術(shù)是 青蒿育種迫切需要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)化效率較高的青蒿轉(zhuǎn)基因育種方法。
[0006] 本發(fā)明提供的一種青蒿轉(zhuǎn)基因育種方法，是以未成熟青蒿花序?yàn)橥庵搀w，用攜帶 有外源基因的農(nóng)桿菌菌液侵染外植體，經(jīng)過2-3天的共培養(yǎng)，將外植體放置在加有選擇壓 的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，進(jìn)一步誘導(dǎo)成再生植株，再通過對(duì)報(bào)告基因的分子生物學(xué) 檢測(cè)，從再生植株中鑒定出轉(zhuǎn)化植株。
[0007] 具體包括如下步驟：
[0008] 1)取田間生長的青蒿未成熟花序作為外植體，用50%次氯酸鈉溶液消毒，用無菌 蒸餾水沖洗5次，并切成l-2cm的切段，然后置于攜帶有質(zhì)粒pCaMBIA2301的農(nóng)桿菌菌液中 浸泡5-30分鐘，取出后用無菌濾紙去除多余的菌液，將其轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2-3天； 然后將外植體轉(zhuǎn)入添加了選擇壓的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到誘導(dǎo)出愈傷組織和抗性芽苗， 在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，每隔4周繼代培養(yǎng)一次；
[0009] 2)將生長至2-3個(gè)葉片的綠色抗性芽苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)抗性芽苗 生根，即成抗性再生植株。
[0010] 所述的農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌，菌株為EHA105或LBA4404,優(yōu)選EHA105。
[0011] 所述的農(nóng)桿菌菌液濃度為0D_0. 2-0. 6。
[0012] 所述的培養(yǎng)的溫度維持在25±2°C，培養(yǎng)的光照周期為光照16h、黑暗8h。
[0013] 所述的共培養(yǎng)基為：以MS為基本培養(yǎng)基，添加0. 5mg/L6-芐基腺嘌呤、0. 3mg/L 萘乙酸，30g/L蔗糖和6g/L瓊脂，pH為5. 4-5. 8 ;
[0014] 所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：以MS為基本培養(yǎng)基，添加0. 5mg/L6-芐基腺嘌呤、0. 3mg/ L萘乙酸，30g/L蔗糖，300mg/L頭孢霉素，20mg/L卡那霉素和6. 5g/L瓊脂，pH為5. 4-5. 8 ;
[0015] 所述的生根培養(yǎng)基為：以MS為基本培養(yǎng)基，添加0. 2mg/LNAA，30g/L蔗糖，300mg/ L頭孢霉素，10mg/L卡那霉素和6. 5g/L瓊脂，pH為5. 4-5. 8。
[0016] 本發(fā)明采用青蒿花序作為外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因育種的方法，同樣適用于其它植物花 序作為外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因育種。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0018] 1)與目前常規(guī)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的青蒿轉(zhuǎn)基因方法相比，本發(fā)明利用未成熟花序誘導(dǎo) 轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織，并利用抗生素對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行初步篩選，保證了轉(zhuǎn)化愈傷組織的 均一性。
[0019] 2)本發(fā)明用青蒿的未成熟花序作為外植體，與農(nóng)桿菌EHA105菌株共培養(yǎng)具有更 高的轉(zhuǎn)化率，最高轉(zhuǎn)化率為17. 2%。
[0020] 3)本發(fā)明不僅為青蒿遺傳轉(zhuǎn)化提供了一個(gè)新的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，而且也為其他難以進(jìn)行 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的植物種提供了借鑒。
【附圖說明】
[0021] 圖lpCaMBIA2301質(zhì)粒物理圖譜
[0022] 圖2未成熟花序外植體轉(zhuǎn)化后抗性芽苗分化、生長情況，其中，A:抗性芽苗分化， B:抗性芽苗生長。
[0023] 圖3轉(zhuǎn)基因植株和未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照植株Southern印跡雜交分析，其中，M:為分子 量標(biāo)記；1-7分別為不同的轉(zhuǎn)基因植株六1'-3、六1'-10、六1'-16、六1'-23、六1'-27、六1'-32和六1'-37; 8為未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照植株；9為質(zhì)粒pCaMBIA2301作為陽性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】[0024] 實(shí)施例1
[0025] 以青蒿品種'酉陽1號(hào)'為受體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)。
[0026] 1 ?試驗(yàn)方法：
[0027] (1) 土壤農(nóng)桿菌菌株培養(yǎng)
[0028] 農(nóng)桿菌菌株EHA105,購于上海邁其生物科技有限公司。農(nóng)桿菌菌株LBA4404和 pCaMBIA2301 (圖1)質(zhì)粒均購于北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。質(zhì)粒pCaMBIA2301包含 ⑶S基因，該基因受花葉病毒35S啟動(dòng)子和NOS終止子調(diào)控。pCaMBIA2301 (圖1)質(zhì)粒用凍 融法分別轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105菌株和LBA4404菌株中。
[0029] 攜帶有pCaMBIA2301質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105菌株和LBA4404菌株，分別接種在含 有50mg/L卡那霉素，50mg/L利福平的20mLYEB培養(yǎng)基中。培養(yǎng)瓶放置在28°C恒溫培養(yǎng)箱 中過夜培養(yǎng)。之后取200yL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到含有50mg/L卡那霉素，50mg/L利福平的50mL YEB的無菌液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度保持在28 °C，震蕩培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為250rpm，培養(yǎng)到OD6tltl達(dá)到 了 0. 2時(shí)，將農(nóng)桿菌培養(yǎng)物在4000g條件下離心5分鐘。去除原先的培養(yǎng)基，用相同體積， 未加瓊脂的共培養(yǎng)基將農(nóng)桿菌沉淀物重新懸浮，制備成農(nóng)桿菌菌液。
[0030] (2)植物轉(zhuǎn)化和再生
[0031] 在青蒿生長季取未成熟的花序作為外植體，用