一種紅花釣鐘柳的離體快速繁殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說，涉及一種紅花釣鐘柳的離體快速繁殖方法。
【背景技術(shù)】
[0002]釣鐘柳是玄參科釣鐘柳屬植物的俗稱，多數(shù)為多年生草本，少數(shù)是一年生草本。釣鐘柳花色豐富，花型多變，具有其獨(dú)特的觀賞品質(zhì)，它們以廣泛的適應(yīng)性、豐富的自然色彩和多變的花形著稱。因此，釣鐘柳屬植物被廣泛應(yīng)用于園林綠化，是優(yōu)秀的園林觀賞植物。現(xiàn)已被廣泛引種于我國北京、上海、邯鄲、杭州、張家港等許多地區(qū)。釣鐘柳幾乎全株都可藥用，富含了環(huán)稀醚萜苷、苯乙醇苷、生物堿等多種化合物，其中，松果菊苷是目前人們在釣鐘柳中發(fā)現(xiàn)的具有較高藥用價值的化合物之一，其具有抗菌消炎、抗氧化等作用。
[0003]紅花釣鐘柳又名草本象牙紅、五蕊花。由于色彩艷麗，花型多變，具有極高的觀賞價值，是優(yōu)秀的園林花卉材料，被廣泛引種于我國各大城市。紅花釣鐘柳所含松果菊苷具有抗腫瘤、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)與肝臟、提高記憶力和免疫力等藥理作用，在治療老年癡呆癥和心腦血管疾病等方面療效突出。紅花釣鐘柳可通過播種、分株、扦插等方式進(jìn)行繁殖。紅花釣鐘柳原始種多用種子繁殖。種子細(xì)小，且具有休眠性，播種發(fā)芽緩慢。目前關(guān)于釣鐘柳的組培繁殖研究較少，有關(guān)紅花釣鐘柳的組織培養(yǎng)研究幾乎沒有。一種成熟的組織培養(yǎng)技術(shù)不僅能快速高效地提供大量優(yōu)良苗木，還可為后期通過基因工程于段引入目的基因，增加紅花釣鐘柳次生代謝產(chǎn)物含量奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供出一種紅花釣鐘柳的離體快速繁殖方法，本發(fā)明以紅花釣鐘柳帶芽莖段為外植體，經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根誘導(dǎo)、煉苗及移栽等過程建立了紅花釣鐘柳組培快繁體系，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0005]本發(fā)明的一種紅花釣鐘柳的離體快速繁殖方法，包括以下的步驟:
(I)叢生芽誘導(dǎo):選取健壯紅花釣鐘柳植株一年生木質(zhì)化帶芽莖段作為外植體，剪去葉片，切成3.0?5.0cm長的帶有2?3個腋芽的節(jié)段先用0.2%高錳酸鉀溶液浸泡I?3h，再用軟毛刷輕輕刷洗外植體表面將其表面的塵土和部分菌體去除，然后用自來水沖洗I?3h后置于超凈工作臺中，先用75%乙醇消毒5?30s后用無菌水洗3?5次,再用0.1%升萊溶液消毒5?15min,用無菌水沖洗4?6次再用無菌濾紙擦干表面的水珠后接種到啟動培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)I?5天，然后置于每天光照10?12小時，光照強(qiáng)度為1500?30001x，直至誘導(dǎo)形成叢生芽。
[0006](2)繼代培養(yǎng):將誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的叢生芽切割成單個芽并豎直向接種于增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)I?3天，然后置于每天光照12?14小時，光照強(qiáng)度為2000?30001x，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)，多次反復(fù)切割進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以得到更多的叢生芽。
[0007](3)生根誘導(dǎo):將步驟(I)或(2)過程獲得的高度約為1.5?2.5cm的叢生芽芽分切接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)I?3天，然后置于每天光照12?15小時，光照強(qiáng)度為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)至生根。
[0008](4)煉苗移栽:將步驟(3)獲得的高4cm以上的根系發(fā)達(dá)的試管苗培養(yǎng)瓶移出培養(yǎng)室，在室內(nèi)放置3?5天后逐漸打開瓶蓋于自然光照下煉苗5?7天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，栽入盛有田間土壤的營養(yǎng)杯中，以塑料薄膜覆蓋5?10天后揭去，30天后統(tǒng)計(jì)成活率。
[0009]上述步驟(I)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+1?3mg/L6-BA+0.01?0.5mg/LNAA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0010]上述步驟(2)所述的增殖培養(yǎng)基為MS+0.01?0.5mg/LNAA+l?3mg/L 6-BA+15?30g/L 鹿糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0011]上述步驟(3)所述的生根培養(yǎng)基為:1/2MS+0.1?lmg/L NAA+0.1?lmg/LIBA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)，快速離體繁殖紅花釣鐘柳barbatus(Can.)Roth),以克服傳統(tǒng)繁殖技術(shù)存在的周期長、效率低等問題。本發(fā)明以紅花釣鐘柳帶芽莖段為外植體，經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根誘導(dǎo)、煉苗及移栽等過程建立了紅花釣鐘柳組培快繁體系，為其規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支持，并為進(jìn)一步通過基因工程手段提高紅花釣鐘柳中松果菊苷含量奠定基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0013]以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對本發(fā)明的限制。
[0014]實(shí)施例1:
(I)叢生芽誘導(dǎo):選取健壯紅花釣鐘柳植株一年生木質(zhì)化帶芽莖段作為外植體，剪去葉片，切成3.0?5.0cm長的帶有2?3個腋芽的節(jié)段先用0.2%高錳酸鉀溶液浸泡lh，再用軟毛刷輕輕刷洗外植體表面將其表面的塵土和部分菌體去除，然后用自來水沖洗Ih后置于超凈工作臺中，先用75%乙醇消毒15s后用無菌水洗3次，再用0.1%升汞溶液消毒5min，用無菌水沖洗4次再用無菌濾紙擦干表面的水珠后接種到啟動培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)I天，然后置于每天光照10小時，光照強(qiáng)度為25001x條件下培養(yǎng)30天即可形成叢生芽，誘導(dǎo)率100%，繁殖系數(shù)達(dá)9.8。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+lmg/L6-BA+0.0 lmg/L NAA+15g/L 蔗糖 +3.5g/L 瓊脂，pH 為 5.4。
[0015](2)繼代培養(yǎng):將誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的叢生芽切割成單個芽并豎直向接種于增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)I天，然后置于每天光照12小時，光照強(qiáng)度為20001x，置于培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)30天，增殖系數(shù)為6.7，叢生芽生長良好。多次反復(fù)切割進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以得到更多的叢生芽。所述的增殖培養(yǎng)基為MS+0.0lmg/LNAA+2mg/L 6_BA+15g/L 蔗糖 +3.5g/L 瓊脂，pH 為 5.4。
[0016](3)生根誘導(dǎo):將步驟(I)或(2)過程獲得的高度約為1.5?2.5cm的叢生芽芽分切接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，接