一種穩(wěn)定高效的草莓種質(zhì)資源離體保存及恢復(fù)生長的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定高效的草莓種質(zhì)資源離體保存及恢復(fù)生長的方法，屬于農(nóng)業(yè)
技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 從上世紀(jì)80年代初，我國建立國家果樹草莓種質(zhì)資源圃，分別設(shè)在北京（北京市 農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹研究所內(nèi)）和江蘇南京（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所內(nèi)），標(biāo)志著 我國草莓資源的引種、保存等方面步入了一個(gè)新階段。一些省級(jí)科研單位和大專院校以及 地方研究所或私人單位也保存了一些草莓種質(zhì)資源，目前全國共收集保存野生草莓、地方 品種、引進(jìn)品種、國內(nèi)各研究所新育成的品種（系）等種質(zhì)資源1000余份，通常采用田間 種植保存和室內(nèi)離體保存兩種保存方法。田間種植保存適用于無性繁殖的園藝植物，但是 田間種植保存存在以下局限性（Jarret和Florlowski，1990) :①易受自然災(zāi)害（包括病蟲 害）的侵襲，造成種質(zhì)資源喪失；②需耗費(fèi)大量的人力、物力、財(cái)力；③長期無性繁殖過程中 出現(xiàn)人為混雜和種性退化現(xiàn)象；④不便于種質(zhì)資源交流。室內(nèi)離體保存是將種質(zhì)資源的種 子、花粉、芽、根和枝條等繁殖材料分離開母體，或組織培養(yǎng)物，利用設(shè)備進(jìn)行貯藏保存，其 好處是所占空間小，所需的人力資源少，而又能較好地保護(hù)物種及其遺傳的多樣性。離體保 存已成為種質(zhì)資源保存的常用手段，但利用繼代培養(yǎng)的方法一個(gè)比較普遍的問題就是繼代 頻繁。每一次繼代都可能造成交叉污染引發(fā)遺傳變異的安全風(fēng)險(xiǎn)。而當(dāng)保存量較大時(shí)，多 次繼代所消耗的人力和物力成本也很高。本世紀(jì)以來，研究者成功地對三葉青、金銀花、川 芎、木薯、白術(shù)、石斛屬、菊花和百合等種質(zhì)資源離體保存，但利用改進(jìn)了存放條件和保存容 器，延長保存時(shí)間尚未有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于：針對草莓種質(zhì)保存現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種穩(wěn)定高效 的草莓種質(zhì)資源離體保存及恢復(fù)生長的方法。本發(fā)明首次利用改進(jìn)了存放條件和保存容 器，延長繼代培養(yǎng)周期達(dá)22-24個(gè)月，植株能夠正常生長，保存后未發(fā)生遺傳變異。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明技術(shù)方案具體步驟包括：
[0005] (1)無菌苗的獲得：是從植株上剪取新長出來的匍匐莖莖尖流水沖洗I. 5_2h，在 無菌操凈工作臺(tái)上，先用75%醫(yī)用酒精消毒30s，然后再用0. 1%升汞水消毒8min，最后無 菌水沖洗3-4次后剝?nèi)ネ鈱影?，將莖尖接種在培養(yǎng)基①或②上，置于25±2°C、光照強(qiáng)度 約24001x、每天光照時(shí)間14-16h的培養(yǎng)室中進(jìn)行初代培養(yǎng)，約25天獲得無菌苗。
[0006] (2)生長培養(yǎng)：取上述無菌苗，切取帶1至2葉的莖尖接種在裝有培養(yǎng)基①或②的 組織培養(yǎng)袋中，后將培養(yǎng)袋置于上述相同條件下培養(yǎng)14天，促進(jìn)莖尖生長長成具根和3-4 片葉的試管苗。
[0007] (3)抑制生長：生長培養(yǎng)結(jié)束后，置于22°C，光照強(qiáng)度約24001x，縮短光照至8h的 培養(yǎng)室中培養(yǎng)10天。
[0008] (4)低溫保存：抑制生長結(jié)束后，置于4°C冰箱中弱光（光照強(qiáng)度約4001X)保存。
[0009] (5)檢查恢復(fù)培養(yǎng)：每隔6個(gè)月，對保存的材料進(jìn)行檢查，對生長不好的進(jìn)行恢復(fù) 培養(yǎng)。
[0010] (6)生根移栽：將上述保存達(dá)22-24個(gè)月的材料置于（3)抑制生長條件下培養(yǎng)5 天，然后轉(zhuǎn)接③或④上置于（2)生長培養(yǎng)條件下生根培養(yǎng)25天，煉苗移栽。
[0011] 本發(fā)明所述的一種穩(wěn)定高效的草莓種質(zhì)資源離體保存及恢復(fù)生長的方法，其特征 在于：所述的培養(yǎng)基①是指1/2MS+0. 5mg/L 6-BA+O. lmg/L NAA+30g/L蔗糖+6. 2g/L瓊脂， pH = 5. 8的培養(yǎng)基，用于野生資源的分化與保存。
[0012] 本發(fā)明所述的一種穩(wěn)定高效的草莓種質(zhì)資源離體保存及恢復(fù)生長的方法，其特征 在于：所述的培養(yǎng)基②是指MS+0. 5mg/L 6-BA+O. lmg/L NAA+30g/L蔗糖+6. 2g/L瓊脂，pH =5. 8的培養(yǎng)基，用于栽培資源分化與保存。
[0013] 本發(fā)明所述的一種穩(wěn)定高效的草莓種質(zhì)資源離體保存及恢復(fù)生長的方法，其特征 在于：所述的培養(yǎng)基③是指l/2MS+30g/L蔗糖+6. 2g/L瓊脂，pH = 5. 8的培養(yǎng)基，用于野生 資源生根。
[0014] 本發(fā)明所述的一種穩(wěn)定高效的草莓種質(zhì)資源離體保存及恢復(fù)生長的方法，其特征 在于：所述的培養(yǎng)基④是指MS+30g/L蔗糖+6. 2g/L瓊脂，pH = 5. 8的培養(yǎng)基，用于栽培資 源生根。
[0015] 本發(fā)明所述的一種穩(wěn)定高效的草莓種質(zhì)資源離體保存及恢復(fù)生長的方法，其特征 在于：所述的組織培養(yǎng)袋是指一種專門用于組織培養(yǎng)專用袋，可以耐高溫滅菌和低溫存放， 一袋可以分為5個(gè)小格。
[0016] 本發(fā)明工藝流程簡單，與本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)知識(shí)和常用手段具有如下優(yōu)點(diǎn)和效 果：
[0017] 本發(fā)明所述的培養(yǎng)基①②不添加植物生長抑制劑，通過低溫弱光降低遺傳變異的 安全風(fēng)險(xiǎn)。
[0018] 本發(fā)明所述（2)提及組織培養(yǎng)袋是一種專門用于組織培養(yǎng)專用袋（見附圖），可以 耐高溫滅菌一袋可以分為5個(gè)小格，可節(jié)省存放空間，降低污染率，有效提高資源保存安全 風(fēng)險(xiǎn)。
[0019] 本發(fā)明所提供的方法用于草莓離體保存，試管苗保存24個(gè)月后存活率仍為 100%，且植株生長正常，與常溫條件保存3-4個(gè)月相比，大大延長了繼代周期。因此該方法 不但防止多次繼代后造成的種性退化及交叉污染引發(fā)遺傳變異的安全風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)減少繁重 的繼代工作，降低不必要的人力、物力，財(cái)力資源的浪費(fèi)。
[0020] 本發(fā)明所提供用于草莓離體保存的方法，不受植物生長季節(jié)的限制，可隨時(shí)提供 種質(zhì)資源交流，攜帶方便，便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0021] 圖1是組織培養(yǎng)袋示意圖；
【具體實(shí)施方式】
[0022] 實(shí)施例1
[0023] (1)無菌苗的獲得：2011年11月從國家果樹種質(zhì)南京草莓資源圃江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué) 院園藝研究所內(nèi)選用野生資源80份，栽培資源40份（具體材料見下表，編號(hào)栽培資源1-40 號(hào)，野生資源41-120號(hào)）每份資源重復(fù)保存8份，從植株上剪取新長出來的匍匐莖莖尖經(jīng) 流水沖洗I. 5-2h，在無菌操凈工作臺(tái)上，先用75%醫(yī)用酒精消毒30s，然后再用0. 1 %升汞 水消毒8min，最后無菌水沖洗3-4次后剝?nèi)ネ鈱影?，將莖尖接種在培養(yǎng)基①或②上，置于 25±2°C、光照強(qiáng)度約24001x、每天光照時(shí)間14-16h的培養(yǎng)室中進(jìn)行初代培養(yǎng)，約25天獲得 無菌苗。
[0024] (2)生長培養(yǎng)：取上述無菌苗，切取帶1至2葉的莖尖接種在裝有培養(yǎng)基①或②的 組織培養(yǎng)袋中，置于上述相同條件下培養(yǎng)14天后，長成具根（1-2_)和3-4片葉的試管苗。 (野生資源①，栽培資源②）
[0025] (3)抑制生長：生長培養(yǎng)結(jié)束后，置于22°C，光照強(qiáng)度約24001x，縮短光照至8h的 培養(yǎng)室中培養(yǎng)10天。
[0026] (4)低溫保存：抑制生長結(jié)束后，置于4°C冰箱中弱光（光照強(qiáng)度約4001x)保存。
[0027] (5)檢查恢復(fù)培養(yǎng)：每隔3個(gè)月，對保存的120份材料進(jìn)行檢查并拿出一份資源置 于（3)抑制生長條件下恢復(fù)生長5天，然后轉(zhuǎn)接③或④上置于（2)生長培養(yǎng)條件下生根25 天，煉苗移栽，植株均表現(xiàn)正常。
[0028]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種穩(wěn)定高效的草莓種質(zhì)資源離體保存及恢復(fù)生長的方法，其特征在于，具體方法 包括（1)無菌苗的獲得（2)生長培養(yǎng)（3)抑制生長（4)低溫保存（5)檢查恢復(fù)培養(yǎng)（6)生 根移栽等。其步驟如下： (1) 無菌苗的獲得：是從植株上剪取新長出來的匍匐莖莖尖經(jīng)流水沖洗I. 5-2h，在無 菌操凈工作臺(tái)上，先用75%醫(yī)用酒精消毒30s，然后再用0. 1%升汞水消毒8min，最后無菌 水沖洗3-4次后剝?nèi)ネ鈱影瑢⑶o尖接種在培養(yǎng)基①或②上，置于25±2°C、光照強(qiáng)度約 24001x、每天光照時(shí)間14-16h的培養(yǎng)室中進(jìn)行初代培養(yǎng)，約25天獲得無菌苗。 (2) 生長培養(yǎng)：取上述無菌苗，切取帶1至2葉的莖尖接種在裝有培養(yǎng)基①或②的組織 培養(yǎng)袋中，后將培養(yǎng)袋置于上述相同條件下培養(yǎng)14天，促進(jìn)莖尖生長。 (3) 抑制生長：生長培養(yǎng)結(jié)束后，置于22°C，光照強(qiáng)度約24001x，縮短光照至8h的培養(yǎng) 室中培養(yǎng)10天。 (4) 低溫保存：抑制生長結(jié)束后，置于4°C冰箱中弱光（光照強(qiáng)度約4001x)保存。 (5) 檢查恢復(fù)培養(yǎng)：每隔6個(gè)月，對保存的材料進(jìn)行檢查，對生長不好的進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。 (6) 生根移栽：將上述保存達(dá)22-24個(gè)月的材料置于（3)抑制生長條件下培養(yǎng)5天，然 后轉(zhuǎn)接③或④上置于（1)生長培養(yǎng)條件下生根培養(yǎng)25天，煉苗移栽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種穩(wěn)定高效的草莓種質(zhì)資源離體保存及恢復(fù)生長的方法， 其特征在于：所述的培養(yǎng)基①是指1/2MS+0. 5mg/L6-BA+0.lmg/LNAA+30g/L蔗糖+6. 2g/L 瓊脂，pH= 5. 8的培養(yǎng)基，用于野生資源的分化與保存。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種穩(wěn)定高效的草莓種質(zhì)資源離體保存及恢復(fù)生長的方法， 其特征在于：所述的培養(yǎng)基②是指MS+0. 5mg/L6-BA+0.lmg/LNAA+30g/L蔗糖+6. 2g/L瓊 月旨，pH= 5. 8的培養(yǎng)基，用于栽培資源分化與保存。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種穩(wěn)定高效的草莓種質(zhì)資源離體保存及恢復(fù)生長的方法， 其特征在于：所述的培養(yǎng)基③是指l/2MS+30g/L蔗糖+6. 2g/L瓊脂，pH= 5. 8的培養(yǎng)基，用 于野生資源生根。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種穩(wěn)定高效的草莓種質(zhì)資源離體保存及恢復(fù)生長的方法， 其特征在于：所述的培養(yǎng)基④是指MS+30g/L蔗糖+6. 2g/L瓊脂，pH= 5. 8的培養(yǎng)基，用于 栽培資源生根。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種穩(wěn)定高效的草莓種質(zhì)資源離體保存及恢復(fù)生長的方法， 其特征在于：所述的組織培養(yǎng)袋是指一種專門用于組織培養(yǎng)專用袋，可以耐高溫滅菌和低 溫存放，一袋可以分為5個(gè)小格。
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物組織快繁和種質(zhì)資源保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種穩(wěn)定高效的草莓種質(zhì)資源離體保存及恢復(fù)生長的方法。具體方法包括(1)無菌苗的獲得(2)生長培養(yǎng)(3)抑制生長(4)低溫保存(5)檢查恢復(fù)培養(yǎng)(6)生根移栽等步驟。本發(fā)明針對草莓種質(zhì)資源離體保存存在的問題，不添加植物生長抑制劑通過改進(jìn)了存放條件和保存容器，使繼代培養(yǎng)周期達(dá)22-24個(gè)月，比已報(bào)道保存條件延長4-20個(gè)月，同時(shí)有效地提高種質(zhì)資源保存的安全性。該方法操作簡便，重復(fù)性強(qiáng)，技術(shù)穩(wěn)定，適合大規(guī)模草莓種質(zhì)資源的保存，便于國內(nèi)外種質(zhì)資源的交換，避免資源在運(yùn)輸過程中發(fā)生病蟲害傳播甚至死苗，同時(shí)還可解決保存占地面積大、費(fèi)用高等問題。
【IPC分類】A01H4-00
【公開號(hào)】CN104782482
【申請?zhí)枴緾N201410424013
【發(fā)明人】于紅梅, 王靜, 趙密珍, 袁華招, 錢亞明
【申請人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2014年8月25日