一種臍血單個核細胞凍存液、應(yīng)用、制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種臍血單個核細胞凍存液、應(yīng)用、制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 臍血單個核細胞（cord blood mononuclear cell，CBMC)，指臍血中具有單個核的 細胞，包含造血干細胞、淋巴細胞、單核細胞（monocyte)、樹突狀細胞和其它少量細胞。CBMC 在體內(nèi)可促進機體造血，增強機體免疫力；在體外可誘導分化成多種免疫細胞，如細胞因子 誘導的殺傷細胞（CIK)、自然殺傷細胞（NK)、自然殺傷性T細胞（NKT)，在抗腫瘤、抗感染等 方面具有重大用途。因此，凍存CBMC在細胞治療方面具有很重要的意義。
[0003] 細胞凍存是細胞長期保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細胞置于_196°C液氮 中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候 再復蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染 或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。
[0004] 細胞凍存過程會顯著改變細胞的熱力學、化學和物理環(huán)境，有伴隨造成生物性損 傷的危險。為了將細胞凍存、復蘇過程中細胞的損傷降至最低，必須進一步優(yōu)化化學和溫度 操作過程，但需要在凍存前加入一種或一種以上的凍存保護劑，在溶解后又將其去除。目前 最常用的凍存保護劑為二甲基亞砜（DMSO)，這種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可 以使冰點下降，減少胞內(nèi)形成冰晶的機會，從而減少冰晶對細胞的損傷。由于高濃度DMSO 對細胞有毒性，還必須添加其他的液體成分，如血清、細胞培養(yǎng)基，以降低DMSO的濃度，減 少對細胞的傷害。
[0005] 現(xiàn)有凍存CBMC的凍存液配方多采用DMSO聯(lián)合動物血清，具有傳播病原體的潛在 隱患，而采用培養(yǎng)基則限制了其在臨床上直接應(yīng)用的可能性。目前干細胞凍存液所使用的 胎牛血清常攜帶動物源性病毒，比如歐洲多個國家發(fā)生瘋牛病，其血清中含有導致瘋牛病 的病毒，用于凍存細胞會導致此類病毒傳播。此外，有研宄表明長期與胎牛血清接觸的干細 胞會對溶液介質(zhì)中的胎牛血清發(fā)生內(nèi)吞，內(nèi)吞胎牛血清后的干細胞有可能發(fā)生某些蛋白表 達的變化，應(yīng)用于人體后有可能發(fā)生異種動物蛋白引起的免疫反應(yīng)，從而導致干細胞移植 后成功率降低以及不良反應(yīng)的發(fā)生。因此，中國藥品和食品質(zhì)量監(jiān)督管理局2003年發(fā)布的 《人體細胞治療臨床研宄和質(zhì)量控制指導原則》明確指出，應(yīng)盡量避免使用動物血清培養(yǎng)細 胞。
[0006] 細胞培養(yǎng)基也是目前的凍存液配方中常見的成分，其成分復雜，不能直接注射入 人體，故如果需要細胞復蘇后直接移植，則必需通過離心把細胞培養(yǎng)基去除掉，而離心又會 導致剛剛復蘇的細胞受損，活率降低，影響細胞治療效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明提供一種臍血單個核細胞凍存液、應(yīng)用、制備方法。本發(fā)明的 CBMC凍存液不采用動物血清，避免了血清傳播動物源性病原體的風險。而且，采用本發(fā)明的 凍存液，細胞復蘇后活率更高，顯示其更好的凍存效果。此外，本發(fā)明的CBMC凍存液配方不 含培養(yǎng)基，細胞復蘇后可直接用于臨床回輸，提高了其在臨床應(yīng)用方面的價值。
[0008] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0009] 本發(fā)明提供了一種臍血單個核細胞凍存液，包括如下組分：
[0010] DMSO 5 ~20 體積份
[0011] 羥乙基淀粉 5~60體積份
[0012] 勃脈力A 20~90體積份。
[0013] 本發(fā)明摒棄采用動物血清、細胞培養(yǎng)基作為凍存液成分之一，而采取了獲得中國 藥品監(jiān)督管理局批號的勃脈力A和羥乙基淀粉，并聯(lián)合DMSO,用于凍存CBMC，既避免了傳播 潛在病原體的風險，提高了細胞凍存的安全性，又確保了 CBMC的凍存效果，并且不含細胞 培養(yǎng)基，CBMC復蘇后可以直接回輸人體，在臨床上具有很大的實用價值。
[0014] 其中DMSO易穿透細胞，在細胞凍存過程中可以使冰點下降，減少胞內(nèi)形成冰晶的 機會，從而減少冰晶對細胞的損傷。羥乙基淀粉則起到穩(wěn)定細胞膜的作用，避免細胞遭受凍 存?zhèn)?。勃脈力A則維持電解質(zhì)平衡，使細胞處于一種比較溫和的更接近體內(nèi)環(huán)境的溶液 中。
[0015] 本發(fā)明的CBMC凍存液不采用動物血清，避免了血清傳播動物源性病原體的風險。 而且，采用本發(fā)明的凍存液，細胞復蘇后活率更高，顯示其更好的凍存效果。
[0016] 此外，本發(fā)明的CBMC凍存液配方不含培養(yǎng)基，細胞復蘇后可直接用于臨床回輸， 提高了其在臨床應(yīng)用方面的價值。
[0017] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，臍血單個核細胞凍存液包括如下組分：
[0018] DMSO 10 體積份
[0019] 羥乙基淀粉 30體積份
[0020] 勃脈力A 60體積份。
[0021] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，臍血單個核細胞凍存液包括如下組分：
[0022] DMSO 5 ~20v/v%
[0023] 輕乙基淀粉 5~60v/v%
[0024] 勃脈力 A 20 ~90v/v%
[0025] 各組分的體積百分數(shù)之和為100%。
[0026] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，臍血單個核細胞凍存液包括如下組分：
[0027] DMSO 10v/v%
[0028] 輕乙基淀粉 30v/v%
[0029] 勃脈力 A 60v/v%。
[0030] 本發(fā)明還提供了所述臍血單個核細胞凍存液在凍存臍血單個核細胞中的應(yīng)用。
[0031] 本發(fā)明還提供了一種臍血單個核細胞的凍存方法，用所述臍血單個核細胞凍存液 凍存所述臍血單個核細胞。
[0032] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，凍存方法包括如下步驟：
[0033] 步驟1 :獲得臍血單個核細胞；
[0034] 步驟2 :重懸所述臍血單個核細胞，獲得臍血單個核細胞懸液；
[0035] 步驟3 :取所述臍血單個核細胞懸液與所述臍血單個核細胞凍存液混合，分裝，凍 存。
[0036] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，凍存方法中所述臍血單個核細胞懸液與如權(quán)利 要求1至4任一項所述的臍血單個核細胞凍存液的體積比為5:1~1:5。
[0037] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，凍存方法中步驟1所述獲得臍血單個核細胞具 體為獲得添加枸櫞酸鈉抗凝劑的臍血，用RPMI1640培養(yǎng)基1:1稀釋后，添加到淋巴細胞分 離液Ficoll上，700g離心30min，吸取臍血單個核細胞層，用RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2遍， 250g離心5min，獲得臍血單個核細胞。
[0038] 在本發(fā)明的一些具體實施方案中，凍存方法中步驟2重懸所述臍血單個核細胞具 體為用勃脈力A重懸CBMC。作為優(yōu)選，臍血單個核細胞懸液的細胞密度為I X 107/mL。
[0039] 作為優(yōu)選，分裝為將細胞懸液分裝于凍存管內(nèi)，每管1ml。將凍存管置于裝有異丙 醇的凍存盒中。
[0040] 作為優(yōu)選，凍存為于-80°c冰箱過夜，次日移入液氮罐。
[0041] 具體的，本發(fā)明提供的臍血單個核細胞的凍存方法具體為：
[0042] I) CBMC的分離：將添加枸櫞酸鈉抗凝劑的臍血用RPMI1640培養(yǎng)基1:1稀釋后，添 加到淋巴細胞分離液Ficoll上，700g離心30min，吸取臍血單個核細胞層，用RPMI1640培 養(yǎng)基洗絳2遍，250g離心5min，得到CBMC。
[0043] 2) CBMC的凍存：配制保護劑濃度為終濃度2倍、終體積一半的凍存液（20 % DMS0+60%羥乙基淀粉+勃脈力A)，置于4°C冰箱IOmin以上。用勃脈力A重懸CBMC，使其 細胞密度為IX l〇7/ml。向細胞懸液中沿管壁緩緩加入與管內(nèi)細胞懸液等體積的細胞凍存 液，將細胞懸液分裝于凍存管內(nèi)，每管Iml。將凍存管置于裝有異丙醇的凍存盒中，于-80°C 冰箱過夜，次日移入液氮罐。
[0044] 本發(fā)明摒棄采用動物血清、細胞培養(yǎng)基作為凍存液成分之一，而采取了獲得中國 藥品監(jiān)督管理局批號的勃脈力A和羥乙基淀粉，并聯(lián)合DMS0,用于凍存CBMC，既避免了傳播 潛在病原體的風險，提高了細胞凍存的安全性，又確保了 CBMC的凍存效果，并且不含細胞 培養(yǎng)基，CBMC復蘇后可以直接回輸人體，在臨床上具有很大的實用價值。
[0045] 本發(fā)明的CBMC凍存液不采用動物血清，避免了血清傳播動物源性病原體的風險。 而且，采用本發(fā)明的凍存液，細胞復蘇后活率更高，顯示其更好的凍存效果。凍存2個月后， 用本發(fā)明凍存液凍存的CBMC復蘇后細胞活率平均值為94. 73 %，顯著（P< 0.05)高于用傳 統(tǒng)凍存液（10% DMS0+90% FBS)的凍存效果。
[0046] 此外，本發(fā)明的CBMC凍存液配方不含培養(yǎng)基，細胞復蘇后可直接用于臨床回輸， 提高了其在臨床應(yīng)用方面的價值。
【附圖說明】
[0047] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0048] 圖1示剛分離、未凍存的CBMC的流式結(jié)果：⑶34表達率為1. 0% ;
[0049] 圖2示復蘇的CBMC的流式結(jié)果：⑶34表達率為0. 9%，與凍存前無明顯差異；
[0050] 圖3示培養(yǎng)第14天的NKT細胞，100 X，細胞狀態(tài)良好；
[0051] 圖4示培養(yǎng)第14天的CIK細胞，IOOX，細胞狀態(tài)良好；
[0052] 圖5示CBMC向NKT誘導分化14天后的流式結(jié)果：CD3+⑶56+細胞為39. 0%，顯示 誘導效果良好；
[0053] 圖6示CBMC向CIK誘導分化14天后的流式結(jié)果：⑶3+⑶56+細胞為32. 7 %，顯示 誘導效果良好。
【具體實施方式】
[0054] 本發(fā)明公開了 一種臍血單個核細胞凍存液、應(yīng)用、制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以 借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng) 域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通 過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所 述的方法和應(yīng)用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0055] 本發(fā)明提供的臍血單個核細胞凍存液、應(yīng)用、制備方法中所用原料及試劑均可由 市場購得。
[0056] 臍血單個核細胞可有市場購得，或者按照本發(fā)明所述方法制得。
[0057] 勃脈力A(復方電解質(zhì)注射液，上海百特醫(yī)療用品有限公司）：其組分為：每 1000 ml含氯化鈉5. 26g、葡萄糖酸鈉5. 02g、醋酸鈉3. 68g、氯化鉀0. 37g、氯化鎂0. 30g。勃 脈力A作為一種等滲的復方電解質(zhì)溶液，具有不含鈣離子、pH值為7. 4、抗酸能力好、成分與 細胞外液相似以及不含乳酸鹽等優(yōu)點。
[0058] 羥乙基淀粉出％羥乙基淀粉40氯化鈉注射液，山東科倫藥業(yè)有限公司）。
[0059] 下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：
[0060] 實施例1
[0061] DMSO 15% (體積分數(shù)）
[0062] 羥乙基淀粉 40% (體積分數(shù)）
[0063] 勃脈力A 余量
[0064