一種奇異南星的離體培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種奇異南星的離體培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]奇異南星(Arisaema decipiens)又稱鐵燈臺(tái)、青腳蓮,是天南星科(Araceae)天南星屬(Arisaema)植物,分布在印度以及中國(guó)大陸的廣西、云南等地,生長(zhǎng)于海拔880米至3400米的地區(qū)，多生在山坡灌叢中，目前尚未由人工引種栽培。該植物根莖入藥，主治無(wú)名腫毒、乳腺炎、癰疽、毒蛇咬傷、蜂蝎螫傷、蜘蛛及老鼠咬傷。在侗族聚居地，當(dāng)?shù)厝送ㄟ^(guò)外用奇異南星的塊莖來(lái)治療乳腺癌。目前，對(duì)于奇異南星的研究很少，僅見(jiàn)一篇有關(guān)于其化學(xué)成分的報(bào)道，對(duì)其組織培養(yǎng)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種奇異南星離體培養(yǎng)的方法。
[0004]本發(fā)明所提供的奇異南星的離體培養(yǎng)方法，包括如下步驟:將奇異南星的組培無(wú)菌苗的葉柄進(jìn)行切段，得到葉柄段；將葉柄段進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到愈傷組織；再將愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)得到奇異南星再生苗。
[0005]上述方法中，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基按照如下方法制備得到:向MS培養(yǎng)基中添加6-BA和2，4-D，使6-BA在所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為1.0mg/L,2，4-D在所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為1.0mg/L ；
[0006]上述方法中，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為:溫度為25±2°C、光照時(shí)間為12h.d \ 光照強(qiáng)度為 30 ?40mmol.m 2.s 1O
[0007]上述方法中，所述葉柄段的長(zhǎng)度為0.5cm。
[0008]上述方法中，所述“再將愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)得到奇異南星再生苗”包括如下步驟:將所述愈傷組織進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到帶有不定芽和不定根的幼苗。
[0009]上述方法中，所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照如下方法制備得到:向MS培養(yǎng)基中添加IAA和6-BA，使IAA在所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5?2.0mg/L,具體為0.5mg/L或2.0mg/L, 6-BA在所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5?2.0mg/L，具體為0.5mg/L 或 2.0mg/L ；
[0010]上述方法中，所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為:溫度為25±2°C、光照時(shí)間為12h.d \ 光照強(qiáng)度為 30 ?40mmol.m 2.s 1O
[0011]上述方法中，在所述進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)之前，還包括對(duì)所述愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)的步驟。
[0012]上述方法中，所述繼代培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基按照如下方法制備得到:向MS培養(yǎng)基中添加6-BA和24-D，使6-BA在所述繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.5?4.0mg/L,具體為0.5mg/L、1.0mg/L或4.0mg/L, 2，4-D在所述繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.5?4.0mg/L,具體為 0.5mg/L、1.0mg/L 或 4.0mg/L ；
[0013]上述方法中，所述繼代培養(yǎng)的條件為:溫度為25±2°C、光照時(shí)間為I?!.Cf1、光照強(qiáng)度為 30 ?40mmol.m 2.s、
[0014]上述方法中，所述奇異南星的組培無(wú)菌苗按照如下方法制備得到:將奇異南星的種子用MS培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天光照12h，培養(yǎng)溫度為23?27 V ’光照強(qiáng)度為30?40mmol.πΓ2.s-1,培養(yǎng)30天,得到所述無(wú)菌苗。
[0015]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供奇異南星離體培養(yǎng)中使用的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和/或不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
[0016]上述奇異南星愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按照如下方法制備得到:向MS培養(yǎng)基中添加6-BA和2，4-D，使6-BA在所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為1.0mg/L, 2，4_D在所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為1.0mg/L。
[0017]上述奇異南星不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按照如下方法制備得到:向MS培養(yǎng)基中添加IAA和6-BA，使IAA在所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5?2.0mg/L,具體為0.5mg/L或2.0mg/L, 6-BA在所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5?2.0mg/L,具體為0.5mg/L或2.0mg/L ο
[0018]實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明奇異南星離體培養(yǎng)方法能夠成功獲得奇異南星再生苗，該方法對(duì)有效保護(hù)和利用野生奇異南星資源有重要意義。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0020]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0021]實(shí)施例1、奇異南星離體繁殖方法
[0022]一、植物材料來(lái)源及消毒處理
[0023]奇異南星種子采于廣西省靖西縣龍邦鎮(zhèn)。將采集的種子用自來(lái)水沖洗lh，再用蒸餾水浸泡24h后，于超凈工作臺(tái)內(nèi)先用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇表面消毒30s，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為
0.1 %升萊消毒7min，最后用無(wú)菌水沖洗5次。
[0024]二、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件
[0025]以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基經(jīng)121°C高壓滅菌20min。以消毒后種子作為外植體，接種后，每天光照12h，置于溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度為30?40mmol.πΓ2.s—1的培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)。
[0026]三、無(wú)菌苗的獲得
[0027]大約I周左右，接種于MS培養(yǎng)基的消毒后種子開(kāi)始萌發(fā)，15d后長(zhǎng)出葉片，30d后苗高3?5cm，得到無(wú)菌苗。
[0028]四、愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖
[0029]在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將奇異南星無(wú)菌苗的葉片切成約0.5X0.5cm大小的切塊，將葉柄切成0.5cm長(zhǎng)的切段，分別接種到含有不同濃度的2，4-D和6-BA的培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基:MS+6-BAl.0mg/L+2, 4-D 1.0mg/L。將愈傷組織置于溫度為25±2°C、光照時(shí)間為12h.Cf1和光照強(qiáng)度為30?40mmol.πΓ2.s—1的培養(yǎng)條件下進(jìn)行誘導(dǎo)。葉柄2周后可誘導(dǎo)出愈傷組織，而葉片褐化死亡，不能誘導(dǎo)出愈傷組織。
[0030]將誘導(dǎo)出的愈傷組織接種于MS+6-BA(0.5?4.0)mg/L+2, 4-D (0.5?4.0)mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)條件:溫度為25±2°C、光照時(shí)間為12h.(!'光照強(qiáng)度為 30 ?40mmol.m 2.s 1O
[0031]愈傷組織迅速增殖，增殖倍數(shù)為8.09?11.72倍。當(dāng)6_BA和2，4_D的濃度均為
0.5mg/L時(shí)，愈傷組織增殖倍數(shù)為9.34，當(dāng)6-BA和2，4-D的濃度均為4.0mg/L時(shí)，愈傷組織增殖倍數(shù)為8.09。其中MS+6-BA1.0mg/L+2, 4-D 1.0mg/L培養(yǎng)基的增殖效果最好，愈傷組織增殖倍數(shù)達(dá)11.72倍。
[0032]五、不定芽的誘導(dǎo)及植株再生
[0033]在添加IAA和6-BA的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基:MS+IAA(0.5?2.0)mg/L+6-BA(0.5?2.0)mg/L。將繼代培養(yǎng)后的愈傷組織置于溫度為25±2°C、光照時(shí)間為12h.(Γ1、光照強(qiáng)度為30?40mmol.m_2.s—1的培養(yǎng)條件下進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。
[0034]不定芽的誘導(dǎo)率與兩種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度密切相關(guān)，當(dāng)IAA和6-BA的濃度均為
0.5mg/L時(shí)，不定芽的誘導(dǎo)率最高，可達(dá)82%，并且不定芽的生長(zhǎng)狀況良好，葉柄較粗，葉片較大，生長(zhǎng)旺盛。當(dāng)IAA和6-BA的濃度均為2.0mg/L時(shí)，不定芽的誘導(dǎo)率為42.67%。
[0035]在誘導(dǎo)不定芽的同時(shí)，不定芽開(kāi)始出現(xiàn)白色不定根，隨后根尖伸長(zhǎng)，不定根呈輻射狀分布，大多數(shù)根較粗壯，根毛較多，生根率達(dá)到100%，平均生根條數(shù)為10.35條，平均根長(zhǎng)為 7.43cm。
[0036]六、煉苗與移栽
[0037]將三角瓶的瓶口打開(kāi)進(jìn)行煉苗。I周后，將長(zhǎng)勢(shì)良好、根系發(fā)達(dá)的再生苗取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移栽至由泥炭土、珍珠巖和沙(4:3:2，v/v/v)組成的混合基質(zhì)中，置于相對(duì)濕度為80%?90%、溫度為20°C左右的環(huán)境中培養(yǎng)，定時(shí)澆水，30d后成活率達(dá)100%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種奇異南星的離體培養(yǎng)方法，包括如下步驟:將奇異南星的組培無(wú)菌苗的葉柄進(jìn)行切段，得到葉柄段；將葉柄段進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到愈傷組織；再將愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)得到奇異南星再生苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基按照如下方法制備得到:向MS培養(yǎng)基中添加6-BA和2，4-D，使6-BA在所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為1.0mg/L, 2, 4-D在所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為1.0mg/L ； 所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為:溫度為25±2°C、光照時(shí)間為12h.Cf1、光照強(qiáng)度為30 ?40mmol.m 2.s、
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述葉柄段的長(zhǎng)度為0.5cm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述“再將愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)得到奇異南星再生苗”包括如下步驟:將所述愈傷組織進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到帶有不定芽和不定根的幼苗。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照如下方法制備得到:向MS培養(yǎng)基中添加IAA和6-BA，使IAA在所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5?2.0mg/L，具體為0.5mg/L或2.0mg/L, 6-BA在所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5?2.0mg/L,具體為0.5mg/L或2.0mg/L ； 所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為:溫度為25±2°C、光照時(shí)間為12h.(Γ1、光照強(qiáng)度為30 ?40mmol.m 2.s、
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:在所述進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)之前，還包括對(duì)所述愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于:所述繼代培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基按照如下方法制備得到:向MS培養(yǎng)基中添加6-BA和2，4-D，使6-BA在所述繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.5?4.0mg/L,具體為0.5mg/L、1.0mg/L或4.0mg/L, 2，4-D在所述繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度為0.5?4.0mg/L,具體為0.5mg/L、1.0mg/L或4.0mg/L ； 所述繼代培養(yǎng)的條件為:溫度為25±2°C、光照時(shí)間為12h.Cf1、光照強(qiáng)度為30?40mmo1.πΓ2.s-1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于:所述奇異南星的組培無(wú)菌苗按照如下方法制備得到:將奇異南星的種子用MS培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天光照12h，培養(yǎng)溫度為23?27°C，光照強(qiáng)度為30?40mmol.πΓ2.s4,培養(yǎng)30天,得到所述無(wú)菌苗。
9.奇異南星愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按照如下方法制備得到:向MS培養(yǎng)基中添加6-BA和2，4-D，使6-BA在所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為1.0mg/L, 2，4-D在所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為1.0mg/Lο
10.奇異南星不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按照如下方法制備得到:向MS培養(yǎng)基中添加IAA和6-BA，使IAA在所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5?2.0mg/L,具體為0.5mg/L或2.0mg/L,6-BA在所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度為0.5?2.0mg/L,具體為0.5mg/L或2.0mg/Lο
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種奇異南星的離體培養(yǎng)方法。本發(fā)明所提供的奇異南星的離體培養(yǎng)方法，包括如下步驟：將奇異南星的組培無(wú)菌苗的葉柄進(jìn)行切段，得到葉柄段；將葉柄段進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到愈傷組織；再將愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)得到奇異南星再生苗。實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明奇異南星離體培養(yǎng)方法能夠成功獲得奇異南星再生苗，該方法對(duì)有效保護(hù)和利用野生奇異南星資源有重要意義。
【IPC分類】A01H4-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104642106
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410263736
【發(fā)明人】王俊麗, 張璐, 李曉旭, 馬林喜, 費(fèi)良丹, 田璧瑞, 郭萌, 彭耀
【申請(qǐng)人】中央民族大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2014年6月13日