培養(yǎng)鐵皮石斛原球莖的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥用植物組織培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種利用間歇浸沒生物反應器 進行鐵皮石斛類原球莖產業(yè)化擴繁的方法。
【背景技術】
[0002] 鐵皮石斛，是我國珍稀的中藥材。為"中華九大仙草"之一，又稱"千金草"，《神農 本草經》中記載石斛"主傷中、除痹、下氣、補五臟虛勞贏瘦、強陰、久服厚腸胃"?，F(xiàn)代藥理 學研究表明，鐵皮石斛含有生物堿、多糖、豐富的微量元素等多種有效成分。鐵皮石斛植株 成活率低、生長速度慢、繁殖率低、產量低、價格昂貴，根本無法滿足市場需求，以植物組織 培養(yǎng)物(鐵皮石斛原球莖）代替原植物是解決石斛資源緊缺最有效的途徑。
[0003] 原球莖是種子萌發(fā)過程中，原胚萌動膨大，突破種皮后形成的淺黃色小圓錐形 胚性組織。增殖迅速，易于規(guī)模化生產，是一種潛在的鐵皮石斛藥用新資源。類原球莖 (protocorm like bodies, PLBs)又稱擬原球莖，是鐵皮石斛組培過程中產生的類似原球莖 的一種特殊組織結構，是正在生長分化的體細胞胚胎，可由植株的不同部位萌發(fā)產生，類原 球莖具有易分散、增殖效率高、生長周期短，可實現(xiàn)規(guī)?；a的特點，并具備與原植物同 樣的形態(tài)發(fā)育和物質代謝潛能。
[0004] 現(xiàn)代藥理學試驗表明鐵皮石斛原球莖、類原球莖與原藥材均具有提高免疫功能作 用，且兩者作用強度相似。根據(jù)《食品安全法》和《新資源食品管理辦法》的規(guī)定，經新資源 食品評審專家委員會審核，批準鐵皮石斛原球莖為新食品資源。
[0005] 近年來，也有許多關于鐵皮石斛原球莖的培養(yǎng)方式申請了專利，例如中國專利（申 請?zhí)枮?01010100377. 6)公開了一種鐵皮石斛原球莖的間歇式發(fā)酵培養(yǎng)，該培養(yǎng)方法設計 簡單，成本低廉，無特定的間歇浸沒生物反應器。但是該無法進行通氣量、浸沒頻率等相關 條件的調控，在一定程度了不利于鐵皮石斛原球莖規(guī)?；瘮U繁；此外，浸沒頻率會影響組織 培養(yǎng)物的內部激素的分泌，從而無法實行自動化。同時其他相關專利均是以鐵皮石斛原球 莖分化，獲得無菌苗，進行種苗培養(yǎng)。
[0006] 上述專利文獻中雖然也采用了間歇浸沒的方法培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)鐵皮石斛原球 莖，但是所采用的裝置卻不相同，由于不同間歇浸沒培養(yǎng)裝置的操作方法不同，同時由于各 種植物在生理、生化上的不同，即使相同的培養(yǎng)方法對不同的植物培養(yǎng)也是不一樣的，需要 不同的培養(yǎng)條件和處理方式，并不能通過簡單的有限次實驗推理來得到。上述文獻專利中 提及的步驟以及其中涉及到的具體的培養(yǎng)方式和培養(yǎng)條件完全不能用于利用間歇浸沒生 物反應器培育鐵皮石斛原球莖。
[0007] 應用間歇浸沒生物反應器進行鐵皮石斛原球莖產業(yè)化培養(yǎng)可以彌補傳統(tǒng)方法生 產的缺陷，獲得大量高質量的鐵皮石斛原球莖提供了有效的方法。
[0008] 鑒于利用間歇浸沒式培養(yǎng)方法進行鐵皮石斛原球莖的培養(yǎng)未見報道和公開應用， 因此，有必要研究出一種利用間歇浸沒生物反應器進行鐵皮石斛原球莖產業(yè)化擴繁的方 法。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種周期短、成本低、操作簡單自動化適用于產 業(yè)化生產的培養(yǎng)鐵皮石斛原球莖的方法。
[0010] 為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是，該培養(yǎng)鐵皮石斛原球莖的方法 依次包括前期準備、原球莖的萌發(fā)與增殖、生物反應器生產等步驟： (1) 前期準備： ① 固體培養(yǎng)基配制：固體培養(yǎng)基的配方為1/2MS基本培養(yǎng)基，添加 NAA 0. 1~5. 0 mg/L ; 蔗糖濃度〇~50 g/L;香蕉液0~80 g/L;瓊脂粉0~10 g/L，調整pH值5.0~7.0,煮沸，分裝， 滅菌處理后，備用； ② 液體增殖培養(yǎng)基配制：液體增殖培養(yǎng)基的配方為1/2MS基本培養(yǎng)基，添加 NAA 0· 1~5· 0 mg/L ;6-BA 0· 1~10. 0 mg/L ;鹿糖濃度 0~50 g/L ;香蕉液 0~80 g/L，調整 pH 值 5. 0~7. 0,培養(yǎng)液配制完成后，煮沸，分裝，滅菌處理后，備用； ③ 生物反應器滅菌：將生物反應器進行組裝，在組裝過程中將玻璃珠放入生物反應器 中，然后包扎滅菌，滅菌處理后，備用； (2) 原球莖的萌發(fā)與增殖培養(yǎng)： 將外植體接種于1/2 MS固體培養(yǎng)基中，進行原球莖的萌發(fā)與增殖，然后經過3~5次繼 代培養(yǎng)，篩選出生長快、增殖率高、無明顯分化的鐵皮石斛原球莖，作為生物反應器生產鐵 皮石斛原球莖的種子； (3) 過渡觀察培養(yǎng)： 將步驟（2)中篩選出的優(yōu)質原球莖先接種到液體增殖培養(yǎng)基中進行觀察培養(yǎng)，接種密 度10~70 g/L，培養(yǎng)時間3~5d ; (4) 生物反應器培養(yǎng)： 將步驟（3)中的球莖接種到間歇浸沒生物反應器中，接種密度10~70 g/L ;浸沒頻率 0~30 min/0~12 h，培養(yǎng)時間20~60 d ;培養(yǎng)條件：光照強度1000~3000 lux，光照0~24 h/ d，溫度 10~30°C。
[0011] 滅菌處理的方法為高溫高壓濕熱滅菌，通過上述技術方案，利用間歇浸沒生物反 應器培育鐵皮石斛原球莖，可以在短時間內獲得高的增殖率，縮短了鐵皮石斛原球莖的培 養(yǎng)周期且所培養(yǎng)的鐵皮石斛原球莖質量高；其中的過渡觀察培養(yǎng)可以減少鐵皮石斛原球轉 移到間隙浸沒生物反應器中的適應期，提高培養(yǎng)存活率；該方法操作簡單，自動化，從而實 現(xiàn)省時省力；同時可以減少培養(yǎng)器皿的使用，不僅節(jié)約了人力成本，還節(jié)約了培養(yǎng)成本，實 現(xiàn)了低成本的培養(yǎng)方法，適合于產業(yè)化推廣。
[0012] 作為本發(fā)明進一步的改進在于，所述步驟（4)生物反應器培養(yǎng)中，所述生物反應器 的生長盤內平鋪一層玻璃珠，所述玻璃珠的直徑為1~1〇 mm。將玻璃珠平鋪在生物反應器的 生長盤內可以起到固定，濾水，透氣等作用；經過大量實驗證明，添加玻璃珠的生物反應器 比不添加玻璃珠的生物反應器獲得的鐵皮石斛原球莖更多。以不添加玻璃珠的生物反應器 作為對照實驗(其它培養(yǎng)條件均相同)，培養(yǎng)60天后比較鐵皮石斛原球莖增殖情況如下表 ：
【主權項】
1. 一種培養(yǎng)鐵皮石斛原球莖的方法，包括如下步驟： (1) 前期準備： ① 固體培養(yǎng)基配制：固體培養(yǎng)基的配方為1/2MS基本培養(yǎng)基，添加 NAA 0. 1~5. O mg/L ; 蔗糖濃度〇~50 g/L;香蕉液0~80 g/L;瓊脂粉0~10 g/L，調整pH值5.0~7.0,煮沸，分裝， 滅菌處理后，備用； ② 液體增殖培養(yǎng)基配制：液體增殖培養(yǎng)基的配方為1/2MS基本培養(yǎng)基，添加 NAA 0· 1~5· 0 mg/L ;6-BA 0· 1~10. 0 mg/L ;鹿糖濃度 0~50 g/L ;香蕉液 0~80 g/L，調整 pH 值 5. 0~7. 0,培養(yǎng)液配制完成后，煮沸，分裝，滅菌處理后，備用； ③ 生物反應器滅菌：將生物反應器進行組裝，在組裝過程中將玻璃珠放入生物反應器 中，然后包扎滅菌；滅菌處理后，備用； (2) 原球莖的萌發(fā)與增殖增養(yǎng)： 將外植體接種于1/2 MS固體培養(yǎng)基中，進行原球莖的萌發(fā)與增殖，然后經過3~5次繼 代培養(yǎng)，篩選出生長快、增殖率高、無明顯芽分化的鐵皮石斛原球莖，作為生物反應器生產 鐵皮石斛原球莖的種子； (3) 過渡觀察培養(yǎng)： 將步驟（2)中篩選出的優(yōu)質原球莖先接種到液體增殖培養(yǎng)基中進行觀察培養(yǎng)，接種密 度10~70 g/L，培養(yǎng)時間3~5d ; (4) 生物反應器培養(yǎng)： 將步驟（3)中的球莖接種到間歇浸沒生物反應器中，接種密度10~70 g/L ;浸沒頻率 0~30 min/0~12 h，培養(yǎng)時間20~60 d ;培養(yǎng)條件：光照強度1000~3000 lux，光照0~24 h/ d，溫度 10~30°C。
2. 根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)鐵皮石斛原球莖的方法，其特征在于，所述步驟（4)生 物反應器培養(yǎng)中，所述生物反應器的生長盤內平鋪一層玻璃珠，所述玻璃珠的直徑為1~1〇 mm〇
3. 根據(jù)權利要求2所述的培養(yǎng)鐵皮石斛原球莖的方法，其特征在于，所述步驟（1)前 期準備中，所述固體培養(yǎng)基，添加 NAA 0. 2~0. 8 mg/L，蔗糖濃度20~40 g/L，香蕉液40~60g/ L，瓊脂粉4~8g/L，調整pH值5. 8~6. 2 ;所述液體增殖培養(yǎng)基，添加 NAA 0. 1~0. 8 mg/L，6-BA 2· 0~8· 0 mg/L，蔗糖濃度 20~40 g/L，香蕉液 20~60 g/L，調整 pH 值 5· 8~6· 2。
4. 根據(jù)權利要求1或2所述的培養(yǎng)鐵皮石斛原球莖的方法，其特征在于，所述步驟（I) 前期準備中，所述香蕉液為香蕉勻漿或香蕉提取液。
5. 根據(jù)權利要求4所述的利用植物組織培養(yǎng)技術生產鐵皮石斛原球莖的方法，其特征 在于，所述步驟（2 )原球莖的萌發(fā)與增殖培養(yǎng)中，所述外植體為鐵皮石斛無菌種子或無菌苗 莖段橫截面組織薄片。
6. 根據(jù)權利要求4所述的培養(yǎng)鐵皮石斛原球莖的方法，其特征在于，所述步驟（4)生物 反應器培養(yǎng)中，接種密度10~70 g/L;浸沒頻率5~20 min/4~8 h;培養(yǎng)時間20~60 d。
7. 根據(jù)權利要求5所述的培養(yǎng)鐵皮石斛原球莖的方法，其特征在于，所述鐵皮石斛無 菌種子的滅菌方法包括清洗和消毒。
8. 根據(jù)權利要求7所述的培養(yǎng)鐵皮石斛原球莖的方法，其特征在于， 所述清洗的方法包括以下步驟：選擇飽滿鐵皮石斛果莢；在無菌環(huán)境中，用60~80%的 無水乙醇浸泡種子15~30 s,無菌水清洗1~4次后；再用0. 05~0. 15%的氯化萊浸泡10~20 min，無菌水清洗3~7次。
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物生物技術領域，具體涉及一種藥用植物的培育技術，具體涉及一種培養(yǎng)鐵皮石斛原球莖的方法；該方法依次包括前期準備、原球莖的萌發(fā)與增殖、過渡觀察培養(yǎng)、生物反應器生產步驟。利用間歇浸沒生物反應器進行鐵皮石斛原球莖生產的方法是在無菌條件下進行的，滅菌處理的方法為高溫高壓濕熱滅菌，通過上述技術方案，利用間歇浸沒生物反應器培育鐵皮石斛原球莖，可以在短時間內獲得高的增殖率，縮短了鐵皮石斛原球莖的培養(yǎng)周期且所培養(yǎng)的鐵皮石斛原球莖質量高；該方法操作簡單，自動化，從而實現(xiàn)省時省力；同時可以減少培養(yǎng)器皿的使用，節(jié)約人力成本和培養(yǎng)成本，實現(xiàn)了低成本的培養(yǎng)方法，適合于產業(yè)化推廣。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號】CN104705188
【申請?zhí)枴緾N201510156698
【發(fā)明人】陳集雙, 蔣海俠, 張本厚, 宋蓮
【申請人】南京工業(yè)大學
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2015年4月3日