用苔草幼苗葉片為外植體的組培快繁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種苔草的組織培養(yǎng)快速繁殖方法，特別涉及一種通過(guò)苔草幼苗葉片誘導(dǎo)培養(yǎng)快速繁殖苔草的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]苔草為莎草科多年生草本植物，在我國(guó)各地均有分布，品種資源非常豐富，苔草屬植物覆蓋度好，根系發(fā)達(dá)，萌生力強(qiáng)，生長(zhǎng)快，生長(zhǎng)密，適應(yīng)性強(qiáng)，具有較強(qiáng)的竟?fàn)幠芰吐幽芰?，尤其在北方具有春季返青早、生長(zhǎng)季長(zhǎng)、耐干旱及低矮、形態(tài)優(yōu)美等特點(diǎn)，是理想的草坪草種和環(huán)境保護(hù)植物，對(duì)恢復(fù)與改善生態(tài)環(huán)境有重要作用，同時(shí)在水土保持、公路綠化、城市園林綠化和運(yùn)動(dòng)場(chǎng)草坪建設(shè)中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。
[0003]為了豐富我國(guó)草坪草的品種，尋找耐旱、適應(yīng)性強(qiáng)的、美觀的草坪資源，不少研宄者己進(jìn)行了苔草種植資源的搜集引種，建立了苔草資源圃，并對(duì)其中一些較好的品種如白穎苔草、尖嘴苔草、早春苔草、異穗苔草等進(jìn)行馴化引種，應(yīng)用于園林綠化中取得了較好的效果。但由于苔草種子具有強(qiáng)休眠、低萌發(fā)率等特性，使其開(kāi)發(fā)利用受到嚴(yán)重制約。中國(guó)專利2008100605441公開(kāi)了 “一種金葉苔草莖尖培養(yǎng)快速繁殖方法”，2010102094791公開(kāi)了“一種金葉苔草的培育方法”，呂秀立等公開(kāi)了金葉苔草離體培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)(雜草科學(xué)，2005 (3)，30-31頁(yè))，以上三種組培方法大同小異，均是先將莖尖組織誘導(dǎo)形成幼芽或分生組織，然后掰成單芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)，再進(jìn)行壯苗、生根培養(yǎng)及移栽等步驟完成快速繁殖過(guò)程。該方法基本屬于經(jīng)典的組培方法，對(duì)于苔草種子具有強(qiáng)休眠、低萌發(fā)率等特性而言，獲取莖尖組織的材料比較緊張，因原始材料少導(dǎo)致其組織效率不高。元杰等公開(kāi)了異鱗苔草快速繁殖研宄(山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40 (9):933-935頁(yè))，該文考慮到苔草種子強(qiáng)體眠、低萌發(fā)率的問(wèn)題，對(duì)苔草的種子先進(jìn)行了萌發(fā)誘導(dǎo)生成小苗后再取莖尖組織同上述方法一樣進(jìn)行快速繁殖。該方法比前三篇文獻(xiàn)的方法有所改進(jìn)，但是苔草快繁的效率還是有限，難以滿足市場(chǎng)需求。因此，苔草的快速繁殖研宄仍然是亟待解決的問(wèn)題，其對(duì)保護(hù)苔草屬植物野生資源和促進(jìn)在園林中應(yīng)用均具有現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種用苔草幼苗葉片為外植體的組培快繁方法，采用本發(fā)明的方法能夠在短期內(nèi)獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)的試管苗，解決優(yōu)質(zhì)苔草品種規(guī)?；a(chǎn)和大面積應(yīng)用問(wèn)題。
[0005]本發(fā)明的用苔草幼苗葉片為外植體的組培快繁方法，包括如下步驟:
(1)外植體制備取苔草的種子置于無(wú)菌工作臺(tái)內(nèi)，用酒精浸泡10-40S，無(wú)菌水沖洗3次，0.l%HgCl2浸泡2-5min，無(wú)菌水沖洗5次，接種于加有濃度為30g/L的蔗糖的MS培養(yǎng)基，誘導(dǎo)其發(fā)芽成苗，培養(yǎng)條件為:17-23°C、光照強(qiáng)度1000— 1500LUX、光周期為15h/d，小苗長(zhǎng)到2-3片葉、葉長(zhǎng)3-5cm時(shí)，將葉片剪為0.8-1.2cm長(zhǎng)的葉片，備用；
(2)初代培養(yǎng)以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加1.2-1.8mg/L的6_BA、0.04-0.06mg/L的ΝΑΑ、0.3-0.5mg/L的2，4_D、30g/L蔗糖、7g/L瓊脂，制成PH為5.8的初代培養(yǎng)基，將(I)準(zhǔn)備的葉片消毒后平鋪接種于初代培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:17-23?，暗光培養(yǎng)40-50天，誘導(dǎo)生成原球莖；
(3)繼代培養(yǎng)以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加1.2-1.8mg/L的6-BA、0.02-0.04mg/L 的 NAA,0.2-0.4mg/L 的 2，4_D、30g/L 蔗糖、7g/L 瓊脂，制成 PH 為 5.8 的繼代培養(yǎng)基，將(2)生成的原球莖置于繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:17-23°C，暗光培養(yǎng)20-25天，生成大量原球莖；
(4)分化培養(yǎng)以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加0.1-0.4mg/L的2，4_D、10_30g/L蔗糖、7g/L瓊脂，制成PH為5.8的分化培養(yǎng)基，將(3)生成的增殖原球莖自然掰開(kāi)后置于分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是:17-23°C、光照強(qiáng)度為1000— 1500Lux、光周期為15h/d，經(jīng)30-40天培養(yǎng)原球莖分化成葉長(zhǎng)為2-3cm的芽苗；
(5)生根培養(yǎng)以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加0.04-0.08mg/L的NAA、10_30g/L蔗糖、7g/L瓊脂，制成PH為5.8的生根培養(yǎng)基，將(4)中芽苗置于生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是:17_23°C、光照強(qiáng)度為1000— 1500Lux、光周期為15h/d，培養(yǎng)10-15天后生根；
(6)煉苗待(5)培養(yǎng)的幼苗根長(zhǎng)到l_3cm時(shí)，將培養(yǎng)瓶的封口膜打開(kāi)，煉苗6-8天；
(7)移栽試管苗移栽基質(zhì)為泥炭或/和蛭石，基質(zhì)移栽前用50%多菌靈可濕性粉劑的700-900倍液進(jìn)行消毒，取出(6)培養(yǎng)的幼苗用自來(lái)水洗凈根部的培養(yǎng)基，稍晾干表面的水分即可移栽入消毒后的基質(zhì)中，然后搭建拱棚，將拱棚濕度保持在75%-80%、溫度20-25?，移栽10天后逐漸降低溫度至17-20°C，30天后進(jìn)入常規(guī)管理。
[0006]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過(guò)將苔草種子在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，為苔草的快速繁殖提供了大量的外植體來(lái)源。本發(fā)明尤為突出的是以無(wú)菌苔草幼苗的葉片作為外植體，經(jīng)過(guò)初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)生成大量的苔草原球莖，再經(jīng)過(guò)分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)誘導(dǎo)生成芽苗且生根，然后經(jīng)常規(guī)的煉苗和移栽培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)了苔草的快速繁殖。采用本發(fā)明方法比現(xiàn)有技術(shù)方法的繁殖速率提高40%，成活率提高60%，為優(yōu)質(zhì)苔草品種資源的保護(hù)及快速繁殖育苗提供一條有效解決途徑。
【附圖說(shuō)明】
[0007]圖1為本發(fā)明用苔草幼苗葉片為外植體繼代培養(yǎng)生成的大量原球莖。
[0008]圖2為原球莖分化生成的芽苗。
[0009]實(shí)施例1
野外收集白穎苔草種質(zhì)資源經(jīng)過(guò)篩選后，將表現(xiàn)優(yōu)良的白穎苔草種子進(jìn)行如下處理:(I)外植體制備將種子置于無(wú)菌工作臺(tái)內(nèi)，先用酒精浸泡10S，無(wú)菌水沖洗3次，再用0.l%HgC12浸泡2min，無(wú)菌水沖洗5次。接種于加有濃度為30g/L的蔗糖的固體MS培養(yǎng)基內(nèi)誘導(dǎo)其發(fā)芽成苗，培養(yǎng)條件為:17-20°C、光照強(qiáng)度1000— 1200LUX、光周期為15h/d，待小苗長(zhǎng)到2片葉、葉長(zhǎng)3cm時(shí)，用剪刀將葉片剪為0.8cm長(zhǎng)的葉片；(2)初代培養(yǎng)以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加1.2mg/L的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、0.04mg/L的a-萘乙酸(NAA),0.3mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D)、30g/L蔗糖、7g/L瓊脂，制成PH為5.8的培養(yǎng)基，將(I)準(zhǔn)備的0.8cm長(zhǎng)的葉片消毒后平鋪接種于初代培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為17-20°C，暗光培養(yǎng)40天后可誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖；(3)繼代培養(yǎng)以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加 1.2mg/L 的 6-BA、0.02mg/L 的 NAA,0.2mg/L 的 2，4_D、30g/L 蔗糖、7g/L 瓊月旨，制成PH為5.8的繼代培養(yǎng)基，將葉片誘導(dǎo)原球莖置于繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)，培養(yǎng)20天后可生成大量原球莖；(4)分化培養(yǎng)以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加0.lmg/L的2，4-D、10g/L蔗糖、7g/L瓊脂，制成PH為5.8的分化培養(yǎng)基，將
(3)增殖原球莖自然掰開(kāi)置于分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是:17-20°C、光照強(qiáng)度為1000— 1200LUX、光周期為15h/d，直至原球莖分化成葉長(zhǎng)為2cm的芽苗；(5)生根培養(yǎng)以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加0.04mg/L的NAA、10g/L蔗糖、7g/L瓊脂，制成PH為5.8的生根培養(yǎng)基，將分化芽苗置于生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是:17-20?、光照強(qiáng)度為1000— 1200Lux、光周期為15h/d，培養(yǎng)10天后即可生根；(6)煉苗待(5)培養(yǎng)的幼苗根長(zhǎng)到Icm時(shí)，將培養(yǎng)瓶的封口膜打開(kāi)，煉苗6天；(7)移栽試管苗移栽基質(zhì)為泥炭或蛭石，基質(zhì)移栽前用50%多菌靈可濕性粉劑的700液進(jìn)行消毒，取出培養(yǎng)的幼苗用自來(lái)水洗凈根部的培養(yǎng)基，稍晾干表面的水分即可移栽入消毒后的基質(zhì)中，然后搭建拱棚，將拱棚濕度保持在75%-80%、溫度20-25°C，移栽10天后逐漸降低溫度至17_20°C，30天后進(jìn)入常規(guī)管理。
[0010]實(shí)施例2
野外收集尖嘴苔草種質(zhì)資源經(jīng)過(guò)篩選后，將表現(xiàn)優(yōu)良的尖嘴苔草種子進(jìn)行如下處理:
(I)外植體制備將種子置于無(wú)菌工作臺(tái)內(nèi)