一種以鱗莖片為外植體構(gòu)建大蒜微繁的方法
【專利說明】一種以鱗莖片為外植體構(gòu)建大蒜微繁的方法
[0001] 本專利得到天津市農(nóng)委重點項目（201302030)和天津師范大學應(yīng)用開發(fā)研究基金 資助。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于蔬菜種植技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種以鱗莖片為外植體構(gòu)建大蒜微繁的方 法。
【背景技術(shù)】
[0003]大蒜作為無性繁殖作物，生產(chǎn)上多以大蒜瓣為種子進行種植，生產(chǎn)成本高、繁殖系 數(shù)低、病毒積累、種性退化等問題嚴重影響大蒜生產(chǎn)(徐培文，2006)。尋找大蒜快繁、脫毒 以及種質(zhì)遺傳改良技術(shù)迫在眉睫。前人工作中構(gòu)建了多種大蒜快繁脫毒技術(shù)體系，如用大 蒜幼葉、全展葉根尖、莖尖、花序軸等為外植體構(gòu)建大蒜組織培養(yǎng)體系；張昌偉等（2004)通 過大蒜根尖誘導不定芽得到試管苗并成功的得到了試管鱗莖；Luciani等（2006)以大蒜 莖尖為外植體誘導出再生能力較強的愈傷組織；張素芝等（2006)利用大蒜莖盤進行愈傷 組織的誘導，并獲得了適宜于愈傷組織增殖分化的培養(yǎng)基。眾多研究多以獲得高效試管苗 為主要目標，但對由這些再生植株從苗期到大蒜成熟期的完整培養(yǎng)體系報道較少，尤其未 見在第一代獲得高分辨率大蒜的報道。實踐證明，大蒜從組培苗到獲得地下鱗莖需要時 間較長，栽培條件要求高，更大的問題是，一般第一代組培苗，種植一個季節(jié)多收獲獨頭蒜 (Ljiljana等，2014)，在某種程度上影響著大蒜的進一步擴繁。本發(fā)明通過優(yōu)化愈傷組織誘 導、再分化的培養(yǎng)條件，增加壯芽培養(yǎng)過程、組培苗越冬前移栽以及改善栽培過程管理等措 施，成功構(gòu)建了能夠在第一代收獲分瓣率高達94%大蒜鱗莖的技術(shù)體系，為大蒜的生產(chǎn)和 遺傳改良提供重要的技術(shù)資料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是為了獲得一種大蒜快繁技術(shù)體系，解決用蒜瓣種蒜成本高、由試 管苗繁殖成活率低的問題，本發(fā)明通過對愈傷組織誘導的不定芽進行壯芽培養(yǎng)、調(diào)整試管 苗移栽方式等，構(gòu)建一個在第一代收獲高分瓣率大蒜新的、完整的技術(shù)體系。
[0005]為實現(xiàn)紅色那個數(shù)目的，本發(fā)明公開了一種以鱗莖片為外植體構(gòu)建大蒜微繁的方 法，其特征在于按如下的步驟進行： (1) 外植體的獲得： 選取生長健壯、無病蟲害、自然結(jié)束休眠后的大蒜蒜頭，剝?nèi)ネ饷骥[葉，用自來水沖洗 20min，用0.l%(w/w)升萊浸泡IOmin,無菌水沖洗3次，再在75%(w/w)酒精中浸泡5min，殺 滅表面細菌,無菌水沖洗3次，再用濾紙吸干備用； (2) 大蒜愈傷組織誘導： 在超凈臺上將大蒜鱗莖切2_厚薄片，接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，置人工氣候箱 中培養(yǎng)：日溫25°C，夜溫20°C，光照強度為1500Lux，光照時間14h/d，6-14天后在外植 體上形成微小的愈傷組織顆粒，接種25-30天后外植體上已經(jīng)形成大量的愈傷組織顆粒； (3) 愈傷組織繼代及不定芽分化： 將生長旺盛的愈傷組織切下，接種到新鮮的繼代培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，25天之后愈 傷組織增殖明顯，在同樣培養(yǎng)基上再繼代一次，挑選生長狀況良好的愈傷組織顆粒轉(zhuǎn)移到 不定芽分化的培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，經(jīng)過10-12天的分化培養(yǎng)，逐漸分化出生長健壯、顏 色濃綠的不定芽；其中 所述的愈傷組織誘導培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基指的是：MS+1. 5mg/L2, 4-D+0. 5mg/LKT; 所述的不定芽分化的培養(yǎng)基指的是：MS+5mg/L6-BA+l.Omg/LNAA; (4) 壯芽培養(yǎng)： 將分化培養(yǎng)基中誘導出來的愈傷組織和嫩芽一起轉(zhuǎn)移到壯芽培養(yǎng)基或生根培養(yǎng)基中 進行30-32d壯芽培養(yǎng)；所述的壯芽培養(yǎng)基指的是：MS+1. 0mg/LKT+1.Omg/LGA+0. 2mg/L NAA+2. 0mg/L6-BA; (5) 生根培養(yǎng)： 將健壯、濃綠的不定芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中誘導生根，約4周后不定芽長出數(shù)條實生 根，形成完整的試管苗； 所述的生根培養(yǎng)指的是不加激素的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基； (6) 試管苗經(jīng)過室內(nèi)和田間拱棚中兩次練苗，冬前移栽到土壤中，翌年在第一代收獲再 生地下鱗莖.把愈傷組織誘導的苗種植到大田土壤中，地上部分長苗，地下部分膨大形成 蒜頭--即地下鱗莖，由于愈傷組織苗為再生苗，所以由再生苗長成的蒜頭即為地下再生 鱗莖。
[0006] 所述的兩次練苗指的是：第一次練苗將培養(yǎng)瓶的蓋子打開，在培養(yǎng)室中練苗培養(yǎng) 一周；第二次練苗指的是將經(jīng)過第一次練苗后的試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗去根部培養(yǎng)基， 剪掉枯黃的葉子，移栽至裝有滅菌的珍珠巖、蛭石和泥炭土（ 1:3:6)的培養(yǎng)缽中，在10月初 放置田間小拱棚中，晴好天氣揭開小拱棚的薄膜通風，約30d后，試管苗再次長出新根數(shù) 條，這時第二次練苗結(jié)束，可以進行大田移栽；越冬前移栽到土壤中指的是：1〇月底，日平 均氣溫KTC以上的時候，把經(jīng)過兩次練苗的試管苗移栽到大田中，這里的土壤沒有其它別 要求，只要是一般的土壤就行。
[0007] 本發(fā)明更進一步公開了以鱗莖片為外植體構(gòu)建大蒜微繁方法在提高試管苗誘導 率方面的應(yīng)用。實驗結(jié)果顯示：本發(fā)明的方法為組培苗生根打下基礎(chǔ)，提高了試管苗的誘導 率。
[0008] 本發(fā)明更加詳細的描述如下： 一、試管苗的誘導培養(yǎng)體系 1、外植體的獲得 供試材料為天津?qū)氎媪昙t大蒜satiras?L.):選取生長健壯、無病蟲害、自 然結(jié)束休眠后的大蒜蒜頭，剝?nèi)ネ饷骥[葉，選取個大、飽滿、無病斑的大蒜蒜瓣，用自來水沖 洗20min,用濾紙吸干大蒜瓣表面的水分,用0. 1%升萊浸泡IOmin,無菌水沖洗3次,用濾紙 將大蒜表面的水分擦干，再在75%酒精中浸泡5min，殺滅表面細菌，無菌水沖洗3次，再用濾 紙吸干備用。
[0009] 、大蒜愈傷組織誘導 在超凈臺上將大蒜鱗莖切2mm厚薄片，接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基（MS+1.5mg/L2,4-D+0. 5mg/LKT)中，置人工氣候箱中培養(yǎng)：日溫25°C，夜溫20°C，光照強度為1500 Lux，光照時間14h/d。6天后外植體表面結(jié)構(gòu)變得疏松，四周組織逐漸變得水潤且呈現(xiàn)淺 黃色。接種14天后在外植體上形成微小的愈傷組織顆粒，接種25-30天后外植體上已經(jīng)形 成大量的愈傷組織顆粒（圖1)。觀察、統(tǒng)計愈傷組織誘導率。大約4周左右全部外植體均可 誘導出愈傷組織。
[0010] 、愈傷組織繼代及不定芽分化 將生長旺盛的淺黃色愈傷組織（圖2a)切下，接種到新鮮的繼代培養(yǎng)基（同愈傷組織誘 導培養(yǎng)基)中進行繼代培養(yǎng)（圖2b)，25天之后愈傷組織增殖明顯，顆粒飽滿有光澤（圖2c)， 在同樣培養(yǎng)基上再繼代一次。挑選生長狀況良好的愈傷組織顆粒轉(zhuǎn)移到不定芽分化的培養(yǎng) 基（MS+5mg/L6-BA+1.0mg/LNAA)上進行分化培養(yǎng)（圖2d)，經(jīng)過10天左右的分化培養(yǎng)，在 愈傷組織表面長出許多綠點和小綠芽（圖2e)，隨后逐漸分化出一定數(shù)目、生長健壯、顏色 濃綠的不定芽（圖2f-i) 4、壯芽培養(yǎng) 為了提高分化培養(yǎng)基分化出來的不定芽的利用率，本發(fā)明中增加了壯芽培養(yǎng)階段。將 分化培養(yǎng)基中誘導出來的帶綠點愈傷組織和嫩芽一起轉(zhuǎn)移到壯芽培養(yǎng)基(MS+1. 0mg/L KT+l.Omg/LGA+0.2mg/LNAA+2.0mg/L6-BA)中進行壯芽培養(yǎng)（圖3a)，經(jīng)過一段時間培 養(yǎng)，綠點也逐漸長成不定芽，原有的不定芽變健壯（圖3b、c)，經(jīng)過30d左右的培養(yǎng)，不定芽 已經(jīng)生長成健壯、濃綠的組培苗，可以用于生根培養(yǎng)，提高了試管苗的誘導率。
[0011] 、不同激素配比對試管苗生根的影響 實生根的誘導對不定芽是否能形成完整植株起著至關(guān)重要的作用。本發(fā)明設(shè)置了三套 生根培養(yǎng)基，配比如下：培養(yǎng)基（I)MS;培養(yǎng)基（2)MS+2.Omg/LNAA;培養(yǎng)基（3)MS+0. 5mg/L NAA+1.Omg/L6-BA。從圖4中可以看出，將試管苗接種到3種生根培養(yǎng)基中，8天左右均可 以長出2-3條實生根，20天左右能長出8-10天實生根，當培養(yǎng)天數(shù)達到30天左右時，實生 根的條數(shù)明顯增多，根系變得粗壯。不同的是當試管苗在生根培養(yǎng)基培養(yǎng)40d約6周后，培 養(yǎng)基1的生根率可達90%以上；生根培養(yǎng)基2的生根率為63. 3%，但有小鱗莖形成；而生根 培養(yǎng)基3的生根率僅為30%左右。因此，基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基是高效、經(jīng)濟且快速誘導生根培養(yǎng) 基。
[0012] 二、試管苗移栽及管理 1、 試管苗的練苗及移栽 組培苗雖然具有一定的光合能力，處于高濕、弱光、低CO2、恒溫、異養(yǎng)條件下生長，其組 織分化不完善，光合自養(yǎng)能力弱，適應(yīng)性差，氣孔多而且不易關(guān)閉、葉綠素少、根毛少，煉苗 過程為逐步改變其生長條件、逐步促使其組織發(fā)育完全，以適應(yīng)外界環(huán)境生活，使其葉綠素 增多，改善氣孔