一種鹿角蕨組培快繁的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及植物生物技術中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說，涉及一種鹿角蕨組培快繁的方法。
【背景技術】
[0002]蕨類植物起源于古生代志留紀和泥盆紀的裸蕨，全世界約有12000多種。其生活史中有兩個能獨立生活的植物體即孢子體和配子體，孢子體世代和配子體世代在蕨類植物生活史中交替出現(xiàn)，孢子體世代在蕨類植物的生活史中占有較大優(yōu)勢。蕨類植物對水、熱條件極為敏感，且多數(shù)為陰生植物和附生植物，大部分類群需要森林植被為其提供生存的環(huán)境。中國由于森林生態(tài)系統(tǒng)類型多樣，因而蕨類植物類群齊全，種類豐富。蕨類植物具有較高的藥用價值，寫信類黃酮、萜類、酚酸等多種結(jié)構(gòu)類型的植物化學成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗HIV、抗氧化、抑菌、保肝、促進骨愈合等藥理活性。此外，蕨類已成為觀賞植物中的重要組成部分，在室內(nèi)園藝、公園、庭院等環(huán)境的綠化、插花和工藝品制作等園林園藝事業(yè)中占據(jù)相當重要的地位，觀賞蕨類的商品生產(chǎn)和栽培育種事業(yè)也相當發(fā)達，蘊藏著很大的開發(fā)潛力。
[0003]鹿角蕨為鹿角蕨科鹿角蕨屬植物，為熱帶季雨林中的附生植物，其葉形別致，形似梅花鹿角，姿態(tài)高雅，別具熱帶情趣，是室內(nèi)立體綠化的首選植物。由于鹿角蕨觀賞期長和管理方便等優(yōu)點，目前國際上將其作為盆栽觀葉植物應用普遍，而我國才剛剛進入開發(fā)利用階段，對鹿角蕨的研究處于起步階段，實驗室組培方面的研究也不夠系統(tǒng)完善。研究表明，鹿角蕨從孢子播種開始，直至長出孢子體的時間大致為:孢子萌發(fā)需20天；由孢子長出原葉體需要50天以上；幼孢子體形成則需半年以上，而本發(fā)明建立鹿角蕨的離體再生體系，相對以孢子開始的途徑大大縮短了生長周期，為鹿角蕨走向商品化生產(chǎn)開辟了途徑，對觀賞蕨類的組織培養(yǎng)具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供出一種鹿角蕨組培快繁的方法，本發(fā)明以鹿角蕨細嫩孢子葉為外植體,經(jīng)過外植體消毒、GGB誘導、增殖、分化、生根等過程建立了鹿角蕨離體組培快繁方法，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0005]本發(fā)明的一種鹿角蕨組培快繁的方法，包括以下的步驟:
1、一種鹿角蕨組培快繁的方法，其特征在于包括以下步驟:
(I)外植體消毒:選取健壯鹿角蕨的孢子葉新長出的嫩葉，用0.1%?0.3%高錳酸鉀溶液浸泡10?30min，無菌水沖洗3?5次后用70%?80%乙醇浸泡10?20s，用無菌水清洗3?5次后用0.1%升汞溶液消毒I?5min，再用無菌水清洗3?5次后備用。
[0006](2)誘導培養(yǎng):用解剖刀在經(jīng)步驟(I)處理后孢子葉表面進行輕微劃傷處理并正面朝上接種于誘導培養(yǎng)基中進行GGB誘導。接種后置于每天光照12?16小時，光照強度為1500?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至形成GGB。
[0007](3)增殖培養(yǎng):將步驟(2)的獲得的GGB接種到增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)。接種后置于每天光照12?16小時，光照強度為2000?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)，每兩周更換一次培養(yǎng)基。
[0008](4) GGB分化培養(yǎng):將步驟(I)或(2)獲得的GGB轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中進行GGB分化培養(yǎng)。接種后置于每天光照12?16小時，光照強度為2000?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)。接種后每兩周更換一次培養(yǎng)基。
(5)生根培養(yǎng):當經(jīng)步驟(4)培養(yǎng)鹿角蕨孢子葉伸展，并由最初的長條狀長出鹿角且長度約為1.5?2.5cm時轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)中進行誘導生根。
[0009]上述步驟(2)所述的誘導培養(yǎng)基為:MS+1.0?4.0mg/L6_BA+l.0?5.0mg/LNAA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0010]上述步驟(3)所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+1.0?3.0mg/LKT+0.1?lmg/LNAA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0011]上述步驟(4)所述的分化培養(yǎng)基為:MS+0.5?1.5mg/L6-BA+0.1?0.5mg/LIBA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0012]上述步驟(5)所述的生根培養(yǎng)基為:MS+0.1?1.0mg/L ΝΑΑ+0.1?0.5mg/LIBA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0013]與現(xiàn)有技術相比本發(fā)明的優(yōu)點是:通過植物組織培養(yǎng)技術在短時間內(nèi)獲得鹿角蕨試管苗的方法。以鹿角蕨細嫩孢子葉為外植體，經(jīng)過外植體消毒、GGB誘導、增殖、分化、生根等過程建立了鹿角蕨離體組培快繁方法，以達到縮短生長周期，緩解鹿角蕨商業(yè)化生產(chǎn)種苗缺乏的現(xiàn)狀，并為今后創(chuàng)新蕨類植物的種質(zhì)資源奠定基礎。
【具體實施方式】
[0014]以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，不是對本發(fā)明的限制。
[0015]實施例1:
(I)外植體消毒:選取健壯鹿角蕨的孢子葉新長出的嫩葉，用0.1%高錳酸鉀溶液浸泡lOmin，無菌水沖洗4次后用75%乙醇浸泡10s，用無菌水清洗3次后用0.1%升汞溶液消毒3min,再用無菌水清洗5次后備用。
[0016](2)誘導培養(yǎng):用解剖刀在經(jīng)步驟(I)處理后孢子葉表面進行輕微劃傷處理并正面朝上接種于誘導培養(yǎng)基中進行GGB誘導。接種后置于每天光照14小時，光照強度為15001x，培養(yǎng)溫度為25°C的條件下培養(yǎng)20天后大部分外植體上長出棕褐色的根毛，接著根毛基部膨大長出嫩綠色GGB，待GGB長到一定大小時，幼嫩孢子葉開始白化或黃化，并被新長出的GGB覆蓋。所述的誘導培養(yǎng)基為:MS+2.0mg/L6-BA+l.0mg/L NAA+3.5%蔗糖+0.5%瓊脂，pH值為5.6。
[0017](3)增殖培養(yǎng):將步驟(2)的獲得的GGB接種到增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)。接種后置于每天光照15小時，光照強度為25001x，培養(yǎng)溫度為25°C的條件下培養(yǎng)30天后GGB明顯增大，平均直徑可達到0.8cm左右，每兩周更換一次培養(yǎng)基。所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+1.0mg/LKT+0.lmg/L NAA+3.5% 蔗糖 +0.35% 瓊脂，pH 值為 5.6。
[0018](4) GGB分化培養(yǎng):將步驟(I)或(2)獲得的GGB轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中進行GGB分化培養(yǎng)。接種后置于每天光照14小時，光照強度為20001χ，培養(yǎng)溫度為25°C的條件下培養(yǎng)30天即可分化出不定芽，分化率達93%。接種后每兩周更換一次培養(yǎng)基。所述的分化培養(yǎng)基為:MS+0.5mg/L6-BA+0.lmg/L IBA+2.0% 蔗糖 +0.35% 瓊脂，pH 值為 5.6。
[0019](5)生根培養(yǎng):當經(jīng)步驟(4)培養(yǎng)鹿角蕨孢子葉伸展，并由最初的長條狀長出鹿角且長度約為1.5?2.5cm時轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)中進行誘導生根，培養(yǎng)20天后即可達到生根率96%以上。所述的生根培養(yǎng)基為:MS+0.lmg/L NAA+0.lmg/L IBA+3.5%蔗糖+0.35%瓊脂，pH值為5.6。
[0020]實施例2:
(I)外植體消毒:選取健壯鹿角蕨的孢子葉新長出的嫩葉，用0.2%高錳酸鉀溶液浸泡12min，無菌水沖洗5次后用78%乙醇浸泡11s，用無菌水清洗4次后用0.1%升汞溶液消毒5min,再用無菌水清洗5次后備用。
[0021](2)誘導培養(yǎng):用解剖刀在經(jīng)步驟(I)處理后孢子葉表面進行輕微劃傷處理并正面朝上接種于誘導培養(yǎng)基中進行GGB誘導。接種后置于每天光照15小時，光照強度為20001x，培養(yǎng)溫度為26°C的條件下培養(yǎng)23天后大部分外植體上長出棕褐色的根毛，接著根毛基部膨大長出嫩綠色GGB，待GGB長到一定大小時，幼嫩孢子葉開始白化或黃化，并被新長出的GGB覆蓋。所述的誘導培養(yǎng)基為:MS+2.5mg/L6-BA+l.2mg/L NAA+3.8%蔗糖+0.4%瓊脂，pH值為5.7。
[0022](3)增殖培養(yǎng):將步驟(2)的獲得的GGB接種到增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)。接種后置于每天光照16小時，光照強度為25001x，培養(yǎng)溫度為26°C的條件下培養(yǎng)30天后GGB明顯增大，平均直徑可達到0.8cm左右，每兩周更換一次培養(yǎng)基。所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+1.5mg/LKT+0.lmg/L NAA+3.5% 蔗糖 +0.4% 瓊脂，pH 值為 5.7。
[0023](4) GGB分化培養(yǎng):將步驟(I)或(2)獲得的GGB轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中進行GGB分化培養(yǎng)。接種后置于每天光照15小時，光照強度為25001x，培養(yǎng)溫度為26°C的條件下培養(yǎng)34天即可分化出不定芽，分化率達96%。接種后每兩周更換一次培養(yǎng)基。所述的分化培養(yǎng)基為:MS+0.9mg/L6-BA+0.2mg/L IBA+2.5% 蔗糖 +0.35% 瓊脂，pH 值為 5.7。
[0024](5)生根培養(yǎng):當經(jīng)步驟(4)培養(yǎng)鹿角蕨孢子葉伸展，并由最初的長條狀長出鹿角且長度約為1.5?2.5cm時轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)中進行誘導生根，培養(yǎng)23天后即可達到生根率94%以上。所述的生根培養(yǎng)基為:MS+0.5mg/L NAA+0.12mg/L IBA+3.5%蔗糖+0.35%瓊脂，pH值為5.6。
【主權(quán)項】
1.一種鹿角蕨組培快繁的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)外植體消毒:選取健壯鹿角蕨的孢子葉新長出的嫩葉，用0.1%?0.3%高錳酸鉀溶液浸泡10?30min，無菌水沖洗3?5次后用70%?80%乙醇浸泡10?20s，用無菌水清洗3?5次后用0.1%升汞溶液消毒I?5min，再用無菌水清洗3?5次后備用； (2)誘導培養(yǎng):用解剖刀在經(jīng)步驟(I)處理后孢子葉表面進行輕微劃傷處理并正面朝上接種于誘導培養(yǎng)基中進行GGB誘導，接種后置于每天光照12?16小時，光照強度為1500?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至形成GGB; (3)增殖培養(yǎng):將步驟(2)的獲得的GGB接種到增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，接種后置于每天光照12?16小時，光照強度為2000?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)，每兩周更換一次培養(yǎng)基； (4)GGB分化培養(yǎng):將步驟(I)或(2)獲得的GGB轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中進行GGB分化培養(yǎng)，接種后置于每天光照12?16小時，光照強度為2000?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)，接種后每兩周更換一次培養(yǎng)基； (5)生根培養(yǎng):當經(jīng)步驟(4)培養(yǎng)鹿角蕨孢子葉伸展，并由最初的長條狀長出鹿角且長度約為1.5?2.5cm時轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)中進行誘導生根。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鹿角蕨組培快繁的方法，其特征在于步驟(2)所述的誘導培養(yǎng)基為:MS+1.0 ?4.0mg/L6-BA+l.0 ?5.0mg/L NAA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5%瓊脂，pH值為5.4?5.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鹿角蕨組培快繁的方法，其特征在于步驟(3)所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+1.0 ?3.0mg/LKT+0.1 ?lmg/L NAA+2.0% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊月旨，pH值為5.4?5.8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鹿角蕨組培快繁的方法，其特征在于步驟(4)所述的分化培養(yǎng)基為:MS+0.5 ?1.5mg/L6-BA+0.1 ?0.5mg/L IBA+2.0% ?3.5%蔗糖 +0.35% ?0.5%瓊脂，pH值為5.4?5.8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鹿角蕨組培快繁的方法，其特征在于步驟(5)所述的生根培養(yǎng)基為:MS+0.1 ?1.0mg/L ΝΑΑ+0.1 ?0.5mg/L IBA+2.0% ?3.5%蔗糖 +0.35% ?0.5%瓊脂，pH值為5.4?5.8。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鹿角蕨組培快繁的方法，涉及鹿角蕨（Platycerium wallichii）通過植物組織培養(yǎng)技術在短時間內(nèi)獲得鹿角蕨試管苗的方法。本發(fā)明以鹿角蕨細嫩孢子葉為外植體，經(jīng)過外植體消毒、GGB誘導、增殖、分化、生根等過程建立了鹿角蕨離體組培快繁方法，以達到縮短生長周期，緩解鹿角蕨商業(yè)化生產(chǎn)種苗缺乏的現(xiàn)狀，并為今后創(chuàng)新蕨類植物的種質(zhì)資源奠定基礎。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號】CN104663442
【申請?zhí)枴緾N201510087218
【發(fā)明人】楊惠才
【申請人】楊惠才
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年2月25日