木通種苗的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物細胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用植物組織培養(yǎng)方式綜合處理進行木通培養(yǎng)快繁以獲得大量種苗的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]木通(Akebiaquinata (Houtt.) Decne.)為木通科(Lardizabalaceae)木通屬(Akebia)落葉木質(zhì)藤本植物。產(chǎn)于長江流域各省區(qū)。生于海拔300-1500米的山地灌木叢、林緣和溝谷中。日本和朝鮮有分布。其莖、根和果實藥用，具有利尿、通乳、消炎，治風濕關(guān)節(jié)炎和腰痛的功效。木通為藤本纏繞性植物，花期4-5月，花朵生于縮短的側(cè)枝上，花略芳香，具有很高的觀賞價值。其果期為6-8月，果實長5-8厘米，直徑3-4厘米，成熟時果皮紫色，內(nèi)部具有白色、多汁的果肉，果味甜可食，種子可榨油，并可制作肥皂，具有很高的經(jīng)濟價值。
[0003]由于生態(tài)環(huán)境的破壞和掠奪式的采摘挖掘，木通的資源日趨縮小，嚴重影響了其有序的開發(fā)利用，因此需要對其進行種苗繁殖技術(shù)的開發(fā)。
[0004]利用植物組織培養(yǎng)的方式進行木通種苗的培養(yǎng)快繁是一種較好的規(guī)?；@得木通種苗的方法，且該方法未見報道和公開應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種生長周期短、移栽存活率高、成本低、操作簡單的木通種苗的培養(yǎng)方法。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:培養(yǎng)步驟依次包括預處理、無菌外植體獲得、幼芽組織培育、愈傷誘導增殖、胚狀體誘導增殖、生根培養(yǎng)及移栽；具體包括以下步驟:
(1)預處理:不同的外植體的類型采用不同的浸泡預處理及冷藏預處理；
(2)無菌外植體獲得:不同的外植體的類型采用不同消毒滅菌方式獲得無菌外植體用于下一步培養(yǎng)；
(3)幼芽組織培育:將步驟(2)中獲得的無菌外植體接種至液體淺層幼芽組織培育培養(yǎng)基中進行幼芽的誘導；
(4)愈傷誘導增殖:將步驟(3)中獲得的幼芽接種至液體淺層愈傷誘導培養(yǎng)基上進行愈傷組織的誘導培養(yǎng)得到狀態(tài)良好的愈傷組織；
(5)胚狀體誘導增殖:將步驟(4)中獲得的良好的愈傷組織接種到固液雙層胚狀體培養(yǎng)基上進行胚狀體增殖培養(yǎng)；
(6)生根培養(yǎng)及移栽:將步驟(5)中獲得的胚狀體浸泡處理后接種到固體生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，然后將得到的生根苗煉苗后栽培到基質(zhì)中進行生長得到木通種苗。
[0007]采用上述技術(shù)方案，通過大量實驗證實，該木通種苗的培養(yǎng)方法能夠?qū)崿F(xiàn)增殖率高，生物產(chǎn)量大，培養(yǎng)周期短；組培苗質(zhì)量好，種苗健壯，栽培成活率高。
[0008]作為本發(fā)明進一步的改進在于，所述的步驟(I)中的所述外植體為枝條或種子。本發(fā)明使用的外植體是枝條或種子，通過多種外植體實現(xiàn)對木通種苗的培養(yǎng)，既方便外植體的獲得，又節(jié)省了材料避免了浪費。
[0009]作為本發(fā)明進一步的改進在于，所述的步驟(I)中，當所選外植體為枝條時，所述預處理的方法是:將所述外植體離體后立即置于添加l~5g/L PVP+l~3g/L Vc的水溶液中進行浸泡處理3~5h，后置于2~8°C條件下保濕冷藏5~10 d ;當所選外植體為種子時，所述預處理的方法是:將所述外植體清洗干凈后浸泡到0.1-0.5%濃度的高錳酸鉀水溶液中浸泡
0.5~2h后，噴灑少量0.5-0.2%濃度的多菌靈后于2~8°C保濕冷藏處理30~60d。不同的外植體采用不同的方法進行預處理，所采用的預處理方法更適合各個外植體的后續(xù)培養(yǎng)。該預處理過程有利于后續(xù)的培養(yǎng)，縮短培養(yǎng)周期。
[0010]作為本發(fā)明進一步的改進在于，所述的步驟(2)中，當所選外植體為枝條時，滅菌處理的方式為:將預處理完后的外植體采用75%酒精消毒20~40s后采用升汞滅菌5~10min，然后無菌水沖洗備用；當所選外植體為種子時，滅菌處理的方式為:將預處理完后的外植體采用75%酒精消毒l~2min后采用升未滅菌10~20min，然后無菌水沖洗，剝離出胚備用。無菌的處理對后續(xù)的培養(yǎng)過程是非常關(guān)鍵的，直接影響后續(xù)培養(yǎng)的誘導率、增殖率以及生根率，通過大量實驗驗證，該滅菌方法對后續(xù)的培養(yǎng)最好。
[0011]作為本發(fā)明進一步的改進在于，所述的步驟(3)中所述幼芽組織培育的培養(yǎng)基配方為 WPM 或 Ms+0.5-4.0mg/L GA3+0.1-1.5g/L PVP+30 g/L 蔗糖，ρΗ5.6-6.0 ;培養(yǎng)條件為:光照4~6h/d，溫度25± 1°C ;所述液體淺層厚度為0.5~3cmo可以有利于后續(xù)的培養(yǎng)，使外植體更容易生根。
[0012]作為本發(fā)明進一步的改進在于，所述的步驟(4)中所述愈傷誘導增殖的培養(yǎng)基的配方為 WPM 或 Ms+1.0-4.0mg/L 2，4-D+0.05-0.5mg/L ΝΑΑ+0.1-1.5g/L PVP+30 g/L 蔗糖，pH5.6-6.0 ;培養(yǎng)條件為:光照0 h/d，溫度25± 1°C ;所述液體淺層厚度為0.5~3cm。愈傷組織的誘導培養(yǎng)基的組成直接關(guān)系到愈傷組織的誘導率以及愈傷組織的質(zhì)量高低，為了提高木通外植體的愈傷組織的誘導率，本發(fā)明對木通外植體的愈傷組織的誘導培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，通過大量的篩選試驗最終確定，采用上述的愈傷組織誘導培養(yǎng)基進行木通外植體的愈傷組織誘導培養(yǎng)，愈傷組織的誘導效果最好。
[0013]作為本發(fā)明進一步的改進在于，所述的步驟(5)中所述固液雙層胚狀體培養(yǎng)基中的液體培養(yǎng)基的配方為 WPM 或 Ms+Ο.2~2.0 mg/L TDZ+0.02-0.5mg/L NAA+1.0mg/LΚΤ+0.1-1.5g/L PVP +30 g/L蔗糖，ρΗ5.6-6.0，厚度為0.2~lcm ;所述固液雙層胚狀體培養(yǎng)基的下層添加6.5g/L瓊脂的固體培養(yǎng)基，從而形成固液雙層培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件為:光照強度1500-2000 lux，光照10~15 h/d，溫度25± 1°C。胚狀體通過大量的篩選試驗證實，采用固液雙層胚狀體固液雙層胚狀體培養(yǎng)基可以明顯提高胚狀體的增殖率且減少其褐化率。
[0014]作為本發(fā)明進一步的改進在于，所述的步驟(6)中生根培養(yǎng)及移栽中，首先將胚狀體放入到添加l~5g/L PVP+l~3g/L Vc的水溶液中浸泡l~2h，后接種到固體生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，所述生根培養(yǎng)基的配方為l/2Ms+1.0~2.0 mg/L ΙΒΑ+0.01-0.1 mg/LNAA+40 g/L蔗糖，pH5.6~6.0 ;培養(yǎng)條件為:光照強度1500-2000 lux，光照10~15 h/d，溫度25±1°C。
[0015]作為本發(fā)明進一步的改進在于，所述的步驟(6)中獲得的生根苗煉苗后栽種到泥:珍珠巖=2~5:1的基質(zhì)中，保持適度遮陰和70°/『80%的濕度進行栽培即培養(yǎng)條件為:光照強度1500-2000 lux，光照10~15 h/d，溫度20± 1°C，從而得到木通種苗。
[0016]采用本發(fā)明生產(chǎn)木通種苗的技術(shù)方案，其產(chǎn)生的有益效果是:(I)增殖率高，生物產(chǎn)量大，培養(yǎng)周期短；(2)組培苗質(zhì)量好，種苗健壯，栽培成活率高；本發(fā)明利用通過預處理、無菌外植體獲得、幼芽組織誘導、愈傷誘導增殖、胚狀體增殖和生根培養(yǎng)及移栽的方法對木通種苗進行培育相對于其它培養(yǎng)方式具有擴繁效率高、培養(yǎng)時間短、轉(zhuǎn)接方便；種苗健壯、栽培成活率高及成本低，適合木通種苗規(guī)?；嘤a(chǎn)。
【具體實施方式】
[0017]實施例1
一種以枝條為外植體利用植物組織培養(yǎng)方式綜合處理進行木通培養(yǎng)快繁以獲得大量種苗的方法具體步驟如下:
(1)預處理:預處理方法為將莖段離體后立即置于添加4g/L PVP+1.5g/L Vc的水溶液中進行浸泡處理4h，后置于4°C條件下保濕冷藏9 d ;
(2)無菌外植體獲得:預處理完畢的葉片利用75%酒精消毒30s后升汞滅菌10min，然后無菌水沖洗備用；
(3)幼芽組織培育:將步驟(2)中獲得的無菌外植體接種至液體淺層幼芽組織培育的培養(yǎng)基中進行幼芽的誘導；幼芽組織培育的培養(yǎng)基配方為Ms+0.5mg/L GA3+0.1 g/L PVP+30g/L蔗糖，pH5.6 ;培養(yǎng)條件為:光照4h/d，溫度25±1°C ;所述液體淺層厚度為0.5cm。
[0018](4)愈傷誘導增殖:將步驟(3)中得到的無菌幼芽接種至液體淺層愈傷組織誘導培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導培養(yǎng)；處理方法為:將得到的無菌外植體切割至長度為Icm后接種