在rin基因中具有非轉(zhuǎn)基因改變的番茄植物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)和植物育種的領(lǐng)域。本發(fā)明提供了包含具有ー個(gè)或多個(gè) 突變的rin等位基因的番爺（SolanumIycopersicum)植物，所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生與野生型 Rin蛋白相比具有降低的活性的突變r(jià)in蛋白。本發(fā)明提供了植物，與野生型Rin等位基因 純合型番茄植物相比，所述植物的果實(shí)顯示出更慢的果實(shí)成熟和/或更長的貯藏期。另外， 本發(fā)明提供了本發(fā)明的番茄植物的番茄果實(shí)、種子、花粉、植物部分和后代。本發(fā)明還提供 了本發(fā)明的植物果實(shí)的食品和食品產(chǎn)品。
[0002] 本發(fā)明還提供了內(nèi)源性rin基因和由所述基因編碼的rin蛋白，具有至少ー個(gè)人 エ誘導(dǎo)的非轉(zhuǎn)基因突變。
[0003] 在另ー個(gè)實(shí)施方案中，本文提供了用來制備在其基因組中含有一個(gè)或多個(gè)突變 rin等位基因的番茄植物的方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 番茄的育種的目的在于產(chǎn)生被最佳地改造為適于生長和貯藏條件的商業(yè)品種。育 種者面臨的挑戰(zhàn)是在收獲后的果實(shí)硬度與消費(fèi)者對(duì)味道質(zhì)感和顔色的需求之間尋找ー種 改進(jìn)的平衡。這些消費(fèi)者的需求與果實(shí)成熟密切相關(guān)。果實(shí)成熟是ー個(gè)復(fù)雜的發(fā)育過程，負(fù) 責(zé)將含種子的器官轉(zhuǎn)化成能吸引種子傳播者（seeddispenser)和農(nóng)業(yè)消費(fèi)者的組織。和 果實(shí)成熟相關(guān)的變化--尤其是收獲后軟化--限制了新鮮番茄的貯藏期。
[0005] 對(duì)于番茄果實(shí)的生長和發(fā)育，可看出如下許多連續(xù)的階段：花發(fā)育、授粉、接著發(fā) 生特征為高頻率的細(xì)胞分裂的早期果實(shí)發(fā)育，而且所述果實(shí)的大小快速増大，這主要是由 于細(xì)胞擴(kuò)增。在第三階段結(jié)束吋，果實(shí)達(dá)到了綠熟期。在第四階段期間，發(fā)生了果實(shí)成熟， 其由顔色和味道以及果實(shí)硬度和質(zhì)感的變化來表征。
[0006] 番茄紅素和胡蘿卜素的累積導(dǎo)致了番茄果實(shí)的特征性紅色的形成。一般而言，可 區(qū)分不同的著色階段：綠熟期（maturegreen)、破色期（breaker)、粉紅期（pink)和紅熟期 (red)。在破色期階段，開始了典型的紅色色素沉積。紅熟階段或紅熟收獲果實(shí)階段是這樣 的階段，其中所述果實(shí)在其主要部分上都達(dá)到了成熟的顔色。
[0007] 除了所述顏色改變，在果實(shí)成熟過程中，酶活性導(dǎo)致細(xì)胞壁的中間層狀區(qū)域發(fā)生 降解，該降解導(dǎo)致表現(xiàn)為果實(shí)軟化和果實(shí)質(zhì)感喪失的細(xì)胞松弛。經(jīng)常果實(shí)軟化的測量方 式為對(duì)壓縮的外部抵抗力，這可通過例如果實(shí)硬度計(jì)（penetrometer)或食品質(zhì)地測定計(jì) (texturometer)(例如，Instron3342SingleColumnTestingSystem)進(jìn)行量化。
[0008] 對(duì)已知參與成熟的單個(gè)基因的修飾還沒有獲得正常成熟但具有最小的組織軟化 的果實(shí)。
[0009]MADS-盒轉(zhuǎn)錄因子-成熟抑制子（RipeningInhibitor,Rin)是番爺果實(shí)成熟 的必需調(diào)節(jié)子，但是其影響成熟相關(guān)基因的表達(dá)的確切機(jī)制仍然不清楚。除了編碼其調(diào)節(jié) 不受乙烯影響的必需因子外，所述Rin基因還編碼觸發(fā)躍變呼吸以及成熟相關(guān)的乙烯生物 合成所必需的基因調(diào)節(jié)組件。唯一報(bào)道的rin基因座中的突變是在育種系中自發(fā)地產(chǎn)生 (R.RobinsonandM.Tomes,Rep.TomatoGenet.Coop.I8,36 (I%8))。所述純合的;rin突變 (rin/rin)有效阻礙了成熟過程并產(chǎn)生了綠色/黃色番茄果實(shí)，該綠色/黃色番茄果實(shí)不會(huì) 產(chǎn)生升高的乙烯水平并且也不會(huì)響應(yīng)于外源乙烯而成熟。rin等位基因雜合型番茄在一段 延長的時(shí)期內(nèi)保持硬實(shí)并成熟，使得能夠進(jìn)行エ業(yè)規(guī)模的處理以及擴(kuò)大的遞送和儲(chǔ)藏機(jī)會(huì) (Vrebalovetal，Science296,343-346(2002))。
[0010] 由于這類突變在純合時(shí)會(huì)導(dǎo)致成熟幾乎完全停止，因此其僅能以雜合的形式用于 商業(yè)，使得能夠發(fā)生較慢的成熟。但是，在所述突變體中雜合果實(shí)的味道發(fā)育和顔色不是最 佳的。因此，本發(fā)明的目的是鑒定突變的rin等位基因，所述突變的rin等位基因?qū)е铝搜?遲的成熟和/或更長的貯藏期，而不會(huì)對(duì)果實(shí)質(zhì)量、顔色和消費(fèi)者需求產(chǎn)生所述負(fù)面影響。 由于所述突變等位基因編碼具有降低的功能的突變r(jià)in蛋白（與現(xiàn)有rin突變體的完全功 能喪失不同），因此這類等位基因可以雜合形式和純合形式導(dǎo)致番茄果實(shí)成熟。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 因此，本發(fā)明的目的是產(chǎn)生和鑒定番茄種的栽培植物，所述栽培植物的果實(shí)具有 延遲的成熟和/或延長的收獲后貯藏期，而對(duì)果實(shí)質(zhì)量、顔色和消費(fèi)者需求沒有不良效應(yīng) 或具有可接受的不良效應(yīng)。
[0012] 因此，本發(fā)明涉及包含具有一個(gè)或多個(gè)突變的rin等位基因的番茄種的栽培植 物，所述突變導(dǎo)致產(chǎn)生與野生型Rin蛋白相比具有降低的活性的突變r(jià)in蛋白，但是當(dāng)所述 突變等位基因以雜合或純合形式存在吋，該突變r(jià)in蛋白含有足夠的功能以使番茄果實(shí)成 熟到紅熟階段。
[0013] 一般性定義
[0014]術(shù)語"核酸序列"（或核酸分子）是指單鏈或雙鏈形式的DNA或RNA分子，尤其是 編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的DNA。"分離的核酸序列"是指這樣的核酸序列，即其 不再處于分離出其的天然環(huán)境中，例如，在細(xì)菌宿主細(xì)胞中或者在植物細(xì)胞核或質(zhì)體基因 組中的核酸序列。
[0015] 術(shù)語"蛋白質(zhì)"或"多肽"可互換使用并且指的是由氨基酸鏈組成的分子，不管具 體的作用模式、大小、三維結(jié)構(gòu)或來源。因此，Rin蛋白的"片段"或"部分"也可被稱為"蛋 白質(zhì)"。"分離的蛋白質(zhì)"用于指不再處于其天然環(huán)境中的蛋白質(zhì)，例如在體外或者在重組的 細(xì)菌或植物宿主細(xì)胞中。
[0016] 術(shù)語"基因"意指含有可操作地連接到適合的調(diào)節(jié)區(qū)（例如，啟動(dòng)子）的區(qū)（轉(zhuǎn)錄 區(qū)）--其在細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄成為RNA分子（例如mRNA或RNAi分子）--的DNA序列。因 此，基因可包含數(shù)個(gè)可操作地連接的序列，例如，啟動(dòng)子、含有例如參與轉(zhuǎn)錄起始的序列的 5'前導(dǎo)序列、（蛋白質(zhì)）編碼區(qū)域（cDNA或基因組DNA)和含有例如轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的3'非 翻譯序列?；蚩梢允峭庠椿颍ㄔ谠瓉淼姆N中）或是嵌合基因（例如，轉(zhuǎn)基因或同源轉(zhuǎn) 基因（cisgene)) 〇
[0017] "基因的表達(dá)"是指在其中可操作地連接至合適的調(diào)節(jié)區(qū)（尤其是啟動(dòng)子）的DNA 區(qū)被轉(zhuǎn)錄成RNA的過程，所述RNA具有生物學(xué)活性，S卩，其能夠被翻譯成有生物學(xué)活性的蛋 白質(zhì)或多肽（或活性肽片段）或其本身具有活性（例如，在轉(zhuǎn)錄后基因沉默或RNAi中）。 所述編碼序列可以是有義方向的并編碼所需的、有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或多肽、或活性肽 片段。
[0018] "活性蛋白質(zhì)"或"功能性蛋白質(zhì)"是具有體外（例如通過體外活性測定）和/或 體內(nèi)（例如通過所述蛋白賦予的表型）可測量的蛋白質(zhì)活性的蛋白質(zhì)。"野生型"蛋白質(zhì) 是指野生型植物中存在的完全功能性蛋白質(zhì)。本文的"突變蛋白質(zhì)"是在編碼所述蛋白質(zhì) 的核酸序列中含有一種或多種突變的蛋白質(zhì)，其中所述突變導(dǎo)致（所述突變核酸分子編碼 的）"功能降低"或"功能喪失"的蛋白，例如在體內(nèi)測量的，例如通過所述突變等位基因賦 予的表型測量的。
[0019] "功能降低的rin蛋白"或"活性降低的rin蛋白"是指突變r(jià)in蛋白，當(dāng)編碼所述 突變蛋白的等位基因以純合形式存在于番茄植物中時(shí)，所述突變r(jià)in蛋白仍然能使果實(shí)成 熟發(fā)生到紅熟階段。這類功能降低的rin蛋白可通過"部分敲除突變r(jià)in等位基因"（例 如，在其核酸序列中含有一個(gè)或多個(gè)突變的野生型Rin等位基因）的翻譯來獲得。在一方 面，所述部分敲除突變r(jià)in等位基因是野生型Rin等位基因，其包含優(yōu)選地導(dǎo)致rin蛋白產(chǎn) 生的突變，在所述rin蛋白中至少ー個(gè)保守的和/或功能性氨基酸被置換成另一個(gè)氨基酸， 以使得生物學(xué)活性顯著降低但不會(huì)完全消失。所述部分敲除突變r(jià)in等位基因也可能編碼 顯性負(fù)性rin蛋白，該蛋白能夠?qū)ο嗤?xì)胞內(nèi)的其他Rin蛋白的生物活性產(chǎn)生不利影響。 所述顯性負(fù)性rin蛋白可以是這樣的rin蛋白，即所述蛋白仍然能夠同野生型Rin蛋白一 樣與相同的元件相互作用但是阻斷了其功能的ー些方面。顯性負(fù)性rin蛋白的實(shí)例為如下 的rin蛋白：其缺少對(duì)于激活和/或二聚化的關(guān)鍵的激活結(jié)構(gòu)域和/或二聚化結(jié)構(gòu)域或特 定的氨基酸殘基，或者在所述激活結(jié)構(gòu)域和/或二聚化結(jié)構(gòu)域或特定的氨基酸殘基中具有 修飾，但是仍然包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以使得不僅它們自身的生物學(xué)活性被降低或消失，而 且它們還通過與細(xì)胞中存在的的野生型蛋白和/或部分敲除rin蛋白競爭DNA結(jié)合位點(diǎn)來 降低細(xì)胞內(nèi)的總rin活性。突變等位基因可能是"天然突變"等位基因（天然存在的突變 等位基因，例如，沒有人工應(yīng)用誘變劑的情況下而自發(fā)產(chǎn)生的）或是"誘導(dǎo)突變"等位基因 (其是由人工干擾誘導(dǎo)的，例如，通過誘變）。
[0020] "功能喪失的：Tin蛋白"是指突變r(jià)in蛋白，當(dāng)編碼所述突變蛋白的等位基因以 純合形式存在于番茄植物中時(shí)（例如現(xiàn)有技術(shù)中存在的已有rin突變（其記載于例如 Vrebalovetal.2002,Science296:343-346；Itoetal. , 2008,PlantJ. 55:212-223 ； Marteletal.2011，PlantPhysiol157:1568-1579;并且AccessionLA3754 也具有現(xiàn)有 技術(shù)的rin/rin，其可從TGRC，TomatoGeneticsResourceCentre中獲得），所述突變r(jià)in 蛋白無法使果實(shí)成熟發(fā)生到紅熟階段。
[0021] 編碼蛋白質(zhì)的核酸分子中的"突變"是與野生型序列相比的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的 改變，例如通過置換、缺失或插入ー個(gè)或多個(gè)核苷酸。"點(diǎn)突變"是單個(gè)核苷酸的置換，或單 個(gè)核苷酸的插入或缺失。
[0022] "無義"突變是編碼蛋白質(zhì)的核酸序列中的（點(diǎn)）突變，由此ー個(gè)密碼子變?yōu)榻K止 密碼子。這導(dǎo)致在mRNA中存在提前終止密碼子并導(dǎo)致截短的蛋白質(zhì)。截短的蛋白質(zhì)可能 具有降低的功能或失去功能。
[0023] "錯(cuò)義"或非同義突變是編碼蛋白質(zhì)的核酸序列中的（點(diǎn)）突變，由此ー個(gè)密碼子 變?yōu)榫幋a不同的氨基酸。所產(chǎn)生的蛋白可能具有降低的功能或失去功能。
[0024] "剪切位點(diǎn)"突變是編碼蛋白質(zhì)的核酸序列中的突變，由此前mRNA(pre-mRNA)的 RNA剪切被改變，產(chǎn)生了具有與野生型不同的核苷酸序列的mRNA和具有與野生型不同的氨 基酸序列的蛋白質(zhì)。所產(chǎn)生的蛋白可能具有降低的功能或失去功能。
[0025] "移碼"突變是編碼蛋白質(zhì)的核酸序列中的突變，由此mRNA的讀碼框被改變，產(chǎn)生 了不同的氨基酸序列。所產(chǎn)生的蛋白可能具有降低的功能或失去功能。
[0026] 調(diào)節(jié)序列中（例如基因的啟動(dòng)子中）的突變是例如通過置換、缺失或插入ー個(gè)或 多個(gè)核苷酸造成的與野生型序列相比的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的改變，從而導(dǎo)致例如產(chǎn)生降低 的或不產(chǎn)生所述基因的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
[0027] "沉默"是指靶基因或基因家族的基因表達(dá)的下調(diào)或完全抑制。
[0028] 基因沉默方法中的"靶基因"是當(dāng)嵌合沉默基因（或"嵌合RNAi基因"）被表達(dá)時(shí) 并且例如產(chǎn)生沉默RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（例如，能夠沉默內(nèi)源性靶基因表達(dá)的dsRNA或發(fā)卡RNA) 時(shí)，其內(nèi)源性基因表達(dá)被下調(diào)或被完全抑制（沉默）的基因或基因家族（或基因的ー個(gè)或 多個(gè)具體等位基因）。在誘變方法中，靶基因是待突變的內(nèi)源性基因，導(dǎo)致了基因表達(dá)的改 變（降低或喪失）或所編碼的蛋白質(zhì)功能的改變（降低或喪失）。
[0029] 如本文使用的，術(shù)語"可操作地連接"是指處于功能性關(guān)系中的多聚核苷酸元件 的連接。當(dāng)ー種核酸與另ー核酸序列置于功能性關(guān)系中時(shí)，該核酸被"可操作地連接"。例 如，如果啟動(dòng)子（或者更確切地說是轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列）影響了編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動(dòng)子與 所述編碼序列可操作地連接?？刹僮鞯剡B接意指所連接的DNA序列通常是相鄰的，并且當(dāng) 需要連接兩種蛋白質(zhì)編碼區(qū)時(shí)所連接的DNA序列是鄰近的且處于讀碼框中以產(chǎn)生"嵌合蛋 白"。"嵌合蛋白"或"雜合蛋白"是由不同的蛋白"結(jié)構(gòu)域"（或基序）組成的蛋白，所述蛋 白本身不是天然存在的，但是連接后形成了顯示了被連接的結(jié)構(gòu)域的功能的功能性蛋白。 嵌合蛋白質(zhì)也可以是天然存在的兩個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的融合蛋白。
[0030] 術(shù)語"食品"是被消耗以給機(jī)體提供營養(yǎng)支持的任何物質(zhì)。通常，其是植物或動(dòng)物 來源，并包括必需營養(yǎng)物質(zhì)（例如，碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、維生素、或礦物質(zhì)）。所述物 質(zhì)被生物體攝取并被生物體細(xì)胞吸收以努力產(chǎn)生能量、維持生命、或激發(fā)生長。術(shù)語食品包 括被消耗以給人類和動(dòng)物機(jī)體提供營養(yǎng)支持的物質(zhì)。
[0031] 術(shù)語"貯藏期"或"收獲后貯藏期"是指在果實(shí)被認(rèn)為不適合出售或食用（'壞的'） 之前給予果實(shí)的（平均）時(shí)間長度。貯藏期是產(chǎn)品能被儲(chǔ)藏的時(shí)間段，在該時(shí)期內(nèi)所定義的 具體比例貨物的質(zhì)量在預(yù)期的分配、儲(chǔ)藏和展示的條件下仍然是可接受的。貯藏期受以下 幾個(gè)因素影響：光和熱的暴露、氣體的傳送（包括濕度）、機(jī)械應(yīng)力、和例如微生物的污染。 通常圍繞所述果實(shí)的硬度/柔軟度參數(shù)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行數(shù)學(xué)建模。可將貯藏期定義為植物 株系的果實(shí)開始變壞并且不適合出售或食用時(shí)所花費(fèi)的（平均）時(shí)間，例如從植物的第一 果實(shí)進(jìn)入破色期或轉(zhuǎn)色期（turningstage)開始或從第一果實(shí)完全變紅開始或從收獲時(shí)開 始。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變體具有比野生型植物的貯藏期顯著更長的貯藏期，例 如，當(dāng)植物在相同的條件下生長和果實(shí)被用相同的方式處理并在相同的條件下保存吋，從 第一果實(shí)處于破色期（或轉(zhuǎn)色期、粉紅期、紅熟期或從收獲時(shí)起）直到其開始變'壞'并且不 適合出售或食用的天數(shù)是顯著更長的，例如，比對(duì)照植物（例如野生型Rin/Rin植物）的果 實(shí)的貯藏期長至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天。因此，為了確定從特定階段（例如， 從破色期或后期階段）到變'壞'階段所需要的天數(shù)，例如，可將野生型對(duì)照植物（在和突 變植物相同的條件下生長的并處于相同的發(fā)育階段）的第一果實(shí)進(jìn)入特定階段（例如，破 色期或后期階段）的那天認(rèn)為是起點(diǎn)（第一天），從這天起果實(shí)被定期觀察（以特定時(shí)間間 隔，例如1、2、3、4、5、或6天以后）直到第一果實(shí)經(jīng)過完全成熟階段并變'壞'的那天（如視 覺上和/或通過評(píng)估果實(shí)柔軟度可測定的）（參見實(shí)施例）。
[0032] 在本申請中，與詞語"貯藏期"結(jié)合使用的詞語"改善的"、"増加的"、"更長的"和 "延長的"被互換使用并且所有都意指本發(fā)明番茄植