一種提高植物組培外植體成活率的衣膜包囊培養(yǎng)法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬農(nóng)林領(lǐng)域的植物組織培養(yǎng)技術(shù)，具體涉及提高植物組培外植體初代培養(yǎng) 成活率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物組織培養(yǎng)技術(shù)種苗生產(chǎn)、脫除病毒、種質(zhì)改良等具有廣闊的市場前景。目前植 物組織培養(yǎng)技術(shù)環(huán)節(jié)還存在不少問題，外植體(種子、芽、莖段、葉、根、花瓣、果實(shí)等）初代誘 導(dǎo)期間死亡而致組織培養(yǎng)失敗是普遍現(xiàn)象。外植體死亡的原因，除了合適的培養(yǎng)基配方外， 外植體沒有專門的吸收組織或器官，主要靠與培養(yǎng)基的接觸面(切口）吸收營養(yǎng)成分和激 素，接觸面積小且吸收功能非常低下，無法滿足外植體細(xì)胞分裂、生長的需要，也是導(dǎo)致外 植體死亡的主要原因,尤其是微小外植體，自身貯存營養(yǎng)物質(zhì)少,對組培環(huán)境適應(yīng)能力差， 更是難以成活，但目前沒有有效的外植體保活方法。植物分生組織培養(yǎng)是脫除病毒的最有 效方法，但植物僅莖尖生長點(diǎn)分生組織不帶毒或病毒濃度低，由于分生組織只是一群細(xì)胞， 只能切取僅〇.I-Imm外植體接種，外植體極其微小接種培養(yǎng)成活率極低，限制了莖尖脫毒 法在脫除病毒的廣泛應(yīng)用，以致植物脫除病毒進(jìn)展緩慢。此外，植物的同一組織常常是由2 種或者2種以上遺傳型細(xì)胞組成的，稱嵌合體，切取的外植體組織塊含不同遺傳型細(xì)胞，培 養(yǎng)所得無性系（愈傷組織、瓶苗）仍是遺傳上異質(zhì)的嵌合體，這種變異影響組培無性系的純 度和質(zhì)量，給組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用造成障礙，所以必須盡量切取較小塊外植體，可望保證外 植體細(xì)胞同一性，規(guī)避培養(yǎng)出的愈傷組織、瓶苗為嵌合體，保證組培無性系的遺傳一致性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明以含營養(yǎng)成分和激素的衣膜劑包囊整個(gè)組培外植體再接種到培養(yǎng)基培養(yǎng)， 衣膜對植物組織幾乎沒有傷害，透水、透氣、透光，培養(yǎng)基的營養(yǎng)及激素能被外植體吸收，細(xì) 胞呼吸不受影響，相對常規(guī)接種方法，擴(kuò)大了外植體與營養(yǎng)成分、激素的接觸面積，增強(qiáng)營 養(yǎng)成分和激素的吸收，可減輕外植體因營養(yǎng)不良而壞死，提高成活率。
[0004] 一種提高植物組培外植體成活率的包囊培養(yǎng)法，其特征在于，本發(fā)明以海藻酸鈉 為成膜劑，附加成分包括營養(yǎng)成分、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(激素)，種類和濃度及酸堿度與培養(yǎng) 基的營養(yǎng)成分、激素及酸堿度一致。海藻酸鈉交聯(lián)固化劑為氯化鈣溶液。
[0005] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下： 海藻酸鈉衣膜劑配制、使用方法：海藻酸鈉濃度2%_5%，先用少量水溶化，與耐高壓滅 菌的營養(yǎng)成分、激素混合，定容，調(diào)pH與培養(yǎng)基酸堿度一致(一般pH5. 8)，高壓滅菌，冷卻待 用。不耐高壓滅菌的營養(yǎng)成分、激素溶液過濾除菌，加入已經(jīng)高壓滅菌的海藻酸鈉成膜劑， 攪拌混勻待用。氯化鈣濃度2%，單獨(dú)高壓滅菌。接種前將已經(jīng)消毒的外植體泡入海藻酸鈉 衣膜劑，用滴管吸取外植體，連同衣膜劑滴入氯化鈣溶液，也可從海藻酸鈉衣膜劑夾取外植 體，輕輕抖掉外植體表面多余衣膜劑粘稠液，投入氯化鈣溶液，固化數(shù)分鐘。取出外植體投 入無菌水洗去多余氯化鈣，在無菌濾紙上吸去無菌水，接種時(shí)輕壓外植體，使其稍陷入瓊脂 培養(yǎng)基表面。
[0006] 本發(fā)明的有益效果在于：常規(guī)組培方法的營養(yǎng)成分、激素僅存在于培養(yǎng)基，外植體 接觸吸收面積小。本發(fā)明將含營養(yǎng)、激素的衣膜劑包囊整個(gè)外植體,可擴(kuò)大外植體吸收養(yǎng) 分、激素面積，提高組培外植體成活率，為外植體誘導(dǎo)成功提供保障。該方法操作簡便，效果 明顯，便于推廣應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】 [0007] 實(shí)施例一 蝴蝶蘭)組培的無菌類原球莖為材料，把體視顯微鏡放在超凈臺(tái)， 在體視顯微鏡下，離類原球莖莖尖先端約Imm切取莖尖為外植體，對照組直接接種，培養(yǎng)基 配方為l/2MS+6-BA5mg/L+椰子汁200ml/L+蔗糖20g/L，pH5. 8。衣膜包囊外植體方法，海藻 酸鈉濃度3%，附加營養(yǎng)激素同培養(yǎng)基各組分，調(diào)pH至5. 8,高壓滅菌后冷卻待用，另備2%氯 化鈣高壓滅菌。接種時(shí)將莖尖投入海藻酸鈉衣膜劑，用鑷子取出輕輕抖掉多余粘稠液，投入 氯化鈣溶液，固化3分鐘，取出投入無菌水洗去多余氯化鈣，在無菌濾紙上吸去無菌水，接 種時(shí)輕壓外植體,使其稍陷入瓊脂培養(yǎng)基表面。每瓶接種5個(gè)外植體，每次3瓶，重復(fù)3次。 接種后在25°C、15001UX光下培養(yǎng)，光照12h/d。培養(yǎng)期間均未發(fā)生微生物污染，不同培養(yǎng)時(shí) 間的莖尖褐化率、誘導(dǎo)(細(xì)胞分裂而膨大）率結(jié)果見表1。
[0008] 表1蝴蝶蘭類原球莖莖尖的衣膜包囊培養(yǎng)法效果觀察
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提高植物組培外植體成活率的衣膜包囊培養(yǎng)法，其特征在于：衣膜劑包括海藻 酸鈉成膜劑、營養(yǎng)成分、植物激素，衣膜劑粘液基本無色透明，與已表面消毒的外植體混合， 用滴管吸取外植體，連同衣膜劑滴入氯化鈣溶液，也可夾取表面沾粘有衣膜劑的外植體塊， 投入氯化鈣溶液，衣膜固化，接種在培養(yǎng)基培養(yǎng)。
2. 如權(quán)利要求1所述的植物組培衣膜包囊外植體方法，其特征在于：所述衣膜劑的營 養(yǎng)成分，植物激素、酸堿度與培養(yǎng)基所添加的營養(yǎng)成分、植物激素、酸堿度一致。
3. 如權(quán)利要求1所述的植物組培衣膜包囊外植體方法，其特征在于：所述海藻酸鈉濃 度為2%_5%，聞壓滅困。
4. 如權(quán)利要求1所述的植物組培衣膜包囊外植體方法，其特征在于：所述的營養(yǎng)成分、 植物激素，耐高壓滅菌的混溶于海藻酸鈉溶液一起高壓滅菌，不耐高壓滅菌的過濾除菌后 混溶于已高壓滅菌海藻酸鈉溶液。
5. 如權(quán)利要求1所述的植物組培衣膜包囊外植體方法，其特征在于：所述的氯化鈣溶 液濃度2%，高壓滅菌后冷卻。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種在植物組培中以含營養(yǎng)成分、植物激素的衣膜劑包囊外植體以提高培養(yǎng)成活率的方法，屬農(nóng)林領(lǐng)域的植物組織培養(yǎng)技術(shù)。包括以透氣、透水、透光性好，對植物組織安全、耐高壓滅菌衣膜劑包囊外植體。成膜劑為海藻酸鈉溶液，混溶營養(yǎng)成分、激素，與已表面消毒的外植體混合，取出外植體浸入氯化鈣溶液，交聯(lián)固化成粒狀。通過包囊，可擴(kuò)大外植體對營養(yǎng)、激素的接觸、吸收面積，提高誘導(dǎo)培養(yǎng)成活率。在植物組培中，利用莖尖分生組織的脫毒培養(yǎng)，避免外植體塊為嵌合體而帶來組培無性系變異，都盡量切取小塊外植體，本發(fā)明包囊微小外植體對提高培養(yǎng)成活率效果明顯，且該方法操作簡便，成本低廉，便于推廣應(yīng)用。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號(hào)】CN104604681
【申請?zhí)枴緾N201510033454
【發(fā)明人】劉福平
【申請人】福建省亞熱帶植物研究所
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年1月23日