一種非酒精性脂肪肝斑馬魚的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種疾病模式動(dòng)物的構(gòu)建方法，具體涉及一種非酒精性脂肪肝斑馬魚 的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 非酒精性脂肪肝是一種無過量飲酒史，以脂肪變性和脂質(zhì)堆積為特征的臨床病 癥。除直接引起肝硬化及肝癌外，該疾病的發(fā)展還間接導(dǎo)致了 2型糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬 化的發(fā)生。隨著肥胖及相關(guān)代謝綜合癥的流行，非酒精性脂肪肝已成為全球慢性肝病的 重要病因及生物醫(yī)學(xué)的重要研宄對象。在西方發(fā)達(dá)國家，非酒精性脂肪肝發(fā)病率往往在 24% -42%之間，而在我國，成人發(fā)病率已達(dá)到15%以上，甚至兒童也有2. 1%的幾率患病。 在此情況下，關(guān)于其病理過程研宄及新型治療手段的研制工作就顯得至關(guān)重要。
[0003] 無論病理研宄，還是藥物療效評(píng)價(jià)均需要合適的動(dòng)物模型來進(jìn)行，目前科研上主 要的模式動(dòng)物為通過高脂飼料喂養(yǎng)、毒性損傷及基因突變等方式構(gòu)建基于大/小鼠的非酒 精性脂肪肝模型，這些模型與人類極為相似，適于疾病機(jī)制和藥物干預(yù)研宄。但是大/小 鼠模型的構(gòu)建一般需要2-3月，維護(hù)成本較高，對飼料和藥物的消耗量較大，非常不適用于 高通量實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而其應(yīng)用受到了限制。特別是采用四氯化碳腹腔注射等毒性損傷下的大/ 小鼠模型，除上述缺點(diǎn)外，還會(huì)因?yàn)槎拘缘挠绊懸l(fā)動(dòng)物的死亡率上升，從而造模成功率下 降。
[0004] 目前，斑馬魚已成為國際上疾病研宄的主要模式生物之一，并被成功應(yīng)用于新藥 篩選中。這首先是因?yàn)榘唏R魚遺傳背景清晰，與人類基因相似度高達(dá)87 %，器官病變過程又 與人類極為接近。另一方面，斑馬魚胚胎發(fā)育是全透明的，加上適當(dāng)?shù)纳匾种铺幚恚梢?清晰地觀察病變過程。更重要的是，和老鼠等其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相比，斑馬魚體型小、實(shí)驗(yàn)周期 短，且維護(hù)費(fèi)用低廉，非常適合于高通量實(shí)驗(yàn)。我國關(guān)于斑馬魚的研宄開始較晚，到21世紀(jì) 初才正式開始，但發(fā)展迅速，已成立了國家斑馬魚模式動(dòng)物中心等多個(gè)資源庫，業(yè)務(wù)涉及疾 病研宄和新藥篩選等多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域。
[0005] 然而目前，用斑馬魚進(jìn)行非酒精性脂肪肝的研宄工作仍較少，國內(nèi)戴文聰?shù)热?(2013)采用2%乙醇處理受精后5天的斑馬魚32h后建立了急性酒精性脂肪肝模型，非酒 精性脂肪肝模型則未見報(bào)道。在國外，通過基因變異或沉默的方法，研宄者采用斑馬魚模型 驗(yàn)證了多種基因變異（foiegras，ducttrip，hi559，redmoon及sktll，見AmnonSchlegel， 2012)與非酒精性脂肪肝的關(guān)系，但這些方法操作復(fù)雜，成本較高，且目前尚未成為穩(wěn)定的 商品出售。就化學(xué)物誘導(dǎo)而言，僅有Amali等人（2006)采用硫代乙酰胺處理受精后5天的 斑馬魚，發(fā)現(xiàn)其在10天后即可明顯表現(xiàn)出脂質(zhì)損傷癥狀。然而化學(xué)物處理因其具有的明顯 的生物毒性，會(huì)導(dǎo)致斑馬魚死亡，從而降低建模成功率，且對于操作者本身也具有危害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，本發(fā)明的目的是提供一種成本低、成熟周期短的非 酒精性脂肪肝斑馬魚的制備方法。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] -種非酒精性脂肪肝斑馬魚的制備方法，包括以下步驟：
[0009] 步驟1)在無光照條件下，將性成熟的斑馬魚按雌雄比=1 : 2的比例放入交配魚 缸內(nèi)；10小時(shí)后將所述交配魚缸置于光照條件下0. 5小時(shí)，進(jìn)行受精產(chǎn)卵；
[0010] 步驟2)將步驟1)得到的受精卵以30個(gè)/孔的密度分布于孔板中，在所述孔板 的每個(gè)孔中加入3?4mL培養(yǎng)液，28°C恒溫，以每天14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗的條件培養(yǎng) 4dpf后，移去所述孔板中的培養(yǎng)液；
[0011] 步驟3)將所述孔板中的受精卵隨機(jī)分為正常組與高脂處理組，向所述高脂處理 組的每個(gè)孔中加入3?4mL高脂培養(yǎng)液，密封，28°C恒溫，以每天14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗 的條件培養(yǎng)2?3天；所述高脂培養(yǎng)液含50?200yM的棕櫚酸或100?400yM的油酸；
[0012] 步驟4)將步驟3)得到的正常組與高脂處理組斑馬魚置于染色皿中，加入4wt%多 聚甲醛在4°C下反應(yīng)10?14小時(shí)，PBS緩沖液洗滌2?3次，隨后依次采用Owt%、30wt%、 60wt%、90wt%和100wt%的丙二醇水溶液在室溫下各脫水lOmin，加入lwt%的油紅染色 液，在28°C下染色10?12小時(shí)，隨后依次采用 丙二醇的乙醇溶液在室溫下各脫色I(xiàn)Omin;
[0013] 步驟5)采用顯微鏡觀察高脂處理組斑馬魚的肝臟脂肪變性情況，并與正常組對 比，若高脂處理組斑馬魚的肝臟脂滴度多3,則判定為非酒精性脂肪肝。
[0014] 優(yōu)選的是，所述的非酒精性脂肪肝斑馬魚的制備方法，當(dāng)所述高脂培養(yǎng)液含50? 200yM的棕櫚酸時(shí)，向所述高脂培養(yǎng)液中加入牛血清白蛋白直至其含量達(dá)到4wt%。
[0015] 優(yōu)選的是，所述的非酒精性脂肪肝斑馬魚的制備方法，當(dāng)所述高脂培養(yǎng)液含 100?400yM的油酸時(shí)，向所述高脂培養(yǎng)液中加入DMSO直至其含量達(dá)到0.Iwt%。
[0016] 優(yōu)選的是，所述的非酒精性脂肪肝斑馬魚的制備方法，所述高脂培養(yǎng)液含200UM 的棕櫚酸或400yM的油酸。
[0017] 優(yōu)選的是，所述的非酒精性脂肪肝斑馬魚的制備方法，當(dāng)所述高脂培養(yǎng)液含50? 200yM的棕櫚酸時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間為3天。
[0018] 優(yōu)選的是，所述的非酒精性脂肪肝斑馬魚的制備方法，當(dāng)所述高脂培養(yǎng)液含 100?400yM的油酸時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間為2天。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是：
[0020] 1)本案在國內(nèi)首次采用斑馬魚來構(gòu)建非酒精性脂肪肝模型，成本低且成熟周期 短，可以有效降低病理學(xué)和藥物篩選成本；此外，斑馬魚模型還可用于構(gòu)建高通量藥物篩選 平臺(tái)，進(jìn)一步提高生物醫(yī)藥研發(fā)效率。
[0021] 2)本案的成果將為臨床非酒精性脂肪肝的發(fā)生病理學(xué)提供參考，而形成的斑馬魚 模型也將提供給各科研機(jī)構(gòu)及制藥公司，成為非酒精性脂肪肝病理研宄、新型治療手段開 發(fā)以及藥物高通量篩選的有力工具，降低藥物開發(fā)成本，拓展分子生物醫(yī)學(xué)的研宄手段，推 動(dòng)我國模式動(dòng)物產(chǎn)業(yè)及非酒精性脂肪肝醫(yī)療事業(yè)的發(fā)展。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù) 以實(shí)施。
[0023] 一種非酒精性脂肪肝斑馬魚的制備方法，包括以下步驟：
[0024] 步驟1)在無光照條件下，將性成熟的斑馬魚按雌雄比=1:2的比例放入交配魚 缸內(nèi)；10小時(shí)后將交配魚缸置于光照條件下0. 5小時(shí)，進(jìn)行受精產(chǎn)卵；
[0025] 步驟2)將步驟1)得到的受精卵以30個(gè)/孔的密度分布于孔板中，在孔板的每個(gè) 孔中加入3?4mL培