一種龍腦樟組織培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種組織培養(yǎng)方法，具體是一種龍腦樟組織培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 樟樹(shù)（Cinnamomum comphora)為樟科樟屬常綠喬木樹(shù)種，是吉安市鄉(xiāng)土品種。吉安 市林科所科研人員經(jīng)過(guò)多年研宄，根據(jù)樟樹(shù)所含化學(xué)成分，將樟樹(shù)分為龍腦樟、芳樟、腦樟、 油樟、異樟等類型。龍腦樟為以上幾種化學(xué)類型中天然分布最少，經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的樹(shù)種。通 過(guò)龍腦樟矮林作業(yè)種植而提取的天然右旋龍腦樟油，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、香精香料和化妝品 等行業(yè)，市場(chǎng)前景廣闊。
[0003] 龍腦樟的繁育通常有種子繁殖和扦插繁殖，由于天然分布的龍腦樟母樹(shù)極少，播 種繁殖后的苗木存在變異現(xiàn)象；扦插繁殖也因優(yōu)良類型資源少而導(dǎo)致優(yōu)良類型苗木繁育數(shù) 量極為有限。因此，若能采用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行龍腦樟優(yōu)良類型苗木繁殖，將可以較好的 解決龍腦樟優(yōu)良苗木繁殖速度慢、移栽成活率低等難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種繁殖速度快、移栽成活率高的龍腦樟組織培養(yǎng)方法， 以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問(wèn)題。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案： 一種龍腦樟組織培養(yǎng)方法，具體培育步驟如下： a. 每年4~5月份取龍腦樟當(dāng)年新抽半木質(zhì)化枝條，剪取具有2-3個(gè)葉片的半木質(zhì)化 枝條，去除葉片后，置于無(wú)菌水中振蕩洗滌3-5分鐘，取出后再用70%的酒精處理1-2分鐘， 然后置于0. 1%升汞6-10分鐘，再用無(wú)菌水清洗3次，制得處理的半木質(zhì)化枝條； b. 將處理的半木質(zhì)化枝條接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，獲得無(wú)菌外植體，在溫度 26-28°C、光強(qiáng)1500-20001x、每天12小時(shí)光照培養(yǎng)條件下培養(yǎng)40-50天后，形成用于 擴(kuò)繁的愈傷組織和不定芽，其中不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基+6-BA0. 5~1.0 mg/ L+NAA0. 05 ~0? 2 mg/L，pH=5. 5 ; c. 將愈傷組織和不定芽放入繼代增殖擴(kuò)繁培養(yǎng)基，制得增殖芽團(tuán)；培育條件：溫度 26-28°C，光強(qiáng) 1500-20001x，12h/d ;繼代增殖擴(kuò)繁培養(yǎng)基：改良 MS+6-BA0. 3 ~2. Omg/ L+NAA0. 05 ~0? 2mg/L+Na2S203100 ~300mg/L，pH=5. 5 ; d. 將增殖芽團(tuán)放入誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基，培育得到生根苗；培育條件：溫度26-28°C，光強(qiáng) 1500-20001x，12h/d ;誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基：改良 MS+IBA1. 0mg/L+NAA0. 01 ~0? 2mg/L，pH=5. 5 ; e.將經(jīng)以上培養(yǎng)的生根苗移栽； 所述改良MS為MS基本培養(yǎng)基中，硝酸鉀和硝酸銨成分減半，氯化鈣成分增加20%，硫酸 鹽成分加倍，其它成分不變。
[0006] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：步驟b中，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基 +6-BAO. 8mg/L+NAA0. lmg/L, pH=5. 5〇
[0007] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：步驟c中，繼代增殖擴(kuò)繁培養(yǎng)基：改良MS+6-BA 1.0 mg/ L+NAA 0. 05mg/L+Na2S203 150mg/L, pH=5. 5〇
[0008] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：步驟d中，誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基：改良MS+IBA 1.0 mg/L+NAA 0. 05mg/L〇
[0009] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：步驟e中，將已生根的生根苗拿去練苗，練苗20-30天 到莖干成深綠色，再洗去培養(yǎng)基移栽到1/3椰糠+2/3泥炭土的基質(zhì)中，其中在25天內(nèi)的溫 度、濕度控制：溫度26-30°C，濕度80~100%。
[0010] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述步驟中b、c、d中，MS基本培養(yǎng)基或改良MS中均含 蔗糖3%、卡拉膠0. 8%、pH=5. 5。
[0011] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明龍腦樟組織培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)培 養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基+6-BAO. 8mg/L+NAA0. lmg/L，pH=5. 5 ;繼代增殖擴(kuò)繁培養(yǎng)基：改良 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0? 05mg/L+Na2S203 150mg/L，pH=5. 5,誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基：改良 MS+IBA 1. Omg/L+NAA 0. 05mg/L，將經(jīng)以上培養(yǎng)的龍腦樟生根苗移栽，成活率95%以上。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的 實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0013] 實(shí)施例1 本發(fā)明實(shí)施例中，材料取自于吉安市篩選的龍腦樟優(yōu)良類型的當(dāng)年生新抽半木質(zhì)化枝 條，取材時(shí)間為4月30日。試驗(yàn)方法： (一）培養(yǎng)條件 MS基本培養(yǎng)基或改良MS培養(yǎng)基中均含蔗糖3%，卡拉膠0. 8%，pH5. 5，置于溫度 26-28°C，光強(qiáng)1500-20001x，每天12小時(shí)光照培養(yǎng)。
[0014](二）增殖培養(yǎng)研宄 以下研宄試驗(yàn)中，試驗(yàn)1、2、3、4每個(gè)處理200個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1個(gè)增殖單位（1個(gè)2-3 個(gè)節(jié)的莖段)。每個(gè)增殖周期35天。
[0015] 1.不同pH值培養(yǎng)基對(duì)增殖的影響 兩種處理的培養(yǎng)基，均使用改良MS+6-BA (6-芐氨基腺嘌呤）0.8mg/L+NAA (萘乙酸） 0? 05 mg/L培養(yǎng)基。但配制培養(yǎng)基時(shí)，分別將pH值調(diào)配到6. 5, 5. 5, 5. 2, 5. 0,以pH=6. 0為 對(duì)照處理。培養(yǎng)一個(gè)增殖周期后調(diào)查統(tǒng)計(jì)新抽不定芽數(shù)量及長(zhǎng)勢(shì)情況。
[0016] 2.培養(yǎng)基中不同濃度的6-BA對(duì)增殖速率的影響 將每個(gè)增殖單位置改良MS培養(yǎng)基+NAA0. 05mg/L，并配合6-BA濃度分別為Omg/L、 0? 5mg/L、0. 8mg/L、l. 0mg/L、l. 5mg/L、2. 0mg/L、3. 0mg/L 中，以 6-BA 0mg/L 為對(duì)照處理。培 養(yǎng)一個(gè)增殖周期后調(diào)查統(tǒng)計(jì)新抽側(cè)芽數(shù)量。
[0017] 3.培養(yǎng)基中不同基本鹽類濃度對(duì)增殖速率及長(zhǎng)勢(shì)的影響 主要采用]^基本培養(yǎng)基、1/21^、改良]^和]^(3/5 1#，2倍2#，6/5 3#)，配合6-8八 1.0mg/L+NAA 0. 05mg/L(pH=5. 5)。以MS基本培養(yǎng)基為對(duì)照處理。培養(yǎng)一個(gè)增殖周期后調(diào) 查統(tǒng)計(jì)新抽不定芽數(shù)量及長(zhǎng)勢(shì)情況。
[0018]說(shuō)明：1/2MS :MS基本培養(yǎng)基成分中所有成分的含量減半。
[0019] 改良MS為MS基本培養(yǎng)基中，硝酸鉀和硝酸銨成分減半，氯化鈣成分增加20%，硫酸 鹽成分加倍，其它成分不變。
[0020] MS (3/5 1#，2倍2#，6/5 3#)為：MS基本培養(yǎng)基中各成分的含量，3/5的硝酸胺和 硝酸鉀，2倍的碘化鉀、氯化鈷和氯化鈣，6/5的硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鋅和硫酸銅，其它成分 不變。
[0021] 4?如何解決枯頂?shù)羧~的問(wèn)題 繼代增殖培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)增殖的莖段新抽芽頂梢或葉有不同程度枯頂或掉葉現(xiàn) 象，長(zhǎng)勢(shì)較差。采用培養(yǎng)基改良MS+6-BA l.Omg/L+NAA 0.05 mg/L，配合添加Na2S203150mg/ L、300 mg/L;MgS04800mg/L、1600mg/L四個(gè)處理。以不添加Na2S2O 3或MgSO4為對(duì)照處理。培 養(yǎng)一個(gè)增殖周期后分別調(diào)查統(tǒng)計(jì)枯頂或掉葉比率。
[0022] (三）生根培養(yǎng)研宄 探索不同生長(zhǎng)素對(duì)龍腦樟組培生根的影響，基本培養(yǎng)基為改良MS，配合以IBA (吲哚丁 酸)、NNA (4-(N-甲基-N-亞硝基胺）-4-(3-吡啶基）丁醛)、IAA (吲哚-3-乙酸）不同濃 度及其配比，調(diào)查統(tǒng)計(jì)15天、30天生根率。
[0023](四）結(jié)果與分析 1. 不同pH值培養(yǎng)基對(duì)增殖速率的影響 不同pH值培養(yǎng)基對(duì)增殖的影響結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，增殖培養(yǎng)基pH值 以5. 5為宜。在培養(yǎng)基中：改良MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0. 05mg/L (pH=5. 5)，芽團(tuán)長(zhǎng)勢(shì)好活 力足，不定芽數(shù)量增多，增殖系數(shù)最高，達(dá)2. 7,同時(shí)高度大于2. 0厘米不定芽數(shù)量也最多， 可收獲生根苗數(shù)量最多，收獲率達(dá)2. 1。pH值升高或降低，芽團(tuán)長(zhǎng)勢(shì)一般或較差，增殖系數(shù) 及收獲率均在一般水平；pH值升高到6. 5,新抽不定芽長(zhǎng)勢(shì)一般，但活力不足；pH值降低到 5. 0,新抽不定芽長(zhǎng)勢(shì)較差，還會(huì)出現(xiàn)新抽葉焉軟現(xiàn)象。
[0024]表1
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種龍腦樟組織培養(yǎng)方法，其特征在于，具體培育步驟如下： a. 每年4~5月份取龍腦樟當(dāng)年新抽半木質(zhì)化枝條，剪取具有2-3個(gè)葉片的半木質(zhì)化 枝條，去除葉片后，置于無(wú)菌水中振蕩洗滌3-5分鐘，取出后再用70%的酒精處理1-2分鐘， 然后置于0. 1%升汞6-10分鐘，再用無(wú)菌水清洗3次，制得處理的半木質(zhì)化枝條； b. 將處理的半木質(zhì)化枝條接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，獲得無(wú)菌外植體，在溫度 26-28°C、光強(qiáng)1500-20001x、每天12小時(shí)光照培養(yǎng)條件下培養(yǎng)40-50天后，形成用于 擴(kuò)繁的愈傷組織和不定芽，其中不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基+6-BA0. 5~1.0 mg/ L+NAA0. 05 ~0? 2 mg/L，pH=5. 5 ; c. 將愈傷組織和不定芽放入繼代增殖擴(kuò)繁培養(yǎng)基，制得增殖芽團(tuán)；培育條件：溫度 26-28°C，光強(qiáng) 1500-20001x，12h/d ;繼代增殖擴(kuò)繁培養(yǎng)基：改良 MS+6-BA0. 3 ~2. Omg/ L+NAA0. 05 ~0? 2mg/L+Na2S203100 ~300mg/L，pH=5. 5 ; d. 將增殖芽團(tuán)放入誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基，培育得到生根苗；培育條件：溫度26-28°C，光強(qiáng) 1500-20001x，12h/d ;誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基：改良 MS+IBA1. 0mg/L+NAA0. 01 ~0? 2mg/L，pH=5. 5 ; e. 將經(jīng)以上培養(yǎng)的生根苗移栽； 所述改良MS為MS基本培養(yǎng)基中，硝酸鉀和硝酸銨成分減半，氯化鈣成分增加20%，硫酸 鹽成分加倍，其它成分不變。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種龍腦樟組織培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟b中，不定芽誘導(dǎo) 培養(yǎng)基：MS 基本培養(yǎng)基 +6-BAO. 8mg/L+NAA0. lmg/L，pH=5. 5。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種龍腦樟組織培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟c中，繼代增殖擴(kuò) 繁培養(yǎng)基：改良 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0? 05mg/L+Na2S203 150mg/L，pH=5. 5。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種龍腦樟組織培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟d中，誘導(dǎo)生根培 養(yǎng)基：改良 MS+IBA 1.0 mg/L+NAA 0? 05mg/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種龍腦樟組織培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟e中，將已生根的 生根苗拿去練苗，練苗20-30天到莖干成深綠色，再洗去培養(yǎng)基移栽到1/3椰糠+2/3泥炭 土的基質(zhì)中，其中在25天內(nèi)的溫度、濕度控制：溫度26-30°C，濕度80~100%。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述一種龍腦樟組織培養(yǎng)方法，其特征在于：所述步驟中b、 c、d中，MS基本培養(yǎng)基或改良MS中均含蔗糖3%、卡拉膠0. 8%、pH=5. 5。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種龍腦樟組織培養(yǎng)方法，每年4～5月份取龍腦樟當(dāng)年新抽半木質(zhì)化枝條，剪取具有2-3個(gè)葉片的枝條，去除葉片后，置于無(wú)菌水中振蕩洗滌3-5分鐘，再用70%的酒精處理1-2分鐘，置于0.1%升汞6-10分鐘，再用無(wú)菌水清洗3次；將處理的半木質(zhì)化枝條接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，獲得無(wú)菌外植體，光照培養(yǎng)條件下培養(yǎng)后，形成用于擴(kuò)繁的愈傷組織和不定芽；再經(jīng)過(guò)繼代增殖擴(kuò)繁培養(yǎng)基、誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)，培育得到生根苗；將經(jīng)以上培養(yǎng)的龍腦樟生根苗移栽，成活率95%以上。
【IPC分類】A01H4-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104737914
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510180211
【發(fā)明人】胡慶, 彭建軍
【申請(qǐng)人】江西北辰德天然生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2015年4月16日