快速誘導(dǎo)繁殖鹽生草幼根愈傷組織的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物愈傷組織誘導(dǎo)及培養(yǎng)的方法，尤其是一種鹽生草幼根愈傷組織快速誘導(dǎo)及增殖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]愈傷組織的培養(yǎng)是植物組織培養(yǎng)過程中的一個重要階段，愈傷組織是幼嫩的薄壁細胞，具有潛在的分化能力，可以進一步分化形成完整植株，通過愈傷的培養(yǎng)也可獲得不同性質(zhì)的愈傷組織，可為原生質(zhì)體的分離，融合或遺傳轉(zhuǎn)化提供優(yōu)質(zhì)材料。鹽生草(halogetonglomeratus)為藜科鹽生草屬一年生草本稀鹽鹽生植物，分布于甘肅西部、青海、新疆及西藏；蒙古、蘇聯(lián)、西伯利亞和中亞地區(qū)亦有，生長于山腳，戈壁灘，適合在沙漠中生長生存。鹽生草是通過根系從周圍環(huán)境吸收水分、高鹽堿以及營養(yǎng)物質(zhì)等供其生長利用，目前對鹽生草根系的相關(guān)報道還比較少。當前急需一種以鹽生草的幼根為外植體誘導(dǎo)愈傷并使其增殖的方法，通過人工控制環(huán)境條件來產(chǎn)生大量的愈傷組織，并進一步培養(yǎng)使其增殖，為鹽生草根系耐鹽性的研宄提供技術(shù)支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種快速誘導(dǎo)繁殖鹽生草幼根愈傷組織的方法，該方法簡單易行，能夠高效快速的獲得大量鹽生草幼根愈傷組織。
[0004]以無菌培養(yǎng)獲得的鹽生草幼根為外植體，誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生，然后繼代培養(yǎng)，使其增殖。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:一種快速誘導(dǎo)繁殖鹽生草幼根愈傷組織的方法，其主要特點在于步驟如下:
[0006](I)無菌外植體的獲得:將鹽生草種子置于超凈工作臺，首先用無菌水清洗種子，然后用75%的酒精處理0.5-lmin，緊接著用無菌水將種子表面的酒精清洗干凈，再用20%的次氯酸鈉處理1.5-2min,最后用無菌水將種子表面的次氯酸鈉清洗干凈，獲得鹽生草無菌種子，將滅菌后的種子放置于培養(yǎng)無菌實生苗的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-15d，獲得無菌實生苗的根系作為誘導(dǎo)愈傷的外植體；
[0007](2)愈傷組織誘導(dǎo):將步驟(I)獲得的無菌實生苗幼根組織橫切為約0.3-0.5cm長的小段作為誘導(dǎo)愈傷的材料，接種于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)10-15d，誘導(dǎo)愈傷發(fā)生；
[0008](3)愈傷組織增殖培養(yǎng):將步驟(2)獲得的顏色淺白，質(zhì)地疏松的愈傷組織切割成直徑約0.1-0.3cm的小塊，然后轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)愈傷組織增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10-15d后繼續(xù)轉(zhuǎn)接到新的誘導(dǎo)愈傷組織增殖培養(yǎng)基中進行繼代增殖，最終獲得顏色嫩白，結(jié)構(gòu)致密的優(yōu)良愈傷組織材料。
[0009]所述的一種快速誘導(dǎo)繁殖鹽生草幼根愈傷組織的方法，步驟(I)中所述的培養(yǎng)無菌實生苗的培養(yǎng)基由l/2Hoagland-Hoagland完全營養(yǎng)液，6_8g/L的瓊脂粉組成，PH =5.7~5.8ο
[0010]所述的一種快速誘導(dǎo)繁殖鹽生草幼根愈傷組織的方法，步驟(2)中所述的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基由1/2MS-MS營養(yǎng)液，1.0-2.0mg/L 2，4- 二氯苯氧乙酸，5_7g/L瓊脂，20_30g/L 蔗糖，0.05-0.1g 肌醇組成，PH = 5.7-5.8ο
[0011]所述的一種快速誘導(dǎo)繁殖鹽生草幼根愈傷組織的方法，步驟(3)中所述的誘導(dǎo)愈傷組織增殖培養(yǎng)基由1/2MS-MS營養(yǎng)液，1.0-2.0mg/L 2，4- 二氯苯氧乙酸，5_7g/L瓊脂，20-30g/L 蔗糖，0.05-0.1g 肌醇組成，PH = 5.7-5.8。
[0012]所述的一種快速誘導(dǎo)繁殖鹽生草幼根愈傷組織的方法，所述的步驟(1)、(2)、(3)實生苗培養(yǎng)、幼根愈傷誘導(dǎo)和愈傷增殖均在連續(xù)光照培養(yǎng)，光照強度在1500-20001x之間，濕度60-70%的環(huán)境下進行。
[0013]所述的一種快速誘導(dǎo)繁殖鹽生草幼根愈傷組織的方法，步驟(I)中培養(yǎng)10-15d的幼苗根部幼嫩，且具備主根，側(cè)根與根毛。
[0014]所述的一種快速誘導(dǎo)繁殖鹽生草幼根愈傷組織的方法，所述產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)嫩，并且可通過稱量法測定愈傷組織的生長量。
[0015]本發(fā)明的有益效果如下:
[0016]1.以鹽生草培養(yǎng)10-15d的無菌實生苗根部為取材對象，保證了材料的無菌，杜絕了由材料帶菌或滅菌不徹底造成的組培污染。
[0017]2.鹽生草培養(yǎng)10-15d的無菌實生苗根部幼嫩，且具備主根側(cè)根與根毛，為根系的系統(tǒng)性研宄奠定基礎(chǔ)。
[0018]3.以無菌實生苗幼根組織為誘導(dǎo)愈傷的材料，能夠高效地誘導(dǎo)愈傷組織的生成。
[0019]4.愈傷的誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)所產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)嫩，并且也可以通過稱量法測定愈傷組織的生長量，同時能有效解決根部木質(zhì)化的問題。
[0020]5.愈傷的誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)所用培養(yǎng)基均以2，4-D(2, 4_ 二氯苯氧乙酸)為外源激素，實生苗培養(yǎng)、幼根愈傷誘導(dǎo)和愈傷增殖均在同一環(huán)境下進行，效果良好。實現(xiàn)了簡單、易行、高效獲得鹽生草幼根愈傷組織的目標。
【附圖說明】
:
[0021]圖1.本發(fā)明所用的無菌實生苗；
[0022]圖2.本發(fā)明所剪切的鹽生草實生苗根部組織；
[0023]圖3.本發(fā)明根部組織培養(yǎng)15d后所得鹽生草幼根愈傷組織；
[0024]圖4.本發(fā)明鹽生草幼根愈傷組織繼代繁殖后的愈傷組織。
【具體實施方式】
[0025]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下面對本發(fā)明的內(nèi)容進行詳細的說明。
[0026]實施例1:一種快速誘導(dǎo)及繁殖鹽生草幼根愈傷組織的方法，將鹽生草種子置于超凈工作臺，首先用無菌水清洗種子，然后用75%的酒精處理0.5-lmin，緊接著用無菌水將種子表面的酒精清洗干凈，再用20%的次氯酸鈉處理1.5-2min,最后用無菌水將種子表面的次氯酸鈉清洗干凈，獲得鹽生草無菌種子，將滅菌后的種子放置于培養(yǎng)無菌實生苗的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-15d，獲得無菌實生苗的根系作為誘導(dǎo)愈傷的外植體，培養(yǎng)基主要由l/2Hoagland營養(yǎng)液+8g/L的瓊脂粉組成，PH =5.8 ;將無菌實生苗幼根橫切為約0.5cm的小段作為誘導(dǎo)愈傷的材料，接種于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)15d，誘導(dǎo)愈傷的發(fā)生，將獲得的顏色嫩白，質(zhì)地疏松的愈傷組織切割成小塊，然后轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)15d后繼續(xù)轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基繼代增殖。誘導(dǎo)愈傷組織及繼代繁殖所用培養(yǎng)基主要由1/2MS營養(yǎng)液+2.0mg/L 2，4-D(2, 4-二氯苯氧乙酸)+7g/L瓊脂+30g/L蔗糖+0.lg/L肌醇組成，PH = 5.8，愈傷誘導(dǎo)和愈傷繁殖均為連續(xù)光照培養(yǎng)，光照強度在1500-20001x之間，濕度70%的環(huán)境下進行。
[0027]結(jié)果:誘導(dǎo)愈傷率100%，誘導(dǎo)愈傷嫩白色，無褐變；在繼代增殖過程中，愈傷組織生長迅速，最終愈傷組織呈現(xiàn)白色。
[0028]實施例2: —種快速誘導(dǎo)及繁殖鹽生草幼根愈傷組織的方法，將鹽生草種子置于超凈工作臺，首先用無菌水清洗種子，然后用75%的酒精處理0.5-lmin，緊接著用無菌水將種子表面的酒精清洗干凈，再用20%的次氯酸鈉處理1.5-2min,最后用無菌水將種子表面的次氯酸鈉清洗干凈，獲得鹽生草無菌種子，將滅菌后的種子放置于培養(yǎng)無菌實生苗的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-15d，獲得無菌實生苗的根系作為誘導(dǎo)愈傷的外植體，培養(yǎng)基主要由Hoagland營養(yǎng)液，6g/L的瓊脂粉組成，PH = 5.7 ;將無菌實生苗幼根橫切為約0.5cm的小段作為誘導(dǎo)愈傷的材料，接種于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)10d，誘導(dǎo)愈傷的發(fā)生；將獲得的顏色嫩白，質(zhì)地疏松的愈傷組織切割成小塊，然后轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)1d后繼續(xù)轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基繼代增殖。誘導(dǎo)愈傷組織及繼代繁殖所用培養(yǎng)基主要由MS營養(yǎng)液+1.0mg/L2，4-D(2, 4- 二氯苯氧乙酸)+7g/L瓊脂+20g/L蔗糖+0.lg/L肌醇組成，PH = 5.8，愈傷誘導(dǎo)和愈傷繁殖均為連續(xù)光照培養(yǎng)，光照強度在1500-20001x之間，濕度60%的環(huán)境下進行。
[0029]結(jié)果:誘導(dǎo)愈傷率100%，誘導(dǎo)愈傷嫩白色，無褐變；在繼代增殖過程中，愈傷組織生長迅速，最終愈傷組織呈現(xiàn)白色。
[0030]實施例3:
[0031]一種快速誘導(dǎo)及繁殖鹽生草幼根愈傷組織的方法，將鹽生草種子置于超凈工作臺，首先用無菌水清洗種子，然后用75 %的酒精處理0.5-lmin,緊接著用無菌水將種子表面的酒精清洗干凈，再用20%的次氯酸鈉處理1.5-2min,最后用無菌水將種子表面的次氯酸鈉清洗干凈，獲得鹽生草無菌種子，將滅菌后的種子放置于培養(yǎng)無菌實生苗的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-15d，獲得無菌實生苗的根系作為誘導(dǎo)愈傷的外植體，培養(yǎng)基主要由l/2Hoagland營養(yǎng)液+6g/L的瓊脂粉組