一種頭花蓼離體快繁體系的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說，涉及一種頭花寥離體快繁體系的建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]頭液M (PoIygonum應(yīng))又名太陽草、四季紅、石莽草等,為寥科寥屬植物，主要分布在貴州、重慶、四川、湖北、湖南、以及廣西等省份。為貴州苗族用藥，其應(yīng)用歷史悠久，地上部分或全草入藥，具有味辛、微澀、性涼的特征；民間常用于治療泌尿系統(tǒng)感染、血尿、膀胱炎、風(fēng)濕痛、腹瀉、痢疾等疾病。目前，頭花寥的開發(fā)利用主要集中在我國貴州省，是中藥現(xiàn)代化重點發(fā)展六大苗藥品種之一。另外，頭花寥依靠種子繁殖，發(fā)芽率較高，根系發(fā)達，吸附能力很強，且每個莖節(jié)都能長出不定根，對土壤有很好的固定作用，是理想的野生覆蓋植物。頭花寥植株的莖、葉、花等具有較高的觀賞價值，是一種野生的地被植物，結(jié)合喬灌木植株形成高低層次的園林景觀，可用在垂直綠化、邊坡護理和地被綠化等綠化處理方面。
[0003]目前，頭花寥多采用種子育種、扦插、分株和組織培養(yǎng)等技術(shù)進行繁殖。因為種子收獲量大、發(fā)芽率高、儲存方便等特點,采用均勻撒播能夠有效形成地被覆蓋,使得種子育苗成為主繁殖的主要方法；扦插采用基插技術(shù)，配合激素使用能更好達到快速繁殖的目的；分株繁殖方面，由于頭花寥的匍匐莖產(chǎn)生氣生根容易形成小植株，繁殖方法簡單，容易較快成苗。但是，頭花寥野生資源分布稀散、工業(yè)過度消耗以及生態(tài)環(huán)境的日益惡化導(dǎo)致頭花寥資源嚴重匱乏，嚴重阻礙了其大規(guī)?；a(chǎn)的需要。因此，通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得無菌植株并建立一套完整的優(yōu)質(zhì)種苗繁育體系已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。本發(fā)明以頭花寥葉片為外植體，通過愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、分化、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等過程成功獲得了頭花寥離體再植株，建立頭花寥組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)體系，以推動其規(guī)?；l(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供出一種頭花寥離體快繁體系的建立方法，本發(fā)明以頭花寥葉片為外植體，通過愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、分化、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等過程成功獲得了頭花寥離體再植株，建立頭花寥組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)體系，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0005]本發(fā)明的一種頭花寥離體快繁體系的建立方法，包括以下的步驟:
(I)外植體消毒:摘取頭花寥剛展開葉片，在自來水中以滴水的形式?jīng)_洗60?90min。在無菌條件下，以70%?80%乙醇溶液浸泡20s?60s，無菌水沖洗4?6次，再用0.1%?0.2%升萊溶液消毒5?15min,然后用無菌水沖洗外植體至無泡沫為止。用無菌濾紙吸干表面的水分后備用。
[0006](2)愈傷組織誘導(dǎo):將步驟(I)消毒好的葉片切0.5cm2的小塊，主脈上輕微切割2刀，葉片背面朝下接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。接種后置于每天光照12?14小時，光照強度為1000?20001X，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C，空氣相對濕度為75%?80%的條件下培養(yǎng)30天后統(tǒng)計誘導(dǎo)情況。
[0007](3)增殖培養(yǎng):選取步驟(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的生長旺盛的胚性愈傷組織，切取直徑大小約為0.3cm的塊接種至增殖培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)。接種后置于每天光照12?14小時，光照強度為1000?20001x，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C，空氣相對濕度為75%?80%的條件下培養(yǎng)45天后統(tǒng)計增殖情況。
[0008](4)分化培養(yǎng):將步驟(3)增殖的愈傷組織取出切成直徑大小約0.5cm的塊接種至分化培養(yǎng)基進行分化培養(yǎng)。接種后置于每天光照12?14小時，光照強度為2000?30001x，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C，空氣相對濕度為75%?80%的條件下培養(yǎng)45天后統(tǒng)計分化情況。
[0009](5)生根培養(yǎng):從基部切取步驟(4)分化培養(yǎng)中獲的健壯試管苗接種至生根培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)生根。接種后置于每天光照12?14小時，光照強度為2000?30001χ，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C，空氣相對濕度為75%?80%的條件下培養(yǎng)30天后統(tǒng)計生根情況。
[0010](6)煉苗移栽:將生根培養(yǎng)基上獲得的具備移栽條件的瓶苗進行煉苗，瓶苗移至常溫下4?5天后，打開瓶蓋2?3天，然后洗去附著于苗根系上的培養(yǎng)基，移栽至盛有由泥炭土:蛭石=1:1組成的移栽培養(yǎng)基質(zhì)的容器袋中進行培養(yǎng)，移栽前5天用0.3%高猛酸鉀溶液對基質(zhì)噴淋消毒并加蓋薄膜，3天后打開薄膜，翻動基質(zhì)，移栽前I天將基質(zhì)淋透水。移栽時需將基質(zhì)壓實，并進行單株套袋，早晚噴霧，保證生長環(huán)境潮濕。移栽7天后剪去塑料袋兩角，14天后完全脫袋，移栽30天后統(tǒng)計成活率。
[0011]上述步驟(2)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+0.1?1.0mg/L NAA+1.0?2.0mg/L6-BA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0012]上述步驟(3 )所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+2.0?5.0mg/L 6-BA+0.1?0.5mg/LIBA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0013]上述步驟(4)所述的分化培養(yǎng)基為:MS+4.0?8.0mg/L 6-BA+0.1?0.5mg/LIBA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0014]上述步驟(5)所述的生根培養(yǎng)基為:1/2MS+1.0?2.0mg/L ΑΒΤ5+0.1?0.5mg/LNAA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點是:頭液Polygvnum capiiaiw?)為寥科寥屬植物,是貴州苗族用藥，全草可入藥，常用于治療泌尿系統(tǒng)感染、風(fēng)濕痛等病癥。頭花寥野生資源分布稀散、工業(yè)過度消耗以及生態(tài)環(huán)境的日益惡化導(dǎo)致頭花寥資源嚴重匱乏，嚴重阻礙了其大規(guī)?；a(chǎn)的需要。因此，通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得無菌植株并建立一套完整的優(yōu)質(zhì)種苗繁育體系已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。本發(fā)明以頭花寥葉片為外植體，通過愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、分化、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等過程成功獲得了頭花寥離體再植株，建立頭花寥組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)體系，以推動其規(guī)?；l(fā)展。
【具體實施方式】
[0016]以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，不是對本發(fā)明的限制。
[0017]實施例1
(I)外植體消毒:摘取頭花寥剛展開葉片，在自來水中以滴水的形式?jīng)_洗60min。在無菌條件下，以70%乙醇溶液浸泡60s，無菌水沖洗4次，再用0.1%升汞溶液消毒lOmin，然后用無菌水沖洗外植體至無泡沫為止。用無菌濾紙吸干表面的水分后備用。
[0018](2)愈傷組織誘導(dǎo):將步驟(I)消毒好的葉片切0.5cm2的小塊，主脈上輕微切割2刀，葉片背面朝下接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。接種后置于每天光照12小時，光照強度為ΙΟΟΟΙχ，置于培養(yǎng)溫度為25°C，空氣相對濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后誘導(dǎo)率為78.9%。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+0.5mg/L NAA+1.5mg/L 6_BA+25g/L蔗糖+3.8g/L瓊脂，pH為5.5。
[0019](3)增殖培養(yǎng):選取步驟(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的生長旺盛的胚性愈傷組織，切取直徑大小約為0.3cm的塊接種至增殖培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)。接種后置于每天光照12小時，光照強度為ΙΟΟΟΙχ，置于培養(yǎng)溫度為25°C，空氣相對濕度為75%的條件下培養(yǎng)45天后愈傷組織增加量為86.9%。所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+3.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+25g/L蔗糖+4.5g/L瓊脂，pH為5.5。
[0020](4)分化培養(yǎng):將步驟(3)增殖的愈傷組織取出切成直徑大小約0.5cm的塊接種至分化培養(yǎng)基進行分化培養(yǎng)。接種后置于每天光照12小時，光照強度為20001χ，置于培養(yǎng)溫度為25 V，空氣相對濕度為75%的條件下培養(yǎng)45天后分化率為93.3%，不定芽平均數(shù)為5.3 個。所述的分化培養(yǎng)基為:MS+5.0mg/L 6-BA+0.3mg/L IBA+18g/L 蔗糖+5.5g/L 瓊脂，pH 為 5.5。
[0021](5)生根培養(yǎng):從基部