一種以種子為外植體的快速建立中型狼尾草組織培養(yǎng)再生體系的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物的組織培養(yǎng)方法，具體涉及一種以種子為外植體的快速建立中型狼尾草組織培養(yǎng)再生體系的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中型狼尾草longissimumvar.1ntermedium)為禾本科狼尾草屬多年生疏叢型野生草本植物，在云南、四川、貴州、湖南等地均有分布。中型狼尾草莖桿較粗壯，根系發(fā)達(dá)，適應(yīng)性廣，再生能力強(qiáng)，產(chǎn)草量高，營(yíng)養(yǎng)成分相對(duì)較高，且其具有很強(qiáng)的抗病性、抗旱、耐濕和耐鹽堿性，是進(jìn)行優(yōu)質(zhì)牧草推廣和研宄禾本科植物耐鹽、抗旱、豐產(chǎn)等重要機(jī)理的重要物種。但是，由于其種子結(jié)實(shí)率和萌發(fā)率在北方地區(qū)都較低，限制了其在北方地區(qū)推廣的速度。以營(yíng)養(yǎng)體進(jìn)行繁殖雖然可以實(shí)施，但對(duì)于大面積的推廣操作起來難度太大。目前雖然也有相關(guān)的通過營(yíng)養(yǎng)體進(jìn)行組織培養(yǎng)的方法，如陳建華等(專利申請(qǐng)?zhí)?200910049855.2)通過幼芽作為外植體建立了一種紫葉狼尾草的組織培養(yǎng)方法。雖然能從室內(nèi)進(jìn)行狼尾草組織的快速擴(kuò)繁，但是組織培養(yǎng)繁殖的方式費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不能從根本上解決中型狼尾草大量擴(kuò)繁推廣的問題，提高其種子結(jié)實(shí)和萌發(fā)率才是解決問題的關(guān)鍵所在。但是目前對(duì)于其種子結(jié)實(shí)和萌發(fā)率低的分子機(jī)理還沒有研宄清楚，其中重要的問題就是其分子機(jī)理研宄的基礎(chǔ)條件一以種子為外植體的狼尾草組培再生體系，還沒有建立起來，在很大程度上限制了相關(guān)研宄的開展，且傳統(tǒng)的培養(yǎng)皿密封培養(yǎng)模式下愈傷和分化過程比較慢，目前缺少一種以種子為外植體的快速建立中型狼尾草組織培養(yǎng)再生體系的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種以種子為外植體的快速建立中型狼尾草組織培養(yǎng)再生體系的方法，為研宄提高其種子的結(jié)實(shí)率和萌發(fā)、促進(jìn)其在北方地區(qū)的推廣提供了技術(shù)支持。
[0004]本發(fā)明的一種以種子為外植體的快速建立中型狼尾草組織培養(yǎng)再生體系的方法，步驟如下:
(O中型狼尾草原材料的選取、消毒和浸泡；
(2)愈傷組織的接種和培養(yǎng):將步驟(I)的消毒浸泡后種子接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在無菌且通風(fēng)的環(huán)境下遮光培養(yǎng)，形成愈傷組織；所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為:MS 培養(yǎng)基 + I ?3wt% 蔗糖 + 0.5 ?L 0wt% 瓊脂 + 2 ?5 mg/L 2，4-D+1 ?2 mg/LKT, pH為5-6 ;在上述條件下7?14天后即可形成愈傷組織，愈傷率可達(dá)95%以上，并可用于繼代培養(yǎng)。
[0005](3)愈傷組織的分化:將步驟(2)得到的愈傷組織接種于分化培養(yǎng)基中，在無菌且通風(fēng)的環(huán)境中光照培養(yǎng)，得到長(zhǎng)出葉片并帶有根毛的組織；其中，所述分化培養(yǎng)基的配方為:MS 培養(yǎng)基 +1 ?3wt% 蔗糖 +0.5 ?L 0wt% 瓊脂 +0.5 ?L 5 mg/L 6-BA+0.2 ?0.5 mg/L NAA，pH為5?6 ;所述光照培養(yǎng)的參數(shù)為:光照強(qiáng)度為50 μ mol/ (m2*s)，光周期為16h/d，溫度24?26°C ;上述培養(yǎng)基中的激素配比可以快速促進(jìn)愈傷組織中的細(xì)胞結(jié)束脫分化過程，重新開始向各組織的分化。且為快速促進(jìn)芽點(diǎn)的分化，開始光合作用，將培養(yǎng)條件改為光照培養(yǎng)；培養(yǎng)7?14天后即可出現(xiàn)芽點(diǎn)，25?45天后即可長(zhǎng)出葉片和根毛，分化率可達(dá)75%以上。
[0006](4)組培苗生根培養(yǎng):將步驟(3)分化出葉片并帶有根毛的組織移入生根培養(yǎng)基中，在在無菌且通風(fēng)的環(huán)境中光照培養(yǎng)，得到根系發(fā)達(dá)的組培苗；其中，所述生根培養(yǎng)基的配方為:1/2MS培養(yǎng)基+2.0?5.0wt%蔗糖+1.0?3.0wt%瓊脂，pH為5?6 ;所述光照培養(yǎng)的參數(shù)為:光照強(qiáng)度為50 μ mol/ (m2*s)，光周期為16h/d，溫度24?26°C ;在上述條件下培養(yǎng)14?30天后其生根率可達(dá)80%以上，且其根系發(fā)達(dá)，組培苗長(zhǎng)勢(shì)良好；
(5)煉苗及移栽:待組培苗生長(zhǎng)至8?1cm時(shí)進(jìn)行煉苗，之后將其移栽正常培養(yǎng)即可。移栽后成活率達(dá)90%以上，完成了整個(gè)以種子為外植體的中型狼尾草組織培養(yǎng)再生體系的建立。
[0007]優(yōu)選地，步驟(I)中所述浸泡是將消毒后的中型狼尾草種子放入無菌去離子水中，置于超凈工作臺(tái)上無菌條件下進(jìn)行，所述浸泡時(shí)間為8?12小時(shí)。
[0008]優(yōu)選地，步驟(2)?(4)中所述在無菌且通風(fēng)的環(huán)境中培養(yǎng)為在帶防菌透氣膜的培養(yǎng)皿或組培瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0009]因傳統(tǒng)的愈傷組織和組培苗通常是在培養(yǎng)皿中通過封口膜進(jìn)行密封無菌培養(yǎng)，密封后皿內(nèi)CO2含量隨著組織生長(zhǎng)逐漸消耗而得不到流通交換，在一定程度上限制了愈傷組織的生長(zhǎng)速度。因此本發(fā)明中所述步驟(2)?(4)中的培養(yǎng)條件，除所述光照和溫度外，無論愈傷組織還是組培苗，都需在無菌且通風(fēng)的條件下生長(zhǎng)。
[0010]進(jìn)一步地，步驟(2)中所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為:MS培養(yǎng)基+3.0%蔗糖+0.7wt% 瓊脂 +3.0mg/L 2，4-D+2.0mg/L KT，pH 為 5.8。
[0011]進(jìn)一步地，步驟(3)中所述分化培養(yǎng)基的配方為:MS培養(yǎng)基+3.0wt%蔗糖+0.7wt%瓊脂 +1.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA, pH 為 5.8。
[0012]進(jìn)一步地，步驟(4)中所述所述生根培養(yǎng)基的配方為:1/2MS培養(yǎng)基+5.0wt%蔗糖+ 1.0wt% 瓊脂，pH 為 5.8。
[0013]本發(fā)明提供的方法能夠快速建立中型狼尾草野生種的室內(nèi)快速組織培養(yǎng)再生體系，是下一步研宄其種子結(jié)實(shí)和萌發(fā)率低的分子機(jī)理的重要基礎(chǔ)，且該方法操作簡(jiǎn)單，易于完成。
【附圖說明】
[0014]附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中:
圖1為光照和黑暗條件培養(yǎng)對(duì)中型狼尾草種子接種培養(yǎng)出愈率的影響圖；
圖2為光照和黑暗條件培養(yǎng)對(duì)中型狼尾草種子接種培養(yǎng)出愈時(shí)間的影響圖；
圖3為密封盒帶透氣膜培養(yǎng)方式對(duì)中型狼尾草種子接種培養(yǎng)后出愈率、分化率、生根率的影響圖；
圖4為應(yīng)用本發(fā)明的方法中型狼尾草種子接種培養(yǎng)14天后的愈傷組織生長(zhǎng)圖； 圖5為應(yīng)用本發(fā)明的方法中型狼尾草愈傷組織分化25天后的生長(zhǎng)圖；
圖6為應(yīng)用本發(fā)明的方法中型狼尾草組培苗生根培養(yǎng)40天后的生長(zhǎng)圖；
圖7為應(yīng)用本發(fā)明的方法中型狼尾草組培苗煉苗培養(yǎng)3天后的生長(zhǎng)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為市售。
[0016]實(shí)施例1
本發(fā)明的一種以種子為外植體的中型狼尾草組培再生方法步驟如下:
(O原材料的選取準(zhǔn)備及消毒
選取成熟飽滿的種子用自來水沖洗數(shù)次后置于超凈工作臺(tái)中，用75%的酒精消毒3min，5%的次氯酸鈉(NaClO)消毒lOmin，無菌水沖洗3?5次之后于超凈工作臺(tái)上用無菌去離子水浸泡8小時(shí)吸漲。
[0017](2)愈傷組織的接種和培養(yǎng)
將步驟(I)中的種子以MS培養(yǎng)基+1.0%蔗糖+0.5%瓊脂+2.0mg/L 2, 4-D+l.0mg/L KT，并將PH值調(diào)整為6.0作為中型狼尾草野生種的愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，溫度24°C。然后將消毒后的種子接種于上述培養(yǎng)基上，基于光照和黑暗培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)對(duì)比，采用出愈率較高的遮光培養(yǎng)方式，每個(gè)帶防菌透氣膜的培養(yǎng)皿接種20粒種子，14天后可形成愈傷組織，愈傷率能達(dá)到95%，并可用于繼代培養(yǎng)。帶防菌透氣膜的培養(yǎng)皿可以保證愈傷組織和組培苗在無菌且通風(fēng)的條件下生長(zhǎng)。
[0018](3)愈傷組織的分化
將步驟⑵中的愈