提高蘋果無菌苗葉片出愈率和出芽率的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提高蘋果無菌苗葉片出愈率和出芽率的方法。
【背景技術】
[0002]使用傳統(tǒng)方法進行切割每個蘋果葉片僅能獲得I個外植體，若想獲得2個以上的外植體，采用傳統(tǒng)方法切割的外植體由于太小很難成活。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種葉片的出愈率和出芽率高的提高蘋果無菌苗葉片出愈率和出芽率的方法。
[0004]本發(fā)明的技術解決方案是:
一種提高蘋果無菌苗葉片出愈率和出芽率的方法，其特征是:依次包括下列步驟:
(1)蘋果莖尖的消毒和滅菌
取春季取剛萌動的蘋果新梢，用流動的自來水沖洗干凈后，剝取莖尖，用75%的酒精消毒30~40s，再用無菌水沖洗干凈，然后用0.1 %的升未消毒3~4 min，再用無菌水沖洗3~4遍，用無菌濾紙吸去多余水分后接種；
(2)蘋果無菌苗的獲得
每個10ml的培養(yǎng)瓶接種5~7個蘋果莖尖，培養(yǎng)條件為每天光照12 h，光照強度2000lx，培養(yǎng)溫度26°C ;培養(yǎng)30d后獲得5~6cm高的蘋果無菌苗；
(3)蘋果無菌苗葉片的切割
取上述蘋果無菌苗充分展開的葉片，在垂直主脈方向兩側各切2~3刀，不切透葉緣和主脈并保持葉片完整，葉片反面朝上平鋪在分化培養(yǎng)基上；分化培養(yǎng)基組成是:MS+6-BA4.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7 g/L，pH 為 5.8 ;
(4)蘋果葉片愈傷組織和芽的誘導
經步驟(3)蘋果無菌苗葉片接種1d后，葉片顏色仍為綠色，稍膨大，葉片切口邊緣處翹起，多數(shù)葉片在切口處形成少量白色或淡綠色的愈傷組織，愈傷組織結構較疏松；隨著培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織逐漸膨大變多，20d后蘋果葉片開始分化形成大量不定芽；
(5)生根培養(yǎng)
待幼芽長到2~3cm大小時，在超凈工作臺上切下幼芽，將切取的幼芽轉入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)；生根培養(yǎng)基為:1/2MS+IBA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7 g/L, pH為5.8。
[0005]蘋果品種為“魯加6號”。
[0006]本發(fā)明處理方法可以使蘋果無菌苗的每個葉片保持完整，每個葉片靠近主脈中央有4~8個切口，不僅增加了蘋果葉片外植體的存活率，而且也明顯提高了葉片的出愈率和出芽率。由于蘋果無菌苗葉片較小，使用傳統(tǒng)方法進行切割每個蘋果葉片僅能獲得I個外植體，若想獲得2個以上的外植體，采用傳統(tǒng)方法切割的外植體由于太小很難成活。與傳統(tǒng)切割方法比較，本發(fā)明每個蘋果無菌苗葉片上至少有4個切口，最高可達8個切口，相對傳統(tǒng)切割方法的2個切口，該法使每個葉片保持完整性明顯提高了葉片的成活率，而且切口總長度相對增加2~4倍，促使每個葉片的出愈率和出芽率比傳統(tǒng)方法至少提高2~4倍。
[0007]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
【具體實施方式】
[0008]一種提高蘋果無菌苗葉片出愈率和出芽率的方法，依次包括下列步驟:
(I)蘋果莖尖的消毒和滅菌
蘋果品種為“魯加6號”。取春季取剛萌動的蘋果新梢，用流動的自來水沖洗干凈后，小心剝取莖尖，用75%的酒精消毒30~40 S，再用無菌水沖洗干凈，然后用0.1 %的升汞消毒3-4 min,最后用無菌水沖洗3~4遍，用無菌濾紙吸去多余水分后接種。
[0009](2)蘋果無菌苗的獲得
每個10ml的培養(yǎng)瓶接種5~7個蘋果莖尖，培養(yǎng)條件為每天光照12 h，光照強度2 000lx，培養(yǎng)溫度26°C。培養(yǎng)30d后獲得5~6cm高的蘋果無菌苗。
[0010](3)蘋果無菌苗葉片的切割
取上述蘋果無菌苗充分展開的葉片，在垂直主脈方向兩側各切2~3刀，注意不要切透葉緣和主脈并保持葉片完整，葉片反面朝上平鋪在分化培養(yǎng)基上(即接種培養(yǎng))，分化培養(yǎng)基組成是:MS+6-BA 4.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7 g/L, pH 為 5.8。
[0011](4)蘋果葉片愈傷組織和芽的誘導
蘋果無菌苗葉片接種1d后，葉片顏色仍為綠色，稍微膨大，葉片切口邊緣處翹起，多數(shù)葉片在切口處形成少量白色或淡綠色的愈傷組織，愈傷組織結構較疏松；隨著培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織逐漸膨大變多，20 d后蘋果葉片開始分化形成大量不定芽。
[0012](5)生根培養(yǎng)
待幼芽長到2~3cm大小時，在超凈工作臺上切下幼芽，盡量將愈傷組織去除干凈，將切取的幼芽轉入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基為:1/2MS+IBA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pHS5.8。
【主權項】
1.一種提高蘋果無菌苗葉片出愈率和出芽率的方法，其特征是:依次包括下列步驟: (1)蘋果莖尖的消毒和滅菌 取春季取剛萌動的蘋果新梢，用流動的自來水沖洗干凈后，剝取莖尖，用75%的酒精消毒30~40s，再用無菌水沖洗干凈，然后用0.1 %的升未消毒3~4 min，再用無菌水沖洗3~4遍，用無菌濾紙吸去多余水分后接種； (2)蘋果無菌苗的獲得 每個10ml的培養(yǎng)瓶接種5~7個蘋果莖尖，培養(yǎng)條件為每天光照12 h，光照強度2000lx，培養(yǎng)溫度26°C ;培養(yǎng)30d后獲得5~6cm高的蘋果無菌苗； (3)蘋果無菌苗葉片的切割 取上述蘋果無菌苗充分展開的葉片，在垂直主脈方向兩側各切2~3刀，不切透葉緣和主脈并保持葉片完整，葉片反面朝上平鋪在分化培養(yǎng)基上；分化培養(yǎng)基組成是:MS+6-BA4.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7 g/L，pH 為 5.8 ; (4)蘋果葉片愈傷組織和芽的誘導 經步驟(3)蘋果無菌苗葉片接種1d后，葉片顏色仍為綠色，稍膨大，葉片切口邊緣處翹起，多數(shù)葉片在切口處形成少量白色或淡綠色的愈傷組織，愈傷組織結構較疏松；隨著培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織逐漸膨大變多，20d后蘋果葉片開始分化形成大量不定芽； (5)生根培養(yǎng) 待幼芽長到2~3cm大小時，在超凈工作臺上切下幼芽，將切取的幼芽轉入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)；生根培養(yǎng)基為:1/2MS+IBA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7 g/L, pH為5.8。
2.根據(jù)權利要求1所述的提高蘋果無菌苗葉片出愈率和出芽率的方法，其特征是:蘋果品種為“魯加6號”。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高蘋果無菌苗葉片出愈率和出芽率的方法，包括蘋果莖尖的消毒和滅菌、蘋果無菌苗的獲得、蘋果無菌苗葉片的切割、蘋果葉片愈傷組織和芽的誘導、生根培養(yǎng)等步驟。本發(fā)明的目的在于提供一種葉片的出愈率和出芽率高的提高蘋果無菌苗葉片出愈率和出芽率的方法。本發(fā)明使每個葉片保持完整性明顯提高了葉片的成活率，而且切口總長度相對增加2~4倍，促使每個葉片的出愈率和出芽率比傳統(tǒng)方法至少提高2~4倍。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號】CN104686355
【申請?zhí)枴緾N201510095319
【發(fā)明人】梁美霞, 王仲禮
【申請人】魯東大學
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月4日