一種甘藍(lán)子葉培養(yǎng)高頻分化體系建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說(shuō)，涉及一種甘藍(lán)子葉培養(yǎng)高頻分化體系建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]甘藍(lán)、Brassica oleracea L.)又稱結(jié)球甘藍(lán)、包心菜、洋白菜、圓白菜、茴子白、椰菜等，是十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種形成葉球的一個(gè)變種，二年生草本植物。甘藍(lán)具有重要營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)用作用，其中甘藍(lán)的維生素C含量在蔬菜
中位居前列。結(jié)球甘藍(lán)味甘，性平，歸脾，胃經(jīng)；能醫(yī)脾和胃，緩急止痛；能防治胃、十二指腸潰瘍?。荒茉鰪?qiáng)人體內(nèi)苯并芘與甲基蒽對(duì)致癌物質(zhì)的抵抗力。甘藍(lán)類蔬菜在世界各地普遍種植，尤其在歐美栽培較多。由于其具有適應(yīng)性廣、耐寒和耐熱性較強(qiáng)、病害少、產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)豐富、耐貯運(yùn)等特點(diǎn)，在我國(guó)各地普遍種植。
[0003]植物組織培養(yǎng)技術(shù)是獲得整齊一致材料的快捷途徑，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)甘藍(lán)離體培養(yǎng)的研宄己經(jīng)有了一定的基礎(chǔ)，但至今未能應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。本發(fā)明以甘藍(lán)種子為外植體，通過(guò)外植體消毒、愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽誘導(dǎo)、增殖、生根誘導(dǎo)等過(guò)程建立了甘藍(lán)子葉培養(yǎng)高頻分化體系，為甘藍(lán)的工廠化生產(chǎn)和推廣應(yīng)用提供了技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明以甘藍(lán)種子為外植體，通過(guò)外植體消毒、愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽誘導(dǎo)、增殖、生根誘導(dǎo)等過(guò)程建立了甘藍(lán)子葉培養(yǎng)高頻分化體系，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0005]本發(fā)明的一種甘藍(lán)子葉培養(yǎng)高頻分化體系建立方法，包括以下的步驟:
(I)無(wú)菌苗的制取:選擇甘藍(lán)種子先用洗衣粉水浸泡10?30min，再用自來(lái)水漂洗干凈，然后置于超凈臺(tái)上，用75%酒精消毒30?60s,再用0.1 %升未溶液消毒10?30min，無(wú)菌水沖洗4?6遍后消毒濾紙吸干水分后置于MS培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽培養(yǎng)，溫度為25°C，3天統(tǒng)計(jì)污染率，7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率和污染率。
[0006](2)愈傷組織誘導(dǎo):將步驟(I)培養(yǎng)獲得的5?7天苗齡的無(wú)菌苗，切取帶I?2mm子葉柄的子葉接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。接種后先黑暗條件下培養(yǎng)，待出現(xiàn)愈傷組織后再移至置于每天光照12?14小時(shí)，光照強(qiáng)度為1000?20001χ，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。
[0007](3)叢生芽誘導(dǎo):將步驟(2)誘導(dǎo)得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接至芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。接種后置于每天光照12?14小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?30001χ，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)分化情況。
[0008](4)增殖培養(yǎng):將步驟(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的叢生芽從基部切下并轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代。接種后置于每天光照12?14小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?30001χ，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)增殖情況。
[0009](5)生根培養(yǎng):將經(jīng)步驟(4)分化培養(yǎng)得到的無(wú)根試管苗轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根。接種后置于每天光照12?14小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?30001χ，置于培養(yǎng)溫度為25?28°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)生根情況。
[0010](6)煉苗移栽:試管苗生根20天后，具備發(fā)達(dá)健壯的根時(shí)將組培苗不揭瓶蓋在自然光下煉苗7天。移栽時(shí)用鑷子從瓶中取出組培苗，小心洗凈基部殘留的培養(yǎng)基，選擇健壯苗移栽到消過(guò)毒的輕基質(zhì)中，澆足水，遮蔭處理。移栽后經(jīng)常噴水，保持空氣濕度。植株成活后轉(zhuǎn)入正常土壤中定植。
[0011]上述步驟(2)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+3.0?6.0mg/L 6-BA+ 0.1?1.0mg/LNAA+25 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0012]上述步驟(3 )所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+1.0?3.0mg/L6_BA+0.1?0.3mg/LNAA+25 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
上述步驟(4)所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+0.1?0.5mg/LNAA+3.0?6.0mg/L6-BA+20?30g/L 鹿糖 +3.5 ?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
上述步驟(5)所述的生根培養(yǎng)基為:1/2MS+1.0?3.0mg/LIBA+20?30g/L蔗糖+3.5?6.0g/L 瓊脂，pH 為 5.4 ?5.8。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:本發(fā)明以甘藍(lán)種子為外植體，通過(guò)外植體消毒、愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽誘導(dǎo)、增殖、生根誘導(dǎo)等過(guò)程建立了甘藍(lán)子葉培養(yǎng)高頻分化體系，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
【具體實(shí)施方式】
[0014]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0015]實(shí)施例1
(I)無(wú)菌苗的制取:選擇甘藍(lán)種子先用洗衣粉水浸泡lOmin，再用自來(lái)水漂洗干凈，然后置于超凈臺(tái)上，用75%酒精消毒30s，再用0.1 %升汞溶液消毒15min，無(wú)菌水沖洗4遍后消毒濾紙吸干水分后置于MS培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽培養(yǎng)，溫度為25°C，3天污染率低至5%，7天發(fā)芽率達(dá)到100%。
[0016](2)愈傷組織誘導(dǎo):將步驟(I)培養(yǎng)獲得的5?7天苗齡的無(wú)菌苗，切取帶I?2mm子葉柄的子葉接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。接種后先黑暗條件下培養(yǎng)，待出現(xiàn)愈傷組織后再移至置于每天光照13小時(shí)，光照強(qiáng)度為ΙΟΟΟΙχ，置于培養(yǎng)溫度為250C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后誘導(dǎo)率達(dá)至84.8%。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+3.5mg/L 6-BA+ 0.6mg/L NAA+28g/L 蔗糖 +3.8g/L 瓊脂，pH 為 5.6。
[0017](3)叢生芽誘導(dǎo):將步驟(2)誘導(dǎo)得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接至芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。接種后置于每天光照13小時(shí)，光照強(qiáng)度為25001χ，置于培養(yǎng)溫度為25°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后分化率達(dá)到96.4%。所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+1.8mg/L6-BA+0.lmg/LNAA+28g/L 蔗糖 +5.5g/L 瓊脂，pH 為 5.6。
(4)增殖培養(yǎng):將步驟(3)誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的叢生芽從基部切下并轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代。接種后置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為20001χ，置于培養(yǎng)溫度為25°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后增殖系數(shù)為7.9。所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+0.2mg/LNAA+3.5mg/L6-BA+25g/L 蔗糖 +3.8g/L 瓊脂，pH 為 5.6。
[0018](5)生根培養(yǎng):將經(jīng)步驟(4)分化培養(yǎng)得到的無(wú)根試管苗轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根。接種后置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為25001x，置于培養(yǎng)溫度為25°C，空氣相對(duì)濕度為75%的條件下培養(yǎng)30天后生根率達(dá)95%以上。所述的生根培養(yǎng)基為:1/2MS+1.5mg/LIBA+25g/L 蔗糖 +3.5g/L 瓊脂，pH 為 5.6。
[0019](6)煉苗移栽:試管苗生根20天后，具備發(fā)達(dá)健壯的根時(shí)將組培苗不揭瓶蓋在自然光下煉苗7天。移栽時(shí)用鑷子從