近反向育種的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】近反向育種
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00680012445. 5的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 本發(fā)明涉及用于從雜合非人生物體產(chǎn)生純合非人生物體的方法，所述純合生物體 可以進(jìn)行雜交而獲得雜種。本發(fā)明特別涉及植物。
[0003] 植物育種是一項(xiàng)人類(lèi)的基本工作，其對(duì)于提供供應(yīng)人類(lèi)食物的馴化物種是極其重 要的。因此，植物育種是古老的，并且最初是基于選擇和繁殖那些在局部選擇田地中表現(xiàn)優(yōu) 異的植物。
[0004] 當(dāng)代的植物育種高度依賴(lài)于遺傳學(xué)知識(shí)，并且在技術(shù)上得到了諸如雙單倍體 (doubled haploid，DH)(參見(jiàn)例如 Haploids in Crop Improvement II eds ；Palmer C, Keller W 和 Kasha K(2005)in:Biotechnology in Agriculture and Forestry 56Eds ； Nagata T, L5rz H 和 Widholm J. Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, ISBN 3-500-22224-3)和分子標(biāo)記（參見(jiàn)例如 De Vienne ed.(2003)Molecular Markers in Plant Genetics and Biotechnology.Science publishers Inc. Enfield, NH USA. ISBN 1-57808-239-0)的方法的支持。
[0005] 有性生殖過(guò)程中的遺傳機(jī)制已經(jīng)進(jìn)化為增加遺傳變異，這增加了物種在變化的環(huán) 境中的存活。減數(shù)分裂重組、獨(dú)立染色體分離和交配系統(tǒng)是這方面的主要影響因素。然而， 在植物育種中，這些機(jī)制可能起反作用，特別是在當(dāng)遺傳上雜合的植物已被鑒定為具有高 的農(nóng)學(xué)或園藝學(xué)價(jià)值時(shí)的那些情形中。遺傳因子的重新分配導(dǎo)致產(chǎn)生遺傳上不相似的并因 而異質(zhì)的植物，并因此喪失商業(yè)上所期望的性狀。
[0006] 為了對(duì)抗這種效果，植物育種者可以利用許多技術(shù)。一種可能性是無(wú)性繁殖植 物，這導(dǎo)致它們的遺傳組成完全保留，因?yàn)橥ㄟ^(guò)有絲分裂僅發(fā)生倍增。對(duì)于許多植物物 種，體外組織培養(yǎng)現(xiàn)在正用于無(wú)性繁殖植物，盡管也可以應(yīng)用其他方法如產(chǎn)生體內(nèi)插條 (cuttings)〇
[0007] 與通過(guò)種子進(jìn)行繁殖相比較，無(wú)性繁殖（vegetative propagation)的一個(gè)缺點(diǎn) 是：其為勞動(dòng)密集的，并因而成本高。而且，難以保存植物較長(zhǎng)的時(shí)間（引起后勤問(wèn)題），并 且與植物材料通過(guò)種子進(jìn)行繁殖的情況相比較，病原體如病毒感染植物材料的風(fēng)險(xiǎn)顯著較 大。
[0008] 備選地，無(wú)性繁殖可以通過(guò)形成無(wú)性種子（asexual seed)來(lái)完成，這通常稱(chēng)為無(wú) 融合生殖。可以通過(guò)遺傳工程在有性繁殖的植物物種中誘導(dǎo)在許多物種中自然發(fā)生的無(wú)融 合生殖。然而目前，負(fù)責(zé)無(wú)融合生殖的不同步驟即未減數(shù)孢子生殖、孤雌生殖和自主胚乳發(fā) 育的基因還沒(méi)有被鑒定，并且可能以復(fù)雜的方式相互作用。因而，盡管已經(jīng)廣泛認(rèn)識(shí)到無(wú)融 合生殖技術(shù)用于植物育種的潛力很長(zhǎng)時(shí)間了，但是仍需等待這一概念的驗(yàn)證。
[0009] 作為另一個(gè)備選方式，可以利用如W0-03017753中描述的反向育種技術(shù)。反向育 種（reverse breeding)是基于通過(guò)遺傳工程來(lái)抑制減數(shù)分裂重組并隨后產(chǎn)生雙單倍體植 物（DH)，其源于含有未重組的親本染色體的孢子。這些DH在它們的遺傳組成方面是不同 的，只是因?yàn)樵跍p數(shù)分裂過(guò)程中發(fā)生的獨(dú)立的親本染色體分離。因此，足夠的是，利用每個(gè) 染色體的一個(gè)共顯性的多態(tài)標(biāo)記來(lái)確定DH或源于其的品系中的哪個(gè)應(yīng)該通過(guò)雜交進(jìn)行組 合以重構(gòu)原始起始植物的遺傳組成。如此，反向育種技術(shù)的應(yīng)用允許任何所選擇的可育植 物通過(guò)種子的遺傳保留，即使其遺傳組成是未知的。
[0010] 然而，這種技術(shù)的一個(gè)缺點(diǎn)是：減數(shù)分裂重組的完全抑制導(dǎo)致第一次減數(shù)分裂過(guò) 程中沒(méi)有交叉（chiasmata)并因而導(dǎo)致不合適的染色體分離，這可以導(dǎo)致配子的非整倍性 并因而減少了生存力。當(dāng)在第一次減數(shù)分裂過(guò)程中不形成交叉時(shí)，每個(gè)染色體具有獨(dú)立的 50%的機(jī)會(huì)移向兩極的任何一端。這意味著產(chǎn)生一個(gè)具有完整染色體組的孢子的理論幾率 是（1/2Γ，其中X表示單倍染色體數(shù)目。平衡配子的頻率因而隨著單倍染色體數(shù)目增加而 降低。
[0011] 盡管許多作物物種具有相對(duì)較低的染色體數(shù)目（例如黃瓜每個(gè)單倍體基因組具 有7條染色體，菠菜僅具有6條），但也存在具有相對(duì)高的染色體數(shù)目的商業(yè)上重要的物種， 如番茄，其為最大的蔬菜作物之一，其每個(gè)單倍體基因組具有12條染色體。這種技術(shù)性約 束顯著地降低了反向育種技術(shù)的效率。因此，本領(lǐng)域?qū)溥x方法存在明顯的需求，所述備選 方法使得在有性后代中保留遺傳組成。
[0012] 因此本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供用于保留親本生物體，特別是親本植物的遺傳組成 的方法。
[0013] 在導(dǎo)致本發(fā)明的研宄中，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)利用從未減數(shù)孢子例如可由于第 二次分裂重建（Second Division Restitution，SDR)事件而獲得的孢子（所謂的"SDR-0 細(xì)胞"）再生的植物，有可能提供這種方法。該方法也可以在其他除植物以外的非人生物體 例如真菌或魚(yú)上，并且使用其他生殖細(xì)胞例如配子來(lái)進(jìn)行。
[0014] 本發(fā)明因而涉及用于從雜合非人生物體產(chǎn)生純合非人生物體的方法，所述純合生 物體可以進(jìn)行雜交而獲得雜種，所述方法包括：
[0015] a)提供雜合起始生物體；
[0016] b)讓所述生物體產(chǎn)生源于第二次分裂重建的SDR-O細(xì)胞；
[0017] c)從所述SDR-O細(xì)胞再生SDR-O生物體；和
[0018] d)從如此獲得的SDR-O生物體產(chǎn)生純合生物體。
[0019] 這種方法在此將稱(chēng)為"近反向育種（Near Reverse Breeding) "。
[0020] 未減數(shù)孢子優(yōu)選由于省略了第二次減數(shù)分裂而形成。這種自然現(xiàn)象稱(chēng)為第二次分 裂重建（Second Division Restitution)或SDR。SDR在植物中可以在有性繁殖過(guò)程中與 正常的減數(shù)分裂事件一起發(fā)生。本發(fā)明的近反向育種技術(shù)通過(guò)特定地選擇經(jīng)過(guò)自然或經(jīng)改 造的SDR而產(chǎn)生的未減數(shù)孢子用于再生來(lái)利用SDR事件。得到的植物，稱(chēng)為SDR-O植物，其 大部分是純合的，并在優(yōu)選的實(shí)施方案中用于產(chǎn)生DH。然而，SDR-O植物中的純合性水平也 可以通過(guò)近交步驟或第二次SDR事件或其組合來(lái)增加。
[0021] 在起始植物的父本和母本基因組之間是多態(tài)的分子標(biāo)記可用于鑒定那些SDR-O 植物和源于其的DH，它們?cè)谒鼈兊倪z傳組成方面基本上互補(bǔ)，并且在雜交后導(dǎo)致最初的起 始植物的遺傳構(gòu)成幾乎完全的重構(gòu)。
[0022] 由于在SDR-O事件的形成過(guò)程中和在源于其的DH形成過(guò)程中的減數(shù)分裂重組，因 而所述重構(gòu)是"幾乎完全的"。經(jīng)重構(gòu)的雜種將在一定程度上相互之間以及與原始的起始雜 種植物在遺傳上不同。然而，與其中DH直接源于正常的減數(shù)分裂事件的情況相比較，這種 變異大大減少。而且，所述DH在遺傳上是固定的，這意味著沒(méi)有空間用于進(jìn)一步選擇。
[0023] 在該方法中整合SDR事件的優(yōu)勢(shì)是，遺傳互補(bǔ)性的選擇在兩步過(guò)程中進(jìn)行。第一 個(gè)步驟集中于染色體的近端區(qū)，即包括著絲粒。第二個(gè)步驟指向染色體的遠(yuǎn)端，即由于重組 而發(fā)生交換的那些區(qū)域。這種延緩的遺傳固定減少了復(fù)雜性并增加了發(fā)現(xiàn)大部分互補(bǔ)的基 因型的機(jī)會(huì)，特別是當(dāng)分子標(biāo)記可用于選擇時(shí)。
[0024] 這種方法的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是：SDR是一種自然過(guò)程，其在有性繁殖過(guò)程中發(fā)生并且 可以就如此利用而無(wú)需進(jìn)一步干擾有性繁殖過(guò)程。
[0025] 圖1和2示意性地圖解說(shuō)明了正常減數(shù)分裂事件（隨后是DH的形成）和SDR事 件的不同。在這兩個(gè)圖中描繪了 4個(gè)染色體對(duì)，并且同系物以淺色或黑色棒狀結(jié)構(gòu)顯示，其 中棒狀物上的黑色圓圈表示著絲粒。該圖僅用于舉例說(shuō)明本發(fā)明的原理。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù) 人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的是，實(shí)際上所涉及的染色體對(duì)的數(shù)目取決于所涉及的物種。此外，交換 (crossing-over)點(diǎn)相關(guān)于它們的數(shù)目/染色體和它們?cè)谌旧w上的位置是可變的。
[0026] 圖1描述了正常的減數(shù)分裂和兩次減數(shù)分裂都發(fā)生后染色體的加倍（其可以是自