一種花魔芋組織培養(yǎng)快繁體系的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說，涉及一種花魔芋組織培養(yǎng)快繁體系的建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]魔n Amorphopha 11 u s j'ac)是屬天南星科魔芋屬多年生草本植物,在我國主要分布于四川、云南、陜西、寧夏、甘肅等地，且以花魔芋為主要的栽培種且分布最為廣泛，遍布于秦嶺以南的所有山區(qū)和丘陵地帶。魔芋球莖內(nèi)富含的葡甘聚糖，具膠溶性、凝膠性、成膜性及與其它植物膠的優(yōu)良復(fù)配性等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于食品和保健方面，具有降血月旨、降血糖、抗癌、美容、減肥等功效。
[0003]近年來魔芋的栽培面積不斷擴(kuò)大，用種量不斷攀，但魔芋作為一種半野生植物，自然繁殖率極低，具商品價(jià)值的器官形成周期長，種芋退化嚴(yán)重，容易受到多種病蟲的侵害且缺乏抗病品種和針對(duì)性藥物防治，使得魔芋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受到制約。近年來，由于魔芋用途的不斷發(fā)掘，其市場需求量日益增加，使得魔芋繁殖系數(shù)低與用種量卻逐年上升的矛盾日益尖銳，采用組織培養(yǎng)快速繁殖可以較好地解決這一問題。但魔芋的組培快繁技術(shù)還不是很成熟，還受到污染嚴(yán)重、外植體褐變、誘導(dǎo)率和分化率低等問題的困擾，而使用本發(fā)明的技術(shù)能很好地解決了這些問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種花魔芋組織培養(yǎng)快繁體系的建立方法，本發(fā)明以魔芋地下塊莖為外植體，通過愈傷組織誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)、叢生芽誘導(dǎo)、試管苗生根以及試管苗馴化移栽等階段實(shí)現(xiàn)了花魔芋的組織培養(yǎng)快速繁殖，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0005]本發(fā)明的一種花魔芋組織培養(yǎng)快繁體系的建立方法，包括以下的工藝步驟:
(I)愈傷組織誘導(dǎo):選取生長健壯的花魔芋種芋，先用清水洗凈，用毛筆將主芽附近刷洗干凈、晾干，然后切取帶芽的頂心塊(2cmX 2cmX 2cm)，并將其表皮刮洗干凈，放在干凈的陶瓷紅中，并在瓷紅上蓋一層紗布，在自來水下沖洗I?3h，先在75%?80%的乙醇中浸泡3?1s,用無菌水沖洗3?5次,每次3?8min,然后用0.1%?0.5%的升萊溶液消毒5?1min,再用洗菌水沖洗3?5次,每次3?8min。用無菌濾紙吸干種芋表面水珠后切去表層I?2mm,然后切成0.5cmX0.5cmX0.5cm小塊并在50?100mg/L的朽1檬酸中浸泡I?5s后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)7?14天，然后置于每天光照12?15小時(shí)，光照強(qiáng)度為1500?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至形成愈傷組織。
[0006](2)繼代培養(yǎng):將步驟(I)誘導(dǎo)得到的愈傷組織切成0.5cm3大小的小塊后轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)3?5天，然后置于每天光照12?15小時(shí)，光照強(qiáng)度為1500?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)，30?40天轉(zhuǎn)接一次。
[0007](3)分化培養(yǎng):將步驟(I)或(2)得到的愈傷組織切成0.5cm3大小的小塊后轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)I?3天，然后置于每天光照12?15小時(shí)，光照強(qiáng)度為1500?25001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至形成不定芽。
[0008](4)試管苗生根:將步驟(3)得到的長至2?4cm的不定芽分切接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)生根，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)I?4天，然后置于每天光照12?15小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)至生根。
[0009](5)煉苗移栽:將長至6?8cm的生根試管苗移栽到經(jīng)過消毒(800倍多菌靈液澆透培養(yǎng)基質(zhì))的培養(yǎng)盤中，盤中基質(zhì)為蛭石:珍珠巖=2:1。在培養(yǎng)盤上用保鮮膜覆蓋以保持濕度和隔離細(xì)菌，放到自然光下煉苗，切勿在強(qiáng)光下暴曬，保持濕度在90%以上，每隔2?5天就在保鮮膜上戳2?3個(gè)直徑Icm左右的洞，使組培苗漸漸適應(yīng)外界環(huán)境，2周后將保鮮膜除去。
[0010]上述步驟(I)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+5?10mg/L TDZ+1?3mg/L NAA+2.5%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
[0011]上述步驟(2)所述的增殖培養(yǎng)基為MS+1?5mg/L TDZ+5?15mg/L NAA+2.5%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
[0012]上述步驟(3)所述的分化培養(yǎng)基為:MS+6?15mg/L TDZ+1?3mg/L IBA+2.5%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
[0013]上述步驟(4)所述的生根培養(yǎng)基為:l/2MS+3?8mg/L NAA+2.5%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:通過組織培養(yǎng)技術(shù)手段采用少量的組織或器官作為材料在短時(shí)間內(nèi)快速繁殖保持親本原有優(yōu)良性狀種苗的方法。以魔芋地下塊莖為外植體，通過愈傷組織誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)、叢生芽誘導(dǎo)、試管苗生根以及試管苗馴化移栽等階段實(shí)現(xiàn)了花魔芋的組織培養(yǎng)快速繁殖，從而解決花魔芋用種和種苗短缺的問題，還可以培育花魔芋脫毒苗和對(duì)品種進(jìn)行提純復(fù)壯，促進(jìn)花魔芋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0016]實(shí)施例1:
(I)愈傷組織誘導(dǎo):選取生長健壯的花魔芋種芋，先用清水洗凈，用毛筆將主芽附近刷洗干凈、晾干，然后切取帶芽的頂心塊(2cmX 2cmX 2cm)，并將其表皮刮洗干凈，放在干凈的陶瓷紅中，并在瓷紅上蓋一層紗布，在自來水下沖洗lh，先在75%的乙醇中浸泡5s，用無菌水沖洗3次，每次3min,然后用0.1%的升汞溶液消毒5min,再用洗菌水沖洗3次，每次3min。用無菌濾紙吸干種芋表面水珠后切去表層Imm,然后切成0.5cmX0.5cmX0.5cm小塊并在70mg/L的檸檬酸中浸泡2s后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)7天，然后置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為15001x，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)28天后即形成愈傷組織，污染率低至7%，褐變率僅為5.7%，誘導(dǎo)率為87.3%。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 MS+6mg/L TDZ+lmg/L NAA+3.5% 蔗糖 +0.35% 瓊脂 +0.05% 活性炭，PH值為5.4。
[0017](2)繼代培養(yǎng):將步驟(I)誘導(dǎo)得到的愈傷組織切成0.5cm3大小的小塊后轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)3天，然后置于每天光照13小時(shí)，光照強(qiáng)度為15001x，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)27天即可繼代一次，增殖的愈傷組織結(jié)構(gòu)致密，顏色呈淺紅色，相對(duì)生長速率達(dá)至0.289g/d。所述的增殖培養(yǎng)基為MS+3mg/L TDZ+9mg/L NAA+2.5% 蔗糖 +0.35% 瓊脂 +0.05% 活性炭，pH 值為 5.4。
[0018](3)分化培養(yǎng):將步驟(I)或(2)得到的愈傷組織切成0.5cm3大小的小塊后轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)I天，然后置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為15001x，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)25天即可形成不定芽，分化率達(dá)到147.6%，分化得到的不定芽比較粗壯，生良好。所述的分化培養(yǎng)基為:MS+12mg/LTDZ+lmg/L IBA+3.5% 蔗糖 +0.40% 瓊脂 +0.1% 活性炭，pH 值為 5.4。
[0019](4)試管苗生根:將步驟(3)得到的長至2?4cm的不定芽分切接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)生根，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)I天，然后置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為20001x，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)至生根，生根率達(dá)100%，生根數(shù)量多且較粗壯。所述的生根培養(yǎng)