番茄紅素在制備人精液冷凍保護劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于人精液冷凍保護劑領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 精子是帶有遺傳物質(zhì)的特殊細(xì)胞。精液經(jīng)過技術(shù)處理，在冷凍保護劑的保護下，經(jīng) 過一定的降溫程序，保存在超低溫狀態(tài)下（液氮中），精子呈現(xiàn)玻璃樣的凍結(jié)，不會出現(xiàn)原 生質(zhì)脫水，其本來結(jié)構(gòu)受到保護，所以解凍后的精子仍能復(fù)蘇，恢復(fù)活力。冷凍狀態(tài)的精子 代謝活動受到明顯抑制，其生命處于靜止?fàn)顟B(tài)，從而達到能長期保存的目的。
[0003] 精子冷凍保護劑是精子冷凍技術(shù)的最重要物質(zhì)。目前最常用的精子冷凍保存 劑是含甘油和卵黃的復(fù)合型冷凍液，由甘油、卵黃、葡萄糖、枸櫞酸鈉等組成。冷凍保護 劑根據(jù)作用機理分為滲透性冷凍保護和非滲透性冷凍保護，甘油屬于滲透性冷凍保護 劑，非滲透性冷凍保護劑有果糖、蔗糖、卵黃、白蛋白等。滲透性冷凍保護劑滲入細(xì)胞內(nèi)， 降低細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的差，當(dāng)細(xì)胞外凍結(jié)時，減輕細(xì)胞皺縮的程度和速度；還能與細(xì)胞 內(nèi)水分及電解質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致水合結(jié)構(gòu)蛋白的穩(wěn)定，發(fā)揮抗凍作用。非滲透性冷凍保護劑 不能進入細(xì)胞，通過維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定起保護作用，冷凍時促進細(xì)胞內(nèi)水分外溢，細(xì)胞 發(fā)生皺縮，從而減少細(xì)胞內(nèi)的冰晶形成。研宄表明，在精液凍融過程中產(chǎn)生大量活性氧 〇^8(：1：；[￥6(?786118口6(^68，1?05)，精子質(zhì)膜的脂類含量約占50%以上。而精子質(zhì)膜因為富 含多聚不飽和脂肪酸（poly-unsaturatedfattyacid，PUFA)，其中，脂質(zhì)的主要成分為磷脂 和膽固醇。細(xì)胞膜是由脂類構(gòu)成的雙分子層結(jié)構(gòu)，膜脂類具有親水和疏水的兩部分，為脂肪 酸。脂肪酸易受ROS損傷，從而導(dǎo)致凍融后精子運動參數(shù)明顯下降?；钚匝鯇拥膿p傷 隨著氧化應(yīng)激對精子所產(chǎn)生影響的深入研宄，發(fā)現(xiàn)活性氧對精子產(chǎn)生各個層面的影響，主 要有以下幾個方面。
[0004] ①精子膜損傷：目前大量研宄表明精子膜中含有大量的多不飽和脂肪酸極易受到 ROS的攻擊。因此活性氧引起膜多不飽和脂肪酸減少造成精子的流動性和通透性發(fā)生改變， 導(dǎo)致精子的運動性和完整性發(fā)生不可逆的損傷。與此同時，活性氧也會造成線粒體膜的損 傷，使線粒體的呼吸功能發(fā)生改變，精子線粒體產(chǎn)生的能量減少，精子的運動能力降低。
[0005] ②DNA損傷：DNA作為遺傳物質(zhì)的傳遞者，其損傷直接影響精子質(zhì)量以及受精卵的 產(chǎn)生。氧化應(yīng)激會通過自由基的產(chǎn)生引起精子DNA發(fā)生單鏈或雙鏈的斷裂，同時也由于線 粒體DNA是裸露的DNA，缺少蛋白質(zhì)的保護和本身修復(fù)損傷能力較弱。常常導(dǎo)致精子直接損 傷，此外?；钚匝跫捌浯x產(chǎn)物也會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，引起細(xì)胞凋亡，直接造成精子損傷。
[0006] ③蛋白質(zhì)損傷：由于活性氧可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)硫醇基過氧化會使精子的功能和結(jié)構(gòu) 發(fā)生改變，使精子更容易受到損傷，此外大量活性氧的產(chǎn)生還可引起頂體結(jié)構(gòu)的損傷，從而 降低精子的受精能力。此外，精子體外培養(yǎng)以及ART中精子的冷凍保護都會影響精子的功 能和結(jié)構(gòu)的變化，造成精子膜脂質(zhì)過氧化、DNA和線粒體損傷等一系列變化。
[0007] 番茄紅素lycopene是開鏈?zhǔn)降牟伙柡皖惡}卜素，屬類胡蘿卜素中的胡蘿卜素 類（只有碳?xì)湓亟M成），在類胡蘿卜素中表現(xiàn)出較強的抗氧化性具有清除自由基、促進細(xì) 胞間隙連接通訊、防癌抑癌等多種生理功能，其特有的功能與性質(zhì)為世人所關(guān)注，引發(fā)了世 界性的對番茄紅素生產(chǎn)技術(shù)及其功效的研宄熱潮。番茄紅素已被證明是非常有效的單線態(tài) 氧猝滅劑，同時也對氮氧自由基（NO)，磺酰基（RSO2)等自由基有消除作用。
[0008] 番茄紅素是在西紅柿中天然存在的類胡蘿卜素的一種，而類胡蘿卜素是人體抗氧 化防御系統(tǒng)中重要的組成成分，其在內(nèi)分泌等系統(tǒng)中扮演越來越重要的角色。在類胡蘿卜 素中，番茄紅素不僅是常見也是能夠在水果和食物中經(jīng)常食用到的，它在能夠最有效的清 除單線態(tài)，同時也能夠清除過氧自由基。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供一種番茄紅素在制備人精液冷凍保護劑中的應(yīng)用，以解決目前常用的 含甘油和卵黃的精子復(fù)合型冷凍液存在的如下問題：冷凍復(fù)蘇精子前向運動率低、復(fù)蘇率 低、正常形態(tài)率低、DNA完整率低、凋亡率高。
[0010] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：番茄紅素在制備人精液冷凍保護劑中的應(yīng)用。
[0011] 番茄紅素在制備能提高冷凍復(fù)蘇精子前向運動率的人精液冷凍保護劑中的應(yīng)用。
[0012] 番茄紅素在制備能提高冷凍復(fù)蘇精子復(fù)蘇率的人精液冷凍保護劑中的應(yīng)用。
[0013] 番茄紅素在制備能提高冷凍復(fù)蘇精子正常形態(tài)率的人精液冷凍保護劑中的應(yīng)用。
[0014] 番茄紅素在制備能提高冷凍復(fù)蘇精子DNA完整率的人精液冷凍保護劑中的應(yīng)用。
[0015] 番茄紅素在制備能降低冷凍復(fù)蘇精子凋亡率的人精液冷凍保護劑中的應(yīng)用。
[0016] 含番茄紅素的每IOOmL人精液冷凍保護劑中含有下列物質(zhì)：
[0017] 葡萄糖1.5g，檸檬酸三鈉二水1.3g，甘油20ml，番茄紅素 4.296\1〇-\-4.296\1〇-4，卵黃2〇1111，二甲基亞砜0.011^-〇.11^，余量為雙蒸水。
[0018] 所述番茄紅素的人精液冷凍保護劑的制備方法包括下列步驟：
[0019] (一）99. 9mL-99. 99mL卵黃、甘油復(fù)合型冷凍保護劑的制備
[0020] (1)稱量I. 5g葡萄糖和I. 3g梓檬酸三鈉二水，加雙蒸水至59. 9mL_59. 99mL;
[0021] (2)加入20mL甘油后完全混勻，完全溶解后用0. 45ym微孔濾器過濾；
[0022] (3)加入20mL新鮮卵黃，制成懸浮液；
[0023](4)將所制成的懸浮液置56°C水浴中30分鐘，震蕩攪拌；
[0024] (5)檢測溶液的pH值，使pH值在6. 8-7. 2之間；
[0025](6)溶液送細(xì)菌培養(yǎng)，要求無菌；
[0026] (7)冷藏保存；
[0027](二）添加番茄紅素
[0028] (1)將卵黃、甘油復(fù)合型冷凍保護劑37°C水浴解凍；
[0029] (2)番茄紅素從冰箱內(nèi)取出，分別取番茄紅素4. 296X10_4g-4. 296X10、融入 0.OlmL-O.ImL二甲基亞砜中，制成番茄紅素含量為80mmol/L的溶液，
[0030] (3)取0.OlmL-O.ImL上述溶液加入到99. 9mL-99. 99mL的卵黃、甘油復(fù)合型冷凍保 護劑中，其中番茄紅素濃度為8ymol/L?80ymol/L〇
[0031] 采用含番茄紅素的人精液冷凍保護劑的人精液冷凍方法，包括下列步驟：
[0032] (一）7°C水浴解凍含番茄紅素的人精液冷凍保護劑；
[0033](二）取1份體積的含番茄紅素的人精液冷凍保護劑加入到3份體積精液中，逐滴 加入同時旋轉(zhuǎn)試管；
[0034] (三）加入冷凍保護劑后，混合液分裝在精子冷凍管，使用Therm〇7451程控降溫儀 冷凍，設(shè)定冷凍程序如下：
[0035] (1)20°C平衡5分鐘；
[0036](2)從20°C降至_2°C，冷凍速率_1°C /min ;
[0037](3)從-2°C降至-30°C，冷凍速率-7. 2°C/min;
[0038](4)從-30°C降至_90°C，冷凍速率_30°C /min。
[0039] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點：番茄紅素是脂溶性抗氧化物質(zhì)，直接添加入水溶性保護劑 中，并不能形成均一穩(wěn)定的保護劑溶液。因此，我們選擇能夠溶解番茄紅素并能夠和水溶性 保護劑互溶的有機溶劑作為中間介質(zhì)，使番茄紅素能夠溶于水溶性保護劑，達到更好的保 護作用。減少精子凍融過程中產(chǎn)生大量活性氧對精子的損傷，因此冷凍保護液中添加抗氧 化物質(zhì)：番茄紅素，并采用一種中間介質(zhì)更好的對抗活性氧對精子的損傷，維持精子的正常 形態(tài)和功能。目前，還未有報道采取此種措施將番茄紅素用于人精液冷凍保護劑中。
[0040] 在精液冷凍保護液中添加一定濃度的番茄紅素可以減少線粒體氧化損傷，減輕 ROS對精子質(zhì)I旲的氧化應(yīng)激性損傷，從而提尚精子的抗調(diào)亡能力。提尚冷凍精液的復(fù)蘇率， 活率，前向運動精子數(shù)和正常形態(tài)率。
[0041] 本發(fā)明加入一定量的番茄紅素，對人精子冷凍效果有明顯改善，復(fù)蘇后的人精子 功能學(xué)參數(shù)：前向活動率、存活率顯著高于對照組（未添加番茄紅素），且正常形態(tài)率、DNA 完整率和線粒體膜電位也明顯高于對照組，而精子凋亡率顯著低于對照組，從而提示對人 精子質(zhì)量保護更具有良好的安全性。
【附圖說明】
[0042] 圖IA是對照組樣本的FCM檢測精子凋亡的結(jié)果圖，Ly0:43. 26%;
[0043] 圖IB是Ly5ymo/L組樣本的FCM檢測精子凋亡的結(jié)果圖，Ly5:35. 68%;
[0044] 圖2A是對照組樣本的光鏡下精子形態(tài)和熒光顯微鏡（X400)下精子線粒體膜電位 水平圖；
[0045] 圖2B是Ly5y